D ATAINNSAMLING

O DNA metagenômico extraído de cada de cada amostra de solo foi quantificado e avaliado quanto à qualidade por eletroforese em gel de agarose. As amostras de DNA apresentaram boa qualidade com bandas de alto tamanho molecular e sem degradação, conforme se observa na Figura 7.

A quantificação do material foi realizada por espectroscopia revelando uma concentração (ng/µl) satisfatória, porém os dados relativos a relação 260/280nm (média das triplicatas), conforme na Tabela 4 foram considerados fora do ideal que varia entre 1,80 a 2,00. Para solucionar este problema foi realizada uma eletroforese preparativa de DNA metagenômico, seguida de purificação que resultou em um DNA com melhor relação da absorbância 260/280nm, sendo todas dentro da faixa ideal conforme a Tabela 4.

Figura 7: Imagem invertida dos Géis de eletroforese em agarose do DNA metagenômico extraído das amostras de solo coletadas em época de chuva (1) e seca (2). As amostras de DNA metagenômico foram identificadas como H para a área da horta, C para capim-forrageiro e N para solo nativo. P representa o padrão (DNA Ladder) e a seta representa 1kb de DNA.

Tabela 4: Valor médio da quantificação do DNA metagenômico extraído e qualidade dada pela relação da absorbância em 260 e 280nm antes e após eletroforese preparativa. Amostra Concentração antes (ng/ul) Concentração após (ng/ul) [260/280] antes [280/260] após N1 455,1 55,1 1,46 1,86 N2 427,5 127,5 1,52 1,92 H1 336,3 36,3 1,41 1,81 H2 422,9 22,9 1,33 1,83 C1 423,1 23,1 1,40 1,90 C2 348,2 48,2 1,38 1,98

Após a purificação as tentativas de amplificação do gene 16S rRNA obtiveram êxito em todas as suas réplicas, conforme imagem na Figura 8, porém essa análise revelou que houve a formação de bandas inespecíficas, maiores e menores que o produto amplificado de 1500 pares de base.

Figura 8: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de cada amostra em duplicata após as reações de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores para o gene 16S rRNA. P representa o padrão (DNA Ladder) e a seta indica o padrão de 1500pb. Legenda: N- Solo nativo; C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.

Para o sucesso do sequenciamento os produtos de PCR devem apresentar bandas únicas e não ter resíduos de reação. A purificação das bandas de 1500pb amplificadas foi realizada através de eletroforese preparativa dos produtos de PCR

de cada amostra, com a mesma metodologia usada para a purificação do DNA metagenômico. Após a purificação foi realizada uma nova eletroforese em gel de agarose para confirmar a remoção das bandas inespecíficas (Figura 9). Observa-se assim o produto único da PCR de aproximadamente 1500pb e que pode ser utilizado para o sequenciamento do gene 16SrRNA.

Os resultados do sequenciamento dos ''amplicons'' (fragmentos amplificados) do gene 16SrRNA podem ser observados na Tabela 5. O número das sequencias obtidas variaram de 3 a 9 milhões, com comprimento médio de 150 a 230pb. Essas sequencias após processamento originaram sequencias com boa qualidade e tamanho de 150 a 220pb.

As sequencias obtidas foram usadas para a reconstrução das sequencias dos genes 16SrRNA. As sequencias reconstruídas apresentaram tamanho de 1426 a 1486pb e a quantidade de sequencias em cada amostra variou de 120 para amostras C2 a 2141 para a N1 (Tabela 5).

Figura 9: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR para o gene 16S

rRNA após a purificação. A seta indica o padrão de 1500pb.Legenda: N- Solo nativo;

C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.

O gráfico da curva de rarefação (Figura 10) das amostras sequenciadas, gerado através do programa (Megan 5.2.3) foi realizado usando os dados sequenciados normalizados.

Tabela 5: Resultados brutos do sequenciamento. Legenda: N- Solo nativo; C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.

