A AOXp está presente em diversos organismos como plantas superiores, muitos fungos, protistas, algumas bactérias e alguns poucos animais. Devido ao fato desta enzima desacoplar o transporte de elétrons da síntese de ATP, a elucidação da função deste escape da cadeia de transporte de elétrons é ainda objetivo de inúmeras pesquisas (HO et al. 2007; MAGNANI et al. 2007; MAGNANI et al. 2008). Ocasionalmente, o desacoplamento promovido por AOXp leva a energia produzida pela oxidação das moléculas a ser liberada na forma de calor. Esta produção de calor tem importante participação no ciclo reprodutivo de plantas da família Araceae, que utilizam o aumento de temperatura pela atividade da AOXp para volatização de aminas e atração de insetos polinizadores (WAGNER et al. 2008).
Como descrito por alguns autores, AOXp tem papel fundamental na proteção de diversos fungos fitopatogênicos a antifúngicos que atuam no complexo III mitocondrial (STANIC et al. 2013, TING XU et al. 2013, TOMOO SHIBAA et al. 2012, SARASA et al. 2013, YOSHIDA et al. 2013, HASSAN & BILITEWSKI et al.2013). A proteína codificada pelo gene AOX é composta por 378 aminoácidos, sendo os 40 primeiros resíduos correspondentes ao peptídeo de sinalização para mitocôndria. Muitas regiões conservadas das proteínas AOXp já foram descritas para outros fungos e plantas também (MOORE,UMBACH & SIEDOW 1995; SIEDOW et al 2000).
O gene AOX de M. perniciosa foi caracterizado por THOMAZELLA et al 2012, sendo constituído por dez éxons e nove introns, sendo estes números bastante variáveis nos diferentes organismos já estudados. De modo geral, a AOXp de microrganismos é codificada por um ou poucos genes nucleares,
enquanto que plantas superiores possuem uma família multigênica, tradicionalmente dividida em duas subfamílias, aox1 e aox2 (ALBURY ET AL., 1996). Finalmente, verificou se que o gene Mp-AOX codifica para uma enzima AOXp funcional, cuja a atividade foi confirmada por meio de ensaios de consumo de oxigênio por mitocôndrias isoladas do fungo da vassoura de bruxa (THOMAZELLA et al., 2012).
Iniciamos pela obtenção do gene Mp-AOX isolado e com adaptadores adequados para clonagem no vetor de expressão em S. cerevisiae. Para isso, o gene Mp-AOX foi amplificado por PCR do vetor pGEM-T (gentilmente cedido pelo LGE-UNICAMP) usando oligonucleotídeos específicos (tabela 1). Para expressar o gene Mp-AOX na levedura escolhemos usar o vetor pYES2/CT (Invitrogen). Esse vetor permite a clonagem direcional com extremidades coesivas e expressão forte controlada por galactose. A clonagem foi realizada retirando-se o códon original de terminação da tradução de Mp-AOX para que fosse gerada uma proteína recombinante em fusão C-terminal com a cauda de histidina e o epítopo V5 presentes no vetor (figura 5). O inserto obtido possui o tamanho esperado de 1137bps e relativo grau de pureza (figura 7A). Após reação de ligação e transformação, foram recuperados plasmídeos pYES2/CT+Mp-AOX. Como a clonagem é direcional, testamos apenas a presença ou ausência do inserto no vetor através da reação de PCR (figura 7B) com oligonucleotídeos específicos (tabela 1).
Figura 7.Foto do gel de agarose 0.8% corado com brometo de etídeo mostrando os produtos de (A) PCR referentes ao isolamento do gene Mp-AOX do vetor pGEM-T. (B) produtos de PCR do gene Mp-AOX usando diferentes clones do vetor pYES2/CT-Mp-
AOX). Marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen).
A construção e integridade do gene foram verificadas através de reação de sequenciamento de DNA. Após a construção do vetor foi realizada a transformação da linhagem W303-1b com vetor pYES2/CT vazio (controle) e com pYES2/CT+Mp-AOX.
