4. FUNN
4.1 E NDRINGER I ARBEIDSMETODER
Devido às características peculiares observadas dos ambientes estudados através do sequenciamento do DNA metagenômico, foi proposta a tentativa de isolamento de microrganismos a partir das amostras de solo, porém desconsiderando de qual período (seca ou chuva).
Nos três ambientes estudados foram obtidos 42 isolados bacterianos, com características morfológicas distintas e que foram analisados quanto às características de interesse do ponto de vista agronômico (solubilização de fosfato e produção de acido indolilacético, AIA) e para a produção de enzimas de interesse biotecnológico (celulase, amilase e protease). Os isolados foram identificados no estudo por H, C e N, sendo H para os isolados da área da horta, N para os da área
de solo nativo e C para os isolados a partir do solo que cultiva capim-forrageiro. Os resultados para as análises da produção de amilases, celulases, atividade proteolítica, capacidade de solubilização de fosfato e produção de ácido indol acético (AIA) estão apresentados na Tabela 10. Foram obtidos 42 isolados distribuídos entre as três amostras estudadas, sendo 14 da áreas da horta , 13 da mata nativa e 15 da área onde é cultivado o capim-forrageiro. Dentre todas as análises realizadas observou-se que 17 isolados não apresentaram nenhuma das atividades, por outro lado foi observado que 10 produziram celulases, 17 amilase, 14 possuíam atividade proteolítica, 22 apresentaram capacidade de solubilizar fosfato e 12 produziram ácido indol acético (Tabela 10). Fato interessante é a observação que a maioria dos isolados da área da horta, local onde é aplicado o composto orgânico, apresentam positividade para mais que uma das características estudadas sendo os isolados H2 e H11 positivos para todas as funções estudadas.
Tabela 10. Atividade metabólica e enzimática dos isolados. Isolado* Celulase Amilase Atividade
Proteolítica Solubilização de fosfato ácido indol acético Produção de
H1 - - - + - H2 + + + + + H3 - + + - - H5 + + - + + H6 + + - + - H7 - + + + + H11 + + + + + H12 - + + + + H13 - + + + - H14 + + + - + C1 - + + + + C4 - + + + + C6 - + + + - C7 + + + + - C8 - + - + + C11 + - - + + C13 + - + + - C14 - + - + + C15 - + + + - N2 + + + + - N8 - - - + - N10 + + - + - N11 - - - + - N12 - + - + +
Os Isolados H4, H8, H9, H10, N1, N3, N4, N5, N6, N7, N9, N13, C2, C3, C5, C9, C10 e C12 foram omitidos e não sequenciados por apresentarem os resultados negativos em todos os testes.
Os 24 isolados selecionados com base nos resultados de produção enzimática, solubilização de fosfato e produção de AIA foram submetidos a sequenciamento do gene 16S rRNA para identificação. Os genes 16SrRNAdos isolados foram sequenciados e comparados com os genes depositados no banco de dados do NCBI (Tabela 11). Todas as sequencias apresentaram sequencias grandes (1000 a 1400pb), sendo selecionadas as com maior score (variando de 2454 a 12655), e de 98%a100% de identidade no mínimo (e-value sempre de 0.0), o que sugere com segurança a identidade dos microrganismos estudados quanto ao seus gêneros e/ou espécies, porém tratando-se de isolados diferentes e não idênticos aos sequenciados anteriormente. As sequencias foram posteriormente submetidas ao banco de dados GenBank do NCBI.