Amostras Número sequencias de (in

pair)

Comprimento

médio (pb) Comprimento médio após

filtragem (pb) Número de sequencias reconstruídas Tamanho médio das sequencias reconstruídas N1 8.089.734 235 215 2141 1486 N2 3.476.706 237 216 437 1447 H1 9.346.648 165 153 469 1436 H2 9.383.196 157 150 326 1426 C1 7.288.144 183 173 806 1450 C2 3.276.212 239 220 120 1466

O gráfico demonstrou que as amostragens e o sequenciamento das amostras foram suficientes para detectar as espécies nos ambientes da forma mais próxima da realidade. Quando as curvas de cada amostra se aproximam do platô, indica que provavelmente caso fossem realizadas novas amostragens e sequenciamentos, há a probabilidade de se repetir os resultados e as espécies encontradas nas análises, sem que fossem detectadas outras espécies diferentes. Utilizando o mesmo programa (Megan 5.2.3), foi elaborado o gráfico PCoA dos dados normalizados (Figura 11). O gráfico confirma, visualmente, que os ambientes da horta (H1 e H2) e do capim-forrageiro (C1 e C2) são próximos biologicamente entre si quando comparados a área de solo nativo (N1 e N2). No entanto as amostras N1 e N2 também são distantes biologicamente entre si (HUSON et al., 2007).

Os índices de diversidade de ''Shannon'' foram calculados para cada área utilizando-se o programa Megan. Dados encontram-se na tabela 6, e demonstram maior diversidade para as amostras da área de mata ciliar nativa (N1 e N2), que foram de 4,836 e 4,503 respectivamente, em comparação com as outras áreas (H e C nas duas épocas estudadas). As áreas da Horta (H1 e H2) e Capim (C1 e C2) apresentam alta similaridade do índice de diversidade principalmente entre as amostras H2, C1 e C2 (média dos três ambientes de 3,680), com índices de 3,691, 3,686 e 3,664 respectivamente, enquanto a amostra H1 teve diferença no índice (3,906), porém ainda próximo das outras amostras da horta e do capim-forrageiro.

Figura 10. Gráfico da curva de rarefação indica que as amostras atingiram ou se aproximaram do platô estatístico.

Figura 11. Gráfico PCoA revelando visualmente a distância ecológica entre os ambientes. Nota-se que a horta e a área de capim são mais próximas entre si, em relação as áreas da mata nativa.

Tabela 6: Número de sequencias diferentes observadas e Índice de Shannon calculado para as amostras N1, N2, H1, H2, C1 e C2. Legenda: N- Solo nativo; C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.

Amostra Número de sequencias diferentes Índice de Shannon

N1 714 4,836 N2 152 4,503 H1 132 3,908 H2 71 3,691 C1 91 3,686 C2 22 3,664

A análise da diversidade e dos filos foi realizada inicialmente pela comparação de sequências pela ferramenta Classifier no RDP (Tabela 7). Essa análise revelou que entre os dois períodos estudados observa-se diferença significativa (de acordo com a ferramenta Classifier do RDP) apenas entre as amostras da mata ciliar nativa comparada as amostras do solo da horta e a da área de capim. Quando comparada a área da horta (H) em relação a área do capim (C) não se encontrou alteração significativa na população inclusive em ambos os períodos. Por outro lado, as sequencias observadas nas duas áreas cultivadas (H e C) comparadas com as amostras da mata (N) mostraram que existem diferenças relevantes entre os filos bacterianos encontrados nos ambientes estudados (Tabela 7). Quando compara-se os resultados encontrados das áreas de solo nativo, horta e capim-forrageiro, a maior diversidade de filos é encontrada amostras de solo nativo,sendo que nas áreas cultivadas (H e C) o predomínio é do filo Proteobacteria (Tabela 7). A análise comparativa realizada através das ferramentas do RDP deixa de classificar uma alta porcentagem de sequencias que chegou a 33% para as sequencias da amostra N1, e para tentar classificar essas sequencias uma nova análise comparativa foi realizada, desta vez utilizando a ferramenta Blastn e o banco de dados de genes ribossomais do NCBI.

Tabela 7: Porcentagem de sequencias obtidas das amostras N, H e C no período de chuva (1) e de seca (2) classificadas em filos por comparação com as depositadas no banco de dados do RDP. Legenda: N- Solo nativo; C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.