Por se tratar de uma proteína de função mitocondrial e estar sendo expressa de forma heteróloga em S. cerevisiae, um dos primeiros controles experimentais foi sua expressão e correta localização intracelular na levedura. Para detectar e localizar a proteína Mp-AOXp foi realizada a técnica Western blotting, usando o anticorpo comercial anti-V5, pois a proteína Mp-AOXp recombinante expressa em S. cerevisiae está em fusão C-terminal com uma cauda de histidina e o epítopo V5. Como observado na figura 8, a Mp-AOXp foi expressa com sucesso e localiza-se na mitocôndria da levedura S. cerevisiae, onde provavelmente essa proteína pode executar corretamente sua função.
Uma das hipóteses para a resistência do fungo M. perniciosa aos antifúngicos convencionais (inibidores da cadeia principal de transporte de elétrons na respiração) seria a presença e atividade de Mp-AOXp. Essa enzima é mais expressa na fase biotrófica do fungo (THOMAZELLA et al., 2012), fase essa de baixa proliferação celular. Imagina-se que essa baixa formação de biomassa seria causada pela baixa produção de ATP, consequência da presença e atividade de Mp-AOXp que desviaria o fluxo de elétrons para menor geração de ROS, mas com o custo de menor taxa de crescimento. Esse “custo” poderia ainda ser considerado estratégia de infecção do fungo, pois durante a fase biotrófica os tecidos da planta estão vivos e em plena atividade de defesa.
Figura 8: Western blot da proteína Mp-AOXp de peso aproximado de 40kDA, marcada com anticorpo Anti-V5,revelada com fosfatase alcalina. Mitocôndria (MIT (AOX)), Citosol (Cito (AOX)), Mitocôndria (vetor vazio MIT Ø), Citosol (vetor vazio Cito Ø).
MIT (AOX) Cito (AOX) MIT Ø Cito Ø RAINBOW
kD
5
5
Affourtit e colaboradores transformaram a levedura
Schizosaccharomyces pombe com o gene AOX de Sauromatum gutattum.
Neste trabalho, eles verificaram diferenças interessantes quanto à taxa de crescimento e formação de biomassa da levedura transformada. Os autores concluíram que os efeitos sobre o crescimento da levedura são consequências da atividade da oxidase alternativa da planta sobre o metabolismo energético da levedura, pois a atividade desta enzima resulta em um menor aproveitamento e conservação de energia na forma de ATP (Affourtit et al.,2002 ).
Assim, para se analisar se a expressão de Mp-AOXp influencia o padrão de crescimento da levedura realizamos a curva de crescimento e a medição da massa seca das linhagens recombinantes em glicose e em galactose. Uma das características do vetor pYES2/CT é a regulação da expressão da proteína recombinante através do promotor GAL1 (figura 5). Esse promotor é considerado muito forte quanto a sua capacidade de ind ução da expressão da proteína sob sua regulação e é reprimido pela presença de glicose e altamente induzido pela presença de galactose.
A figura 9 mostra a curva de crescimento das linhagens controle (W303- 1b vetor vazio) e W303-1b + Mp-AOX em glicose (condição de repressão do promotor GAL1) e em galactose (condição de ativação do promotor GAL1).
Figura 9: Gráfico representado a curva de crescimento na presença de diferentes fontes de carbono, glicose (verde e roxo), galactose (azul e vermelho) das linhagens transformadas. Representando a condição de inibição da expressão de Mp-AOX, células crescidas em glicose (verde e azul) e o vetor vazio (Azul e vermelho).Todas as curvas foram realizadas em meio minimo SD-URA- , realizando a leitura da densidade óptica a cada 2 horas partindo da OD600nm
inicial de 0.2 .
