3. METODE
3.4 D ATAANALYSE
Apesar de alguns ambientes terem organismos pertencentes a poucos filos, os ambientes apresentaram um número muito grande de gêneros e espécies diferentes quando analisado desta ótica. Na Tabela 9 observa-se a quantidade de sequencias obtidas em cada amostra, para seca e chuva, totalizando 4297 sequencias. Dentre essas sequencias foram identificados 1139 espécies diferentes de acordo com o resultado do Blastn comparando-se com o banco de dados GenBank do NCBI. Essas diferentes espécies foram então avaliadas quanto ao conhecimento de sua participação em diferentes processos no ambiente, segundo dados da literatura. Com tal quantidade diferente de espécies foi oportuno verificar quais delas poderiam atuar no ambiente, causar doenças ou até suprimir outras espécies. No total, contabilizou nos 3 ambientes 879 espécies, considerando somente as diferentes sem distinção de qual amostra pertence, que então foram catalogadas e classificadas de acordo com suas funções ou características biológicas no ambiente. As espécies encontradas foram classificadas de acordo com suas atividades em diversos processos naturais de acordo com dados encontrados na literatura (Apêndice 1). Foi possível classificar as bactérias encontradas dentro dos seguintes processos: participação no ciclo do nitrogênio, metabolismo de
carbono, metabolismo de enxofre, processo de solubilização de fósforo, degradação de matéria orgânica em geral, atuação em processos de biorremediação, capacidade de reduzir Fe/Mn, produção de compostos biotecnológicos (goma xantana, PHB, etc.), capacidade de produzir antimicrobianos (atuando como antibióticos e/ou suprimindo doenças) e patogenicidade .
Tabela 9: Quantidade de Sequencias obtidas, o número de espécies diferentes após comparação ao banco de dados do NCBI e o número de espécies com características metabólicas conhecidas.Legenda: N- Solo nativo; C - capim- forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.
Amostra Sequencias Espécies Espécies com características conhecidas
Taxa de espécies com características conhecidas H1 469 133 89 67,0% H2 326 73 54 73,9% C1 809 91 69 75,8% C2 114 23 19 82,6% N1 2142 715 319 44,6% N2 437 154 86 55,8%
Deve-se ressaltar que uma mesma espécie pode participar em mais de uma atividade ao mesmo tempo e que as amostras com menos espécies identificadas foram as da mata nativa que possuíram aproximadamente metade das espécies identificadas sem conhecimento de suas atividades.Apesar de diferenças na quantidade de sequências iguais de uma mesma espécie foram consideradas somente o número de espécies diferentes presentes nos resultados. Tal forma de classificar foi usada para as análises e para os gráficos das Figuras 14, 15 e 16. Desta forma evitou que existisse uma distorção nos resultados finais, pois cada ambiente obteve números diferentes de sequencias montadas pelos programas de montagem genômica, tendo algumas espécies mais de 100 sequencias encontradas enquanto outras apenas 1.
Evidentemente que vários organismos não foram estudados profundamente, não possuindo nenhuma das características de interesse para o presente trabalho ou então não são se quer citados na literatura, porém há um grande número deles
que sabidamente participam de diversas atividades conhecidas. Conforme nota-se na Tabela 9 e o Apêndice 1, tanto a horta quanto na área de capim-forrageiro, possuem menos espécies diferentes quando comparados a área de mata nativa (N1 e N2), e a maioria das espécies encontradas já são conhecidas na literatura. Na horta, para os dois períodos H1 e H2, dentre espécies encontradas, 67,0% e 73,9% delas possuem algum estudo sobre suas capacidades biogeoquímicas e para a área de Capim-forrageiro, C1 e C2, 75,8% e 82,6% das espécies encontradas possuem estudos sobre suas capacidades metabólicas. No entanto a taxa de espécies com algum estudo sobre capacidade de atuar em ciclos biogeoquímicos, cai para 44,6% na amostra N1 e para 55,8% na amostra N2. Estes dados podem indicar que muitas espécies que estão presentes na área de solo nativo não são totalmente estudadas, e que a atividade humana de cultivo nas áreas da horta e de capim-forrageiro pode estar de alguma maneira suprimindo microrganismos que poderiam possuir capacidades interessantes do ponto de vista biotecnológico. Apesar deste ponto negativo, observou-se que nas áreas da horta e do capim-forrageiro houveram diferenças interessantes do ponto de vista agronômico, como a ocorrência maior de espécies que solubilizam de fosfato.
No ambiente de solo nativo no período de chuva (N1) e seca (N2), foram encontrados diversas espécies atuando em vários ciclos biogeoquímicos. Na figura 13estão os gráficos apresentando as porcentagem de espécies detectadas nas áreas de mata ciliar nativa e que são conhecidas na literatura por participar em alguma das atividades selecionadas para estudo. Observa-se nessas figuras que existem algumas pequenas diferenças entre os dois períodos climáticos analisados.