Filo (%) N1* N2* H1 H2 C1 C2 Acidobacteria 2,8 44,4 0 0 0 0 Actinobacteria 17,7 4,8 8,7 9,8 4 8,3 Bacteroidetes 0,8 1,1 0 0 0 0 Chloroflexi 0 0,5 0 0 0 0 Cyanobacteria 0,7 0 0 0 0 0 Firmicutes 6,7 2,3 1,7 0 0,6 0 Nitrospira 0,5 1,1 0,6 0,3 0,1 0 Proteobacteria 36,6 31,4 84,6 81 90,7 85 Verrucomicrobia 0,3 4,1 0 0 0 0 Não Classificadas 33,9 10,3 4,4 8,9 4,6 6,7

*Diferença significativa entre N1 e N2 quando comparadas com as demais

Os dados da análise comparativa feita pelo Blastn quanto à porcentagem de filos encontrados pode ser observada na Figura 12. Os filos em maior quantidade (Proteobacteria e Actinobacteria) apresentaram resultados similares entre as análise feitas com o RDPe o Blastn, porém a análise pelo Blastn revelou grupos não detectados e não classificados pelo RDP. Como a grande maioria das sequencias apresentaram ''score'' alto e número de bases similares maiores de 500pb, optou-se por estudar o gênero e espécie da população bacteriana nas amostras, com a identificação de cada organismo, dada pela comparação com o banco de dados do NCBI. Da mesma forma, esse banco também foi usado para as análises das funções biológicas de cada uma das espécies encontradas nos ambientes estudados.

Ao analisar os ambientes, nota-se que existem diferenças nos 3 ambientes quando se comparou o período de chuva com o de seca, sendo o período chuvoso o com maior diversidade de filos na horta e no capim-forrageiro, porém ao analisar o solo nativo, ouve diferenças significativas nas quantidade de sequencias encontradas em cada filo, pois notou-se um claro aumento do número de

sequencias no período de seca (N2), e uma maior concentração em poucos filos na época chuva (N1). As Acidobacteria e Actinobacteria apresentaram diferenças significativas, sendo a primeira em menor número na época de chuva e a segunda em maior quantidade no período de seca (Figura 12).

A horta (H1 e H2) apesar de ter mais de 80% das sequencias sendo do filo Proteobacteria. Observou-se alteração na quantidade de Actinobacteria em ambos os períodos, e na época de chuvas (H2) foram detectados Firmicutes e Nitrospira, mesmo que com baixa proporção (Figura 12). O mesmo foi observado na área de produção de capim forrageiro, pois alguns filos foram somente encontrados no período de chuvas. Quando comparados a época de seca (C1)e chuvas (C2), ambos apresentaram diferença na proporção dos filos Proteobacteria e Actinobacteria. (Figura 12).

Ao comparar os 3 ambientes entre si, o solo sob mata ciliar nativa (N1 e N2) mostrou-se o ambiente com maior número de espécies diferentes quando comparado ao solo obtido da horta (H1 e H2) e do capim (C1 e C2).

As amostras N1 e N2 possuem grande quantidade Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria e Firmicutes, além de outros grupos menores, que na horta e na área da capim pouco ou se quer foram detectados. Ainda ressalta-se que no solo nativo (N1 e N2) puderam ser observados organismos não encontrados nos outros ambientes e que ainda não estão totalmente classificados como o grupo Candidatus, com as espécies C. accumulibacter, C. koribacter, C. methylomirabilise

C. solibactere o filo Acidobacteria. Candidatus é composto por diversas espécies,

possuindo várias patogênicas, porém algumas possuem características benéficas. A C. accumulibacter é conhecida por remover fosfato de lodo ativado usado em tratamento de esgoto (HESSELMAN ET AL, 1999); a C. methylomirabilis ficou conhecida por estudos que levantaram a hipótese desta bactéria ser capaz de oxidar metano em condições anaeróbicas e por ser denitrificante (ETTWIG ET AL, 2010).