As espécies que tiveram no mínimo 98% de identidade foram comparadas com a literatura e com os resultados dos testes bioquímicos conduzidos. Alguns isolados apresentaram diferenças do que foi descrito pela literatura, enquanto outros apresentaram resultados semelhantes ao que já foi descrito. A maioria dos isolados pertence ao gênero Bacillus (17) e os outros isolados se distribuem nos gêneros
Pseudomonas (2), Burkholderia (2), Enterobacter (2) e Dyella (1). Considerando os
estudos metagenômicos realizados observou-se que a grande maioria dos organismos identificados pela técnica molecular pertencia ao gênero Burkholderia, entretanto esse não foi o gênero mais encontrado entre os isolados pelas técnicas microbiológicas. Por outro lado, foram isolados organismos, que não foram detectados pela metagenômica, apesar da diversidade de microrganismos apresentada por esta técnica ser maior. Esses resultados confirmam a necessidade de desenvolvimento de técnicas diferenciadas de isolamento de organismos para estudos ou isolamento da população bacteriana de um ambiente, ou ainda a aplicação de ferramentas moleculares (sequenciamento e clonagem gênica) para a exploração biotecnológica ou estudo ecológico desses organismos.
O conhecido microrganismo Bacillus subtilis, isolados H7 e H12, é uma bactéria Gram-positiva com capacidade de esporular, cuja principal atividade
econômica explorada baseia-se produção de proteases, amilases, lipases, chintinases, xilanases e entre outras enzimas. Nos testes realizados ambos isolados apresentaram atividade proteolítica, bem como capacidade de solubilizar fosfato e degradar amido. Essas características representam uma capacidade extensamente aproveitada na indústria, desde na fabricação de detergentes e na produção de ração. Pode ser usado também na elaboração de vacinas e largamente utilizado como probiótico, principalmente na forma esporulada. No âmbito agropecuário a capacidade de colonizar a rizosfera gera uma interessante relação simbiótica com as plantas, pois seu metabolismo celular pode secretar antibiótico ou antifúngico e promover uma importante defesa preventiva dos vegetais contra infecções, levando ao consequente aumento de produtividade no campo. Além dessas capacidades o
B. subtilis participa diretamente nos ciclos do carbono e nitrogênio, e degradação de
matéria orgânica no fornecimento de nutrientes às plantas. (MORIKAWA, 2006). Tabela 11. Isolados sequenciados e resultados do Blastn Megablast.
Isolado Sequenciado Fragmento Identificação e taxa de identidade* (%)
H1 1351pb Bacillus sp. 98%
H2 1379pb Bacillus sp. 100%
H3 1376pb Bacillus Cereus 99%
H5 1417pb Bacillus sp. 100%
H6 1402pb Bacillus sp. 100%
H7 1370pb Bacillus subtilis 100% / Bacillus sp. 99%
H11 1431pb Bacillus amyloliquefaciens 100% H12 1346pb Bacillussubtilis99% H13 1396pb Bacillussp99% H14 1387pb Bacillusmegaterium100% / Bacillussp99% N2 1385pb Pseudomonasputida99% N8 1301pb Burkolderiasp100% N10 1086pb Pseudomonasputida99% / P. montelli99% N11 1385pb Burkholderiaplantarii99% / B. glumae98% N12 1380pb Dyellamarensis99%
C1 1096pb Bacillus sp99% / B. megaterium99% /B. aryabhattai99%
C4 1463pb Bacillus sp99% / B. megaterium99% B. aryabhattai99%
C6 1323pb Bacilluspumilus99% C7 1397pb Bacilluspumilus99% C8 1446pb Bacillussp99% / B. megaterium99% C11 1410pb Enterobactersp99% E. asburiae99% C13 1328pb Bacilluspumilus99% / Bacillussp98% C14 1462pb Enterobacterasburiae99% C15 1408pb Bacillussp99% / B. aryabhattai98%
O Bacillus amyloliquefaciens sp., isolado H11, é um microrganismo Gram- positivo flagelado, conhecido e explorado comercialmente devido sua capacidade expressiva em produzir fosfatases e em degradar amido através da grande produção da enzima extracelular, α-amilase (PRIEST et al., 1987). A atividade proteolítica também foi observada, principalmente quanto à capacidade de degradar caseína. Já a capacidade de solubilizar fosfato que foi observada e a participação no ciclo do nitrogênio, conforme citada por Priest et al. 1987, demonstra a relação do microrganismo com o ambiente de cultivo, pois este disponibiliza fosfato de fácil absorção pelas raízes, complementando as necessidades nutricionais para hortaliças, que necessitam de altas doses de fósforo. (TORRES, 2009). Tal fato foi verificado pelos teores do nutriente na análise química da amostra de solo da horta.