Podemos observar na figura 9 que as linhagens onde há pouca ou nenhuma expressão do gene Mp-AOX (verde, vermelho e azul) o crescimento celular foi maior em relação à linhagem expressando Mp-AOX (roxo). Como galactose não é a fonte de carbono preferencial da levedura S. cerevisiae (GANCEDO, 1998), nota-se um claro prolongamento da fase lag nessas condições, mesmo para a linhagem com vetor vazio (linha vermelha). No entanto, comparando as linhagens na mesma fonte de carbono, nos tempos 4 e 8 horas em galactose (linhas vermelha e roxa), a levedura com vetor vazio triplica o valor de densidade óptica, enquanto a levedura expressando Mp-AOX não consegue nem dobrar esse valor. Quando se comparam os padrões de
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 2 4 6 8 10 O D6 0 0 n m HORAS
vetor vazio (Glicose) vetor vazio(Galactose) Mp-AOX (Glicose) Mp-AOX(Galactose)
crescimento em glicose observamos que mesmo em condição de repressão do promotor GAL1 deve ocorrer um escape de transcrição, pois a levedura com o vetor vazio cresce em taxa maior, especialmente após 8 horas, tempo em que a concentração de glicose no meio deve estar baixa.
Para confirmar esses resultados, realizamos experimentos para medir a produção de massa seca nessas leveduras (figura 10).
Como observado na figura 10, a linhagem transformada apenas com o vetor vazio pYES2/CT (barras azuis) teve diminuição na formação de biomassa causada pelo crescimento em galactose, resultado esperado e de acordo com os resultados obtidos na figura 9, por ser fonte alternativa de carbono para S.
cerevisiae. Contudo, ao compararmos as biomassas geradas na mesma fonte
de carbono, na presença ou ausência de Mp-AOXp, notamos que em glicose
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,007 0,008 0,009 0,01 Glicose Galactose
m
a
ss
a
s
e
ca
(
g)
Vetor vazio Mp-AOX * * # #Figura 10: Gráfico de barras representando a medição da biomassa seca em diferentes condições: glicose representando a inibição do promotor GAL1 e galactose representando a ativação do promotor GAL1. Em azul a levedura transformada com o vetor vazio e em vermelho a levedura transformada com o vetor pYES2/CT+ Mp-AOX. * e # Diferença estatisticamente significante de acordo com teste t student pareado, com p<0.01.
(menor expressão) não há diferença estatisticamente significativa. Já em galactose, condição de máxima expressão de Mp-AOXp observamos diferença significativa; a biomassa produzida pela levedura com vetor vazio é cinco vezes maior que a produzida pela levedura expressando Mp-AOXp.
A proteína Mp-AOXp pode atuar na diminuição da formação de biomassa celular devido ao desacoplamento da cadeia respiratória à produção de ATP. Desse modo, ao desacoplar a produção de ATP, a célula produz menos energia levando a uma diminuição das funções celulares dependentes de ATP, principalmente a proliferação celular (ALBURY et al 1996; MINAGAWA & YOSHIMOTO 1987).
No trabalho realizado por Magnani e colaboradores (2007), o gene AOX de A. fumigatus foi clonado em S. cerevisiae e os efeitos desta expressão heteróloga foram verificados. Dentre estes efeitos, observou-se a ocorrência de resistência ao cianeto (inibidor do complexo IV) pela levedura transformada. A utilização da levedura S. cerevisiae como um modelo para a expressão heteróloga do gene AOX é bastante pertinente, uma vez que esta levedura é um dos poucos fungos que não apresentam o gene da oxidase alternativa em seu genoma. Tal abordagem é bastante interessante, pois faz uso de um sistema biológico robusto e de fácil manipulação, trazendo resultados a respeito dos efeitos fisiológicos da expressão e atividade do gene AOX em um organismo vivo.
Para verificar a atividade da Mp-AOXp, buscamos analisar a funcionalidade da oxidase alternativa de M .perniciosa, através do consumo de oxigênio de mitocôndrias expressando essa proteína heteróloga. A participação de cada via de transporte de elétrons foi verificada utilizando se os inibidores:
da via principal antimicina A, e da AOXp o n-propil galato.