Dentre as espécies encontradas nos solos da mata ciliar nativa (N1 e N2, Figura 13) aproximadamente 35% das espécies atuam no ciclo do nitrogênio, participando em alguma etapa do processo de fixação desse elemento no solo. Quanto a participação no ciclo do enxofre o ambiente (N1 e N2) foi o com maior índice de espécies encontradas, com 15% no período de chuvas e 22% em seca. O ambiente também foi o único onde se identificou bactérias com capacidades de reduzir ou oxidar Fe e Mn, com participação de 4% do total de espécies na amostra N1 e 16% na N2. Quanto ao metabolismo de carbono 14% das espécies atuam no período de chuvas, porém cai para 6% na seca. O ambiente apresentou o maior
índice de bactérias com potencial patogênico, 9% na amostra N1 e 5% na N2. Não houve espécies relacionadas a solubilização de fosfato na amostra N1, mas na seca o percentual foi de 6%. Porém o ambiente também apresentou espécies com conhecidas capacidades em produzir antimicrobianos, com índice variando de 2% na época de seca a 7% em período de chuva.
Estudando os organismos encontrados nas amostras de solo da horta (Figura 14), nos períodos de chuva (H1) e seca (H2), foram observadas diferenças em relação ao de solo da mata nativa (Figura 13), porém é notável as espécies que atuam nos ciclos do carbono e nitrogênio foram aquelas com mais representantes. As bactérias com atuação no ciclo do nitrogênio representaram 33% na amostra H1 e 26% na H2, e quanto ao metabolismo de carbono os valores variaram de 13% a 23% em cada amostra respectivamente.
Na horta a principal diferença em relação a área de solo nativo é quanto a presença de bactérias com capacidade de solubilizar fosfato. Nas amostras H1 e H2, 23% e 24% respectivamente, das espécies possuem tal capacidade. A capacidade em degradar matéria orgânica (M.O.) se manteve próxima ao encontrado no ambiente nativo (entre 6 e 7%). O índice de bactérias patogênicas foi menor nas duas amostras quando comparadas as amostras N1 e N2. No ambiente da horta não foi encontrada nenhuma bactéria com conhecida capacidade em reduzir ou oxidar Fe e/ou Mn.
O ambiente de produção de capim-forrageiro, representado pelas amostras C1 e C2, chuva e seca respectivamente descrito na figura 15, apresentou índices semelhantes nos dois períodos sendo 32% e 31% das espécies ligadas ao ciclo do nitrogênio,24% e 26% de espécies com capacidade em solubilizar fosfato, de 18% e 20% quanto ao metabolismo de carbono, valores que não variaram mais do que 2% do período de chuva (C1) para seca (C2). Quando comparado com a horta, os índices de espécies solubilizadoras de fosfato apresentaram valores próximos, porém a área da horta e do capim, comparadas ao ambiente de solo nativo, apresentaram espécies solubilizadoras de fosfato em maior número.No ambiente do capim não foram detectadas espécies capazes de reduzir ou oxidar Fe e/ou Mn e tampouco de produzir compostos biotecnológicos.
Figura 13 : Gráfico da porcentagem de espécies que atuam em diferentes atividade na amostra N1 e N2.
Grande parte dos organismos presentes nos ambientes do solo nativo não foram os mesmos presentes no solo da horta e do capim-forrageiro, o que indicou que os microrganismos podem ter sido trazidos de fontes externas como o composto orgânico que é adicionado no solo dos dois ambientes produtivos (horta e capim- forrageiro). Degradação de M.O. 6% Metabolismo de C 14% Ciclo do Nitrogênio 35% Metabolismo de S 15% Solubilização de Fosfato 0% Produçãdo de Antimicrobianos 7% Patogênicas 9% Biorremediação 7% Redução de Fe/Mn 4% Compostos biotecnológicos 3%
Amostra N1
Degradação de M.O. 7% Metabolismo de C 6% Ciclo do Nitrogênio 34% Metabolismo de S 22% Solubilização de Fosfato 6% Produçãdo de Antimicrobianos 2% Patogênicas 5% Biorremediação 2% Redução de Fe/Mn 16% Compostos biotecnológicos 0%Amostra N2
Figura 14: Gráfico do índice de espécies que atuam em alguma atividade na amostra H1 e H2.
A solubilização de fosfato foi uma das características que demonstram claramente que há uma diferença entre o solo nativo e os solos da horta e capim- forrageiro. Nas amostras H1, H2, C1 e C2 no mínimo 23% do total de organismos são de microrganismos solubilizadores de fosfato, com valores chegando a 26% na amostra C2, valores que foram muito superiores aos encontrados no solo nativo. A área da horta é uma área submetida à adição de fósforo via adubação mineral além do uso de composto orgânico que também contem tal elemento, desta forma os
Degradação de M.O. 6% Metabolismo de C 13% Ciclo do Nitrogênio 33% Metabolismo de S 9% Solubilização de Fosfato 23% Produçãdo de Antimicrobianos 3% Patogênicas 3% Biorremediação 9% Redução de Fe/Mn 0% Compostos biotecnológicos 1%
Amostra H1
Degradação de M.O. 8% Metabolismo de C 23% Ciclo do Nitrogênio 26% Metabolismo de S 0% Solubilização de Fosfato 24% Produçãdo de Antimicrobianos 1% Patogênicas 2% Biorremediação 16% Redução de Fe/Mn 0% Compostos biotecnológicos 0%Amostra H2
resultados observados sugerem que de alguma forma, o uso do composto orgânico e ao manejo do solo implica em alteração da composição da microbiota.