Dentre os isolados com capacidades patogênicas, porém capazes de gerar benefícios para plantas e animais, o isolado H3, identificado como uma possível cepa da espécie Bacillus cereus, pertence a um grupo conhecido por facilmente contaminar alimentos dos mais diversos tipos, levando a intoxicações severas, agindo como oportunista. Este microrganismo apesar de potencialmente patogênico, quando adicionado a ração animal, leva a um aumento considerável da resistência dos animais contra doenças causadas por outros bacilos. Por isso é utilizado comercialmente como probiótico (TARAS et al., 2005). O B. cereus, possui grande importância agronômica, pois coloniza rizosfera, participando ativamente no controle de fungos e bactérias, através da secreção de antibióticos, eliminando diversos causadores de doenças em plantas. É responsável por nodulação em raízes, sendo comum associar-se ao Bradyrhizobium japonicum (ZHAO, 2011). Capaz de metabolizar carboidratos, proteínas e peptídeos, participa do importante ciclo do nitrogênio devido ao seu complexo enzimático de nitrito e nitrato redutases (MOLS et al., 2007). Os testes realizados demonstraram que além do que já é conhecido, este bacilo foi capaz de secretar proteases e amilases, enzimas uteis nos processos de reciclagem de nutrientes e no melhoramento de rações (QUIGLEY, 2010).
Ainda dentre o gênero Bacilus, foram identificados dois isolados, o H14 e C8, como prováveis estirpes de Bacillus megaterium. Nos testes realizados o isolado H14 apresentou atividade positiva para celulose, amilase, atividade proteolítica e solubilização de fosfato, enquanto o isolado C8 só apresentou atividade enzimática
de amilases, levantando a hipótese de serem cepas diferentes dentro da mesma espécie. Utilizada há décadas na indústria farmacêutica por produzir a enzima penicilina amida se usada na fabricação de penicilina sintética, e de secretar diversas outras amilases usadas na panificação (VARY, 2007), recentemente foi observado uma cepa de B. megaterium apresentou potencial para biorremediação ao degradar fenol, benzeno, xileno e tolueno (VIJAYAN et al., 2014).
Os isolados C1 e C4 foram classificados como bactérias do gênero Bacilus, porém é provável tratar-se de cepas ainda não isoladas, apesar de apresentar valores de identidades similares para Bacillus aryabhattaie B. megaterium. Estudos revelaram que cepas de B. aryabhattai, podem ser benéficas ao crescimento vegetal e que algumas linhagens são capazes de produzir hormônios, suprimir doenças (LEE et al., 2012) e utilizar muitas fontes de carbono para substrato, como amido e proteínas, porém nem sempre são capazes de degradar celulose (SHIVAJI et al., 2009).
Diversos isolados (H1, H2, H5, H6, H13, C15) também foram identificados como pertencentes ao gênero Bacillus, porém o banco de dados não foi capaz de determinar qual a espécie, classificando-os como Bacillus sp., como apresentado na Tabela11. Muitos microrganismos deste gênero possuem características distintas e não estão ainda classificados quanto à espécie. É comum os organismos desse gênero apresentarem benefícios agronômicos e biotecnológicos, quando são colonizadores da rizosfera, por produzirem fito-hormônio, terem capacidade de solubilizar fosfato ou suprimir doenças (LEE et al., 2012). Além disso, por apresentarem capacidade de metabolizar diversas fontes de carbono como amido, celulose e proteínas possuem potencial biotecnológico considerável. Durante a análise da produção de ácido indol acético (AIA), estimulador de crescimento vegetal, foi constatado que vários isolados são capazes de produzi-lo, sendo praticamente metade Bacilus (Tabela 10).