Como observado na figura 11 o padrão de consumo de oxigênio foi modificado pela expressão da Mp-AOXp em mitocôndrias de S. cerevisiae. Apenas a título de esclarecimento, os platôs da figura representam o atraso de leitura do equipamento durante as adições dos diferentes compostos. Em ambos os quadros podemos observar a respiração no inicio da adição da mitocôndria (MIT) com um pequeno declínio da curva representando o consumo de oxigênio e logo após um grande consumo ao serem adicionados os substratos NADH e ADP. Isso mostra que em ambas as mitocôndrias (com e sem Mp-AOXp) a cadeia respiratória principal está funcionando corretamente. A maior diferença se dá ao ser adicionado o bloqueador da cadeia principal antimicina A, que inibe completamente a atividade respiratória nas mitocôndrias sem Mp-AOXp (quadro A), só havendo a reativação do consumo devido à adição de GMP. Observa-se ainda que o n-propil galacto não tem efeito nas mitocôndrias sem Mp-AOXp (Figura 11, quadro A). Contudo, fica claro que a
Mp-AOXp está mantendo o consumo de oxigênio nas mitocôndrias que
expressam essa proteína (quadro B), mesmo após a adição de antimicina A, evidenciando a participação e funcionalidade da oxidase alternativa no consumo de oxigênio dessas mitocôndrias. Além disso, fica clara a inibição do consumo de oxigênio pela adição de n-propil galato, representado no último platô (figura 11, quadro B).
Figura 11: Padrão de consumo de oxigênio por mitocôndrias isoladas da linhagem de S.
cerevisiae W303-1b-vetor vazio, sem expressar Mp-AOXp (A) e W 303-1b+MpAOXp (B).
NADH 2mM foi utilizado como substrato respiratório e ADP como substrato para o complexo enzimático ATP sintase. Após a inibição da cadeia respiratória principal pela antimicina A, o consumo de oxigênio foi analisado na presença de GMP (estimulador da AOXp) e do n-propil galato (inibidor da AOXp).
Na planta Arabidopsis thaliana, a proteína AOXp é expressa constitutivamente e o gene que a codifica possui regiões que são conservadas, sugerindo que essa via alternativa é uma rota importante no metabolismo dessa planta (VANLERBERGHE & McINTOSH, 1997). Entretanto, a função dessa via nesse organismo não está totalmente esclarecida. A AOXp tem sua expressão aumentada quando a planta é exposta a baixas temperaturas e ao ataque de patógenos (VANLERBERGHE & McINTOSH, 1992, 1997). Esse tipo de respiração foi mais bem definido na florescência termogênica de
Sauromatum guttatum (MEEUSE, 1975). Neste organismo o calor é produzido
e liberado em flores efêmeras durante um único dia de florescência, volatilizando aromas com o objetivo de atrair insetos polinizadores (McINTOSH, 1994).
Alguns estudos têm proposto que a AOXp pode prevenir a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) em resposta ao estresse (WAGNER, 1995; MILLAR & DAY, 1996, 1997; MAXWELL et al., 1999; CALEGARIO et al., 2003; PINHEIRO et al., 2004). As proteínas AOXp e proteína desacopladora de
mitocôndrias de plantas (PUMP) mostraram similaridades fisiológicas, pois
ambas são dissipadoras de energia (SIEDOW & BERTHOLD, 1986; VERCESI
et al., 1995; WAGNER & KRAB, 1995; CALEGARIO et al., 2003; PINHEIRO et al., 2004) e protetoras contra ROS. Além disso, AOXp e PUMP são
estimuladas por baixas temperaturas (ELTHON et al., 1986; LALOI et al., 1997; NANTES et al., 1999; CALEGARIO et al., 2003; PINHEIRO et al., 2004).
Apesar dessa similaridade, essas proteínas podem ter diferentes funções. De fato, AOXp e PUMP são reguladas de modo inversamente proporcional pelos ácidos graxos livres. A PUMP é ativada pelo aumento da
concentração de ácidos graxos enquanto que a atividade da AOXp é progressivamente diminuída, sugerindo que as proteínas não podem expressar a atividade máxima simultaneamente (SLUSE et al., 1998; CALEGARIO et al., 2003).