Os gêneros mais importantes encontrados nesse trabalho foram:
Arthrobacter, Bacillus, Bradyrhizobium, Burkholderia, Nocardioides, Pseudomonas e Streptomyces. Estes gêneros foram consideradas importantes pois possuíam ao
menos 10 espécies diferentes identificadas. Outros gêneros como Actinoplanes,
Cupriavidus, Geobacter, Thermomonas, Georgenia, Dokdonella e Pandoraea
obtiveram menos de 10 espécies diferentes, porém possuem características fisiológicas e bioquímicas relevantes.
O gênero Arthrobacter foi encontrado em todas as amostras, e em quantidades semelhantes, indicando que possivelmente estes organismos são nativos da área toda. Este gênero apresentou 27 espécies diferentes, ressalta-se ainda que este grupo é conhecido na literatura por possuir capacidades como metabolismo de carbono de diversas fontes, conferindo também propriedades biorremediadoras e participação no ciclo do nitrogênio (MEGHARAJ et al., 2003; MARTIN et al., 2003).
Indivíduos do gênero Burkholderia, por exemplo, foram abundantes e sabe-se de suas capacidades solubilizadoras. No solo nativo foram encontradas algumas espécies de Burkholderia, porém no solo da horta e do capim foram encontradas mais espécies diferentes, sendo que várias não foram detectadas no solo nativo. Este gênero possui características diversas de metabolismo de carbono inclusive de hidrocarbonetos e é conhecido principalmente por ser um grupo com espécies patogênicas (DENEF et al., 2004; GODOY et al., 2003) No total foram obtidas 40 espécies diferentes entre os 3 ambientes, sendo a mais abundante a espécie B.
rhizoxinica, espécie que é um importante patógeno para o homem, pois produz a
toxina rhizonica que é hepatotóxica, além de que esta espécie geralmente é associada a B. cepacia, B. thailandensis e B. mallei, causando doenças como fibrose cística, amiloidose e infecções diversas (GEE et al., 2011).
Organismos do gênero Bacillus também foram encontrados, porém nesse caso notou-se uma maior quantidade de sequencias no solo nativo, porém concentradas em poucas espécies. O solo da horta e do capim-forrageiro apresentaram mais espécies diferentes de Bacillus apesar de serem encontradas
poucas sequencias de cada um. Os indivíduos deste gênero são conhecidos por suas capacidades em atuar no ciclo nitrogênio e de metabolizar carbono de várias fontes (GOMES, 2013).
Figura 15: Gráfico do índice de espécies que atuam em alguma atividade na amostra C1 e C2
O gênero Pseudomonas é bem conhecido tanto por participar no ciclo do nitrogênio ao colonizar a rizosfera como também por possuir espécies patogênicas tanto para plantas como animais (DOGAN E BOOR, 2003). Neste grupo foram encontradas 29 espécies diferentes, estando praticamente todas no solo
Degradação de M.O. 5% Metabolismo de C 18% Ciclo do Nitrogênio 32% Metabolismo de S 6% Solubilização de Fosfato 24% Produçãdo de Antimicrobianos 2% Patogênicas 3% Biorremediação 10% Redução de Fe/Mn 0% Compostos biotecnológicos 0%
Amostra C1
Degradação de M.O. 3% Metabolismo de C 20% Ciclo do Nitrogênio 31% Metabolismo de S 0% Solubilização de Fosfato 26% Produçãdo de Antimicrobianos 0% Patogênicas 3% Biorremediação 17% Redução de Fe/Mn 0% Compostos biotecnológicos 0%Amostra C2
nativo (H1 e H2). De maneira geral o número de espécies consideradas patogênicas foi menor na horta e na área do capim onde se aplica composto orgânico, pois uma de suas características é a não presença de espécies patogênicas, podendo também, haver presente no composto, espécies benéficas que suprimam as espécies causadoras de doenças.
Portanto, as alterações na população microbiana da horta e do capim- forrageiro foram benéficas para a produtividade agrícola quando comparadas à área nativa, pois o número de espécies patogênicas foi reduzido e se observou aumento de espécies capazes de solubilizar fosfato e metabolizar carbono.Além disso,apesar do uso do composto alterar a microfauna do solo, pouco se perdeu quanto a quantidade de espécies ligadas de fixação de nitrogênio e degradação de matéria orgânica. Porém notou-se que espécies pouco conhecidas diminuíram ou desapareceram do ambiente onde houve interferência humana com o cultivo, principalmente como demonstrou a tabela 9, mostrando que na área de solo nativa só se conhece profundamente em média 52% das espécies, demonstrando que apesar de benéfico, o uso de composto orgânico pouco fez para evitar a perda destes organismos que desapareceram ou diminuíram nas amostras H1/H2 e C1/C2.