Figura 12: Gráfico da comparação da porcentagem de sequencias obtidas das amostras N, H e C no período de chuva (1) e de seca (2) classificadas em filos pela ferramenta Blastn do NCBI.

As duas bactérias citadas anteriormente são espécies com características recentemente descobertas e pouco elucidadas, portanto um cuidado especial deve ser tomado com relação a elas, considerando que só foram encontradas nas amostras da mata ciliar, indicando que o manejo do solo pode estar interferindo negativamente, proporcionando o desaparecimento dessas espécies ainda pouco conhecidas. 0% 50% 100% N1 N2 H1 H2 C1 C2 N1 N2 H1 H2 C1 C2 Acidobacteria 2,3 15,2 0,0 0,0 0,0 0,0 Actinobacteria 27,3 7,5 12,5 19,6 5,6 15,0 Aquificae 0,0 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 Bacteroidetes 0,4 0,9 0,0 0,0 0,0 0,0 Chloroflexi 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 Cyanobacteria 6,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Firmicutes 12,0 5,4 3,4 0,3 1,1 0,0 Nitrospira 0,1 1,4 0,2 0,3 0,0 0,0 Proteobacteria 48,3 46,9 83,7 78,9 93,2 85,0 Spirochaetes 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Tenericutes 0,0 0,0 0,0 0,9 0,0 0,0 Thermodesulfobacteria 0,0 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 Verrucomicrobia 0,1 3,9 0,0 0,0 0,0 0,0 Candidatus 3,4 17,9 0,2 0,0 0,1 0,0

Filos em %

Ao avaliar mais detalhadamente as sequencias do filo Proteobacteria, o filo com mais sequencias presentes nas amostras, verificou-se que há uma variação dos subgrupos de acordo com o período em cada área (Figura 13). Claramente a proporção entre os grupos de Proteobacterias se alterou na seca e no período de chuva, ao menos no solo nativo. As demais amostras apresentaram alterações percentuais na quantidade de betaproteobacteria. Com 89,6% de betaproteobacterias na amostra H1 até 98% na amostra C2, indicando a grande dominância dos organismos do grupo Betaproteobacteria em relação aos demais nas amostras da horta e da área do capim-forrageiro (Figura 13). Espécies da classe das Betaproteobacteria são ligadas principalmente a ordem das: Burkholderiales, Neisseriaceae e Hydrogenophilaceae. A ordem Burkholderiales inclui as espécies do gênero Burkholderia e Bordetella que são conhecidas por sua patogenicidade a plantas e animais. O gênero Neisseria pertence a ordem Neisseriaceae, este gênero possui espécies patogênicas ligadas a doenças importantes como meningite e gonorreia. Já a Hydrogenophilaceae é um grupo pequeno, e os gêneros desta ordem como o Thiobacillus não são patogênicos, sendo que algumas espécies podem até ajudar a combater doenças e pragas em vegetais, como também ter aplicação na recuperação de materiais como o cobre. A recuperação de metais já foi descrita e estudada, sendo que consiste em técnicas de bioprocessamento para recuperar de rejeitos de mineração ou sucata utilizando microrganismos que capturaram e concentram os metais desejados. (BEVILAQUA et al., 2009; MADIGAN e MARTINKO, 2005; RYAN e RAY, 2004; GODOY et al., 2003; ).

Outro filo importante e que foi observado exclusivamente na área de mata ciliar nativa, amostras N1 e N2 da Figura 13, é o filo das Acidobacterias. Esse filo bacteriano descrito por Ludwig et al. (1997) possui 26 subdivisões e a maioria de seus componentes descritos por análise metagenômica e não são cultivados in vitro. Entretanto esses organismos são abundantemente encontrados no solo e parecem exercer papel importante nesse ecossistema (ROCHA et al., 2013).

Figura 13: Gráfico detalhado do filo de Proteobacteria.

Nossos resultados mostram a presença desse filo bacteriano apenas nas amostras de solo da mata ciliar nativa sendo que os organismos observados pertencem a cinco subdivisões (Tabela 8) sendo a maioria da subdivisão 1.