Os isoladosC6, C7 e C13 identificados como possíveis estirpes de Bacillus
pumilus, que segundo Sari et al. (2007) é um microrganismo Gram-positivo, capaz
de esporular, conhecido por sua capacidade antifúngica e antimicrobiana devido as suas comuns relações simbióticas no solo e até ambientes aquáticos. Algumas cepas são utilizadas comercialmente com função de agente controlador
principalmente de doenças nas raízes por induzir resistência contra a doença ''pega- tudo'', comum em gramíneas e cereais, causada pelo fungo Gaeumannomyces
graminis. Quando inoculada em tanques de carcinicultura inibe bactérias virulentas
para o camarão. Algumas linhagens podem ser diferentes, no entanto possuem capacidades enzimáticas parecidas com outros bacilos. Geralmente solubilizam fosfato e degradam matéria orgânica no ambiente e durante o processo de compostagem com a produção de amilases, e celulases e atividade proteolítica ácida ou enzimática, características que foram confirmadas com os resultados obtidos na Tabela 10.
As cepas C14 e C11, foram identificadas como do gênero Enterobacter sp., possivelmente E. cloacae ou E. asburiae. Estas duas espécies são conhecidas bactérias causadoras de diversos tipos de infecções, desde respiratórias, urinárias e cutâneas, atingindo frequentemente animais e humanos. Os resultados mostraram que estes isolados podem solubilizar fosfato e atuar degradando amido e celulose. Apesar de patogênicas, participam no controle de insetos, de algumas doenças vegetais e no ciclo do nitrogênio, pois segundo a literatura, ambas podem reduzir nitrato (DIJK E NELSON, 2000). Por colonizarem frutas e vegetais, este gênero bacteriano pode contaminar animais mantidos pelo zoológico, obrigando-se a manter um controle de qualidade nos alimentos oferecidos, para diminuir a possibilidade de infecção, principalmente de animais que estejam debilitados, pois as Enterobacters são oportunistas e alguns casos apresentam resistência a diversos tipos de agentes antimicrobianos. Este gênero pertence ao grupo dos coliformes termotolerantes, que comumente estão associados a presença de outros tipos de patógenos, como a presença de Taeniasolium e outros parasitas (TAKAYANAGUI, 2007).
O microrganismo Dyella marensis sp., isolado N12, segundo Lee e Lee (2009), é Gram-negativo produtor de amilase e catalase. Nos testes a cepa isolada foi positiva para produção de amilase e solubilização de fosfato que, segundo o autor, promove esta disponibilização com a produção de ácidos. Do ponto de vista agrícola, a Dyella marensis participa no ciclo do nitrogênio, pois algumas espécies são capazes de reduzir nitrato a nitrito.
Espécie de interesse na comunidade científica, a Pseudomonas putida, identificada no isolado N2 e possivelmente o N10, é um microrganismo Gram-
negativo e portador de flagelos para motilidade, é conhecido por habitar ambientes aquáticos e o solo. Nesse ultimo ambiente essas bactérias podem colonizar a rizosfera e estabelecer uma relação simbiótica interessante do ponto de vista ecológico e agronômico, ao induzir o crescimento vegetativo e reduzir a infecção por patógenos. Comumente se associa a leveduras estabelecendo uma relação capaz de diminuir consideravelmente a ação de fungos (ESPINOSA et al., 2000). Nos testes obteve-se resultado positivo para a degradação de amido, celulose,solubilização de fosfato e o isolado N2 ainda apresentou atividade proteolítica.