Uma das hipóteses a respeito da expressão de Mp-AOX levar a uma diminuição na síntese de ATP por desviar os elétrons da via respiratória principal, seria diminuir a geração de ROS e que isso levaria a uma diminuição na taxa de crescimento celular. Além disso, Mp-AOX, especialmente em M.
perniciosa que curiosamente (de forma incomum) estende sua fase biotrófica
por muito tempo, causaria uma diminuição nos níveis de ROS por dar destino rápido aos elétrons da cadeia respiratória principal bloqueada por inibidores. No início da infecção, o fungo está na fase biotrófica, com crescimento lento. A planta inicia uma resposta ao patógeno aumentando os níveis de óxido nítrico (NO) nos tecidos infectados. Esse NO seria o responsável por inibir a cadeia principal de elétrons de M. perniciosa, que mesmo assim estende a fase biotrófica. Essa longa fase biotrófica em M. perniciosa seria permitida pelo alto nível de expressão gênica de Mp-AOX (THOMAZELLA, D.P.T., et al 2012). Ironicamente, a própria planta acaba sofrendo os efeitos tóxicos do NO. Os galhos infectados morrem e viram alimento para a M. perniciosa, que passa rapidamente para a fase necrotrófica, em que se alimenta do tecido morto (THOMAZELLA, D.P.T. et al 2012).
Como a AOXp vem sendo uma proteína relacionada ao alívio do estresse oxidativo em diferentes microrganismos realizamos o ensaio de quantificação da produção de peróxido de hidrogênio mitocondrial (figura 12).
Figura 12: A formação de H2O2 mitocondrial foi monitorada durante a incubação das organelas
isoladas de leveduras expressando Mp-AOX ou não, por 15 minutos a 30ºC em tampão contendo 50µM de Amplex Red (Invitrogen), 0.5 U/ml de horderadish peroxidase (Sigma), 2% de etanol, 1 mM malato, 6mM glutamato e 100µg/ml de proteína mitocondrial. A produção de peróxido de hidrogênio foi medida por espectrofluorímetro, F-2500 FL Spectrophotometer- com excitação a 563nm e emissão a 587 nm (BUSSO et al., 2010).
DEMASI AP (2001) demonstrou em seus experimentos que ao bloquear o complexo III por meio da adição da antimicina A aumentava consideravelmente o acúmulo de ROS. Como descrito por diversos autores a AOXp pode atuar no alívio do estresse oxidativo quando bloqueado o complexo III mitocondrial, reduzindo o oxigênio livre à molécula de água doando 4 elétrons de uma só vez, o que diminui a possibilidade de um aumento significativo do estresse oxidativo por espécies reativas de oxigênio (ROS) (INOUE et al,. 2012; HASSAN & URSULABILITEWSKI 2013; FILIPPOU, 2012; JASON D. et al 2013; FRANK E. NARGANG, 2012; C. ODDS. 2005; CVETKOVSKA & VANLERBERGHE, 2013; MALLOA, et al 2013; MLEJNEK, 2013; TING XU, et al, 2013). Na figura 12 observamos que as mitocôndrias de
0 5 10 15 20 25 30 0 200 400 600 800 1000 C o n c e n tra ç ã o d e H 2 O2 ( µ M) Tempo (s) vetor vazio Mp-AOX
levedura expressando Mp-AOXp produzem menos peróxido de hidrogênio. Analisando apenas a parte linear da curva e suas respectivas equações de reta, concluímos que a expressão da Mp-AOXp provocou uma taxa 7 vezes menor de produção de peróxido de hidrogênio pelas mitocôndrias. Dessa forma, nossos dados sugerem que a atividade de Mp-AOXp leva a um alívio no estresse oxidativo de mitocôndrias que expressam essa proteína.
COSTA DE OLIVEIRA (2012) e colaboradores com intuito de determinar qual a relevância desta via alternativa na resistência ao estresse oxidativo em
Candida krusei, submeteram vários isolados clínicos que expressavam AOX a
diferentes indutores de estresse oxidativo (peróxido de hidrogênio, menadiona e plumbagina) e a dois antifúngicos o fluconazol e o voriconazol com e sem inibidor da AOX, o ácido salicil hidroxâmico (SHAM). Seus resultados mostraram que o fluconazol e o voriconazol induzem a produção de ROS numa percentagem muito pequena, aproximadamente entre 0 e 10%, sugerindo que a indução de estresse oxidativo não é o principal mecanismo na base do efeito fungistático destes dois antifúngicos. No entanto, a inibição específica da AOX pelo SHAM resultou num aumento da percentagem de células com ROS acumulados para ambos os tratamentos. Estes dados parecem sugerir que estes antifúngicos podem, eventualmente, induzir algum estresse oxidativo e que a atividade da AOX permite às células diminuir a produção de ROS, revelando o possível envolvimento desta enzima na resistência aos antifúngicos indutores de estresse oxidativo. A relevância da atividade da AOX na resistência ao estresse oxidativo foi reforçada pelos resultados obtidos nos tratamentos com os indutores de estresse oxidativo, o peróxido de hidrogênio, a menadiona e a plumbagina os quais mostraram que a atividade da AOX,
presente nos isolados clínicos de C. krusei, permite diminuir a produção de ROS e muito provavelmente conferir alguma resistência a estas células. Este estudo permitiu elucidar a ação da AOX como um dos possíveis mecanismos de defesa que poderá contribuir para compreensão da resistência de C. krusei aos agentes antifúngicos.