Dentre o filo Acidobacteria, ressaltamos as espécies mais encontradas (mais de 10 sequências no total): Acidobacterium capsulatum, Granulicella tundricola,

Edaphobacter aggregans e Geothrix fermentans. A A. capsulatum é uma espécie

ainda pouco estudada e apesar de estar presente na rizosfera em diversos ambientes, foi isolada pela primeira vez em uma área contaminada por água ácida de mineração, ambiente rico em ferro e com alta acidez (KISHIMOTO et al., 1991). Esta espécie atua no ciclo do nitrogênio, é capaz de metabolizar ferro e vive em condições de grande estresse ambiental. As elevadas quantidades de ferro no solo nativo podem estar ligadas a presença desta espécie no ambiente, porém a espécie não foi detectada nos ambientes da horta e capim-forrageiro, indicando possivelmente que as atividades agrícolas e o uso do composto orgânico podem ter interferido negativamente no desenvolvimento da espécie. (WARD et al., 2009).

N1 N2 H1 H2 C1 C2 N1 N2 H1 H2 C1 C2 Alphaproteobacteria 13,8 53,6 7,3 2,3 2,9 2,0 Betaproteobacteria 48,9 3,9 89,6 94,6 96,7 98,0 Deltaproteobacteria 13,8 30,0 0,8 0,4 0,0 0,0 Gammaproteobacteria 23,5 12,6 2,3 2,7 0,4 0,0

Proteobactérias em %

Tabela 8–Número de sequencias, relacionadas ao filo Acidobacteria, observadas nas amostras de solo da mata ciliar nativa.

Espécies Número de sequencias

Subdivisão N1 N2 Acidi capsaligni 1 3 6 Acidi pilarosea 1 0 1 Acidobacterium capsulatum 1 13 8 Granulicella aggregans 1 0 1 Granulicella mallensis 1 1 1 Granulicella pectinivorans 1 1 0 Granulicella tundricola 1 1 10 Telmatobacter bradus 1 3 4 Edaphobacter aggregans 1 22 5 Edaphobacter modestus 1 3 4 Terriglobus roseus 1 0 1 Terriglobus saanensis 1 0 1 Bryobacter aggregatus 3 0 1 Holophaga foetida 4 1 5 Geothrix fermentans 8 1 18 Thermoanaerobaculum aquaticum 23 0 1

A espécie G. tundricola foi isolada inicialmente em solos de tundra, ambiente conhecido por poucos arbustos, por baixa temperatura e geralmente solo congelado, ou seja, em ambientes completamente diferentes de onde foi encontrado (ambiente de solo de mata ciliar em clima subtropical). Este gênero é conhecido por ser capaz de hidrolisar vários polissacarídeos (amido, pectina, mas não celulose) e é resistente a vários antibióticos ( NNI et al., 2012). Por sua vez, a espécie E. aggregans foi isolada em solo de florestas decíduas e solo alpino, que são biomas caracterizados por estarem em locais de clima temperado, como Sibéria, Europa, Estados Unidos e Nova Zelândia. Esta espécie pode participar na solubilização de fosfato (fosfatase ácida), porém não utiliza diversos açúcares ou ácido orgânicos (KOCH et al., 2008). Estas características evidenciam que a G. tundricola, a E.

aggregans foram detectadas em um ambiente com clima completamente diferentes

quando comparado aos ambientes onde foram descritas inicialmente, porém já foi descrito a ocorrência destas espécies, bem como de outras acidobacterias no solo de diversos biomas brasileiros e a ocorrência de ambas estaria ligada a fatores como baixo pH do solo e não pelo clima (CATÃO et al., 2014).

G. fermentans foi isolada em ambientes semelhantes a A. capsulatum, ou

seja, áreas contaminadas ou com excesso de metais, ou água de mineração. É anaeróbia e geralmente está ligada a degradação de Fe, sendo conhecida por ser parte do grupo de bactérias com capacidade de respiração usando óxido de Fe (3+) para gerar ATP, além de produzir pequenos campos elétricos (BOND E LOVELY, 2003; COATES et al., 1999.).