4. Discussion
4.5. The Five Multinational and International Companies
4.5.1. Move One
A avaliação do potencial tóxico das doses homeopáticas e fitoterápicas administradas de
Symphytum officinale
foi feita não só através do exame histológico do fígado e do rim mas também pela análise bioquímica específica para fígado e rins.Para avaliação do fígado foram realizadas as análises da atividade enzimática de fosfatase alcalina (FA), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), gama glutamil transferase (GGT) e para os rins a análise da concentração de uréia e creatinina.
4.13.1 Determinação da atividade de Fosfatase alcalina (FA)
A atividade enzimática da fosfatase alcalina foi avaliada pelo método descrito por Roy, 1970 através da timolftaleina monofosfato como substrato, que após hidrólise libera a timolftaleína, que apresenta cor azul em meio alcalino. Foi usado espectrofotômetro SHIMADZU-UV- 1203 séries a 590 nm. A cor formada é diretamente proporcional à atividade enzimática.
Para o cálculo da atividade enzimática (AE) em U/I foram utilizadas, como referência padrão, soluções de timolftaleína correspondentes à atividade enzimática de 45, 22,5 e 12,25 U/I. As absorbâncias destes padrões foram medidas e utilizadas no levantamento da curva padrão utilizando-se o programa computacional Graph-Pad Prism versão 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego Califórnica, U.S.A). O fator de calibração (Fc) calculado através da regressão linear foi utilizado para o cálculo das AE nas amostras séricas através da relação: AE= Fc x Absorbância da amostra. O levantamento da curva padrão para obtenção do Fc foi realizado em todas análises bioquímicas deste trabalho.
Durante as medidas da AE foram utilizadas alíquotas de 50 l de soro e os ensaios foram realizados em duplicata, no máximo 24 após a coleta do sangue dos animais.
4.13.2 Determinação da atividade da alanina aminotransferase (ALT)
A atividade enzimática da alanina aminotransferase foi avaliada pelo método descrito em Bergmeyer e Bernt, 1974no qual esta enzima catalisa a transferência do grupo amino da alanina para -
acetoglutarato, formando o glutamato e o piruvato. O piruvato formado reage com a 2,4-dinitrofenilhidrazina, dando a hidrazona correspondente, cuja intensidade da cor, em meio alcalino, foi medido no espectrofotômetro SHIMADZU-UV-1203 séries a 505 nm. Para o cálculo da atividade enzimática nas amostras de sangue foram utilizadas como padrões de referências, soluções do substrato e piruvato de sódio correspondentes à atividade enzimática de 46,8; 27,5 e 13,5 U/I. As absorbâncias dos padrões foram medidas no espectrofotômetro e utilizadas para o levantamento da curva padrão para obtenção do Fc, cujo valor foi utilizado no cálculo da concentração das amostras. Durante os ensaios, em duplicata, foram utilizadas alíquotas de 0,1 ml de soro.
4.13.3 Determinação da atividade de aspartato aminotransferase (AST)
A atividade enzimática da aspartato aminotransferase foi avaliada pelo método descrito por Bergmeyer e Bernt, 1974. A enzima catalisa a transferência do grupo amino do aspartato para -cetoglutarato, formando o glutamato e o oxaloacetato. O oxaloacetato formado reage com a 2,4-dinitrofenilhidrazina, produzindo a hidrazona correspondente, cuja intensidade da cor, em meio alcalino, foi medida no espectrofotômetro SHIMADZU-UV-1203 séries a 505 nm. Para o cálculo da atividade enzimática da enzima nas amostras de sangue foram utilizadas como padrões de referências, soluções de substrato e piruvato de sódio nas concentrações correspondentes à atividade enzimática de 91,6; 54,9; 29,4 e 11,6 U/I. As absorbâncias destes padrões foram utilizadas para o levantamento da curva padrão com a finalidade de se obter o Fc, cujo valor foi utilizado no cálculo das concentrações das
amostras de sangue. Durante os ensaios, em duplicata, foram utilizadas alíquotas de 0,1 ml de soro.
4.13.4 Determinação da atividade da gama glutamil transferase (GGT)
A atividade enzimática da gama glutamil transferase foi avaliada pelo método descrito por Szasa modificado, utilizando o kit da LABTEST.
A gama glutamil transferase catalisa a transferência do grupamento glutamil da L- -glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida para a glicilglicina, formando L- -glutamilglicilglicina e a p-nitroanilida.
A quantidade de p-nitroanilida formada de coloração amarelada, que apresenta elevada absorbância em 405 nm, é diretamente proporcional à atividade da GGT na amostra.
4.13.5 Determinação da concentração de uréia
A concentração de uréia nas amostras de soro foram avaliada pelo método da diacetilmonoxima, descrito