Ao compararmos nossos dados com os já observados na literatura podemos sugerir que a AOXp de M. perniciosa atua na diminuição de ROS mitocondrial. Isso pode fazer com que o fungo consiga crescer mesmo em contato com azoxistrobinas, bloqueador do complexo III, antifúngico usado amplamente na lavoura cacaueira.
Para observar os efeitos dos principais bloqueadores azoxistrobina (bloqueador do complexo III) e SHAM (bloqueador especifico de AOX), na viabilidade da S. cerevisiae, realizamos o teste por diluição seriada (figura 13). Os pesquisadores do LGE da UNICAMP observaram que o uso desses dois bloqueadores se mostraram eficazes no combate ao fungo M. perniciosa em laboratório, porém não se mostraram eficazes em campo.
A linhagem W303-1b+pYES2/CT (controle vetor vazio) não mostrou sensibilidade na presença das concentrações utilizadas de azoxistrobina ou de SHAM. No entanto, as células que expressam Mp-AOXp são insensíveis à azoxistrobina e ao SHAM nas concentrações utilizadas, mas são sensíveis à combinação de Azoxistrobina e SHAM.
Figura 13: Teste de viabilidade das leveduras expressando ou não Mp-AOXp na presença dos principais bloqueadores azoxistrobina (complexo III ) e SHAM (AOX). DMSO foi utilizado como solvente e, portanto, utilizado como controle (A). As células foram crescidas em meio SD-URA- a 30ºC até a fase LOG a partir de uma OD600nm de 0.2, 5uL de cada diluição seriada de 5X
foram aplicados em placa de SD-URA- contendo 1,5% DMSO, 1mg/L azoxistrobina, 0,75g/L SHAM. As placas foram incubadas a 30ºC por 3 dias.
Esperava-se que ao adicionarmos azoxistrobina na placa de cultivo (sendo um bloqueador do complexo III) a linhagem não expressando Mp-AOXp demonstraria uma sensibilidade aumentada, porém o mesmo não aconteceu. Contudo, Fisher e Meunier (2005) descreveram que mutações no citocromo b de leveduras S. cerevisiae levam à resistência à azoxistrobina. Já em 2006, Hnátová et al. descreveram diversos genes ou mutações de ponto, tanto no genoma nuclear como no genoma mitocondrial, que levaram à resistência de S.
cerevisiae às estrobilurinas, incluindo azoxistrobina. Podemos sugerir que a
linhagem W303-1b deva conter alguma dessas mutações que levam à resistência à azoxistrobina, como observado em nossos resultados.
Assim, diante dessa resistência da S. cerevisiae à estrobilurinas, realizamos o mesmo experimento de diluição seriada só que desta vez com o bloqueador do complexo III antimicina A (figura 14).
Figura 14: Teste de viabilidade das leveduras expressando ou não Mp-AOXp na presença dos principais bloqueadores antimicina A (complexo III ) e SHAM (AOX). DMSO foi utilizado como solvente e, portanto, utilizado como controle (A). As células foram crescidas em meio SD-URA- a 30ºC até a fase LOG a partir de uma OD600nm de 0.2, 5uL de cada diluição seriada de 5X
foram aplicados em placa de SD-URA- contendo 1,5% DMSO,1mg/L antimicina A,0,75g/L