A P. putida em outros estudos, foi capaz de degradar substâncias geralmente poluidoras como solventes orgânicos, hidrocarbonetos alifáticos e moléculas com anéis aromáticos. Esta bactéria é reconhecida como excelente biorremediador atuando tanto em ambientes aquáticos e no solo quando contaminados por benzeno, tolueno e gasolina. Quando exposta a esses contaminantes ela pode convertê-los em alguns tipos de plásticos e polihidroxialcanoatos (OTENIO et al., 2005). O Isolado N10 teve uma identidade muito próxima a espécie P. montelli, que é comum estar presente na rizosfera com a P. putida, por serem espécies próximas filogeneticamente. Ambas as linhagens podem degradar também o cádmio em pequenas quantidades (JAIN et al., 2010; PARK et al., 2005), elemento que inclusive foi encontrado com concentração de 1,053 mg/kg de massa seca de adubo orgânico.
O isolado N8, Burkholderia sp. com 100% de identidade, indica que o isolado possivelmente não foi descrito como espécie. O Isolado N11 foi identificado como B.
plantarii ou B. glumae com 99% e 98% de identidade respectivamente, linhagens
próximas filogeneticamente (MAEDA et al., 2006). Estas linhagens infectam sementes e raízes de várias plantas, causando, por exemplo, podridão da cebola, do arroz e até de cogumelo. O fato indica que possivelmente os microrganismos N8 e N11 não foram totalmente descritos como espécie anteriormente. As Burkholderia são microrganismos conhecidos por serem fitopatogênicos, com algumas espécies causando doenças com alta taxa de letalidade em homens e animais que estejam com baixa imunidade. Apesar disso sabe-se que este gênero bacteriano possui algumas capacidades agronômicas interessantes, promovendo o crescimento
vegetativo na rizosfera e em alguns casos degradando nutrientes, porém como já relatado, podem gerar mais problemas do que vantagens (ESTRADA-DE LOS SANTOS et al., 2013).
Desta forma esses isolados obtidos podem ser objeto de estudo de diferentes atividades biotecnológicas, em diversos seguimentos da indústria e em produtos de interesse agronômicos.
5 CONLUSÕES
A área do capim mantém uma monocultura, que pode favorecer poucos grupos bacterianos, corroborando para uma menor diversidade de filos, enquanto na horta, com o uso constante de composto orgânico, mostrou possuir diversidade maior de espécies quando comparada ao capim-forrageiro. No entanto a área do capim apresentou resultados semelhantes a horta quando se observa as capacidades microbianas em atuar nos ciclos biogeoquímicos. Isto indica a hipótese de que o principal fator que poderia determinar uma maior diversidade microbiana, além da própria interferência humana através do cultivo agrícola intensivo, é o uso do composto orgânico, porém esta maior variedade microbiana não reflete em maior capacidade microbiana de atuar nos ciclos biogeoquímicos. Quanto aos processos agronômicos úteis (produção de AIA e Solubilização de fosfato), notou-se que mesmo com menor diversidade de espécies em relação ao solo nativo, os ambientes da horta de do capim-forrageiro apresentaram índices maiores do que a do solo nativo, principalmente na quantidade de espécies ligadas a solubilização de fosfato. Apesar da menor diversidade encontrada na horta e na área do capim, é comum que se encontre no solo da Mata Atlântica, uma maior abundância apenas de Proteobacteria, Actinobacteria e Acidobacteria, conforme foi descrito por vários autores. Houve sempre uma quantidade relevante de sequencias não classificadas na área de solo nativo, levantando a hipótese de que há filos e gêneros não detectados, com grande potencial para novas descobertas. Sob o aspecto ecológico observou-se que o manejo do solo e uso de composto orgânico pode estar levando ao desaparecimento destas espécies bacterianas que ainda possuem pouca definição de seu papel na natureza.
Por fim, conseguiu-se o isolamento e identificação de 24 espécies bacterianas, sendo algumas plenamente conhecidas e outras com potencial, e ainda sem classificação segura. Essas espécies poderão ser mais bem avaliadas no futuro, quanto à produção de enzimas ou aplicação agronômica, e poderão contribuir para o desenvolvimento biotecnológico em diversos setores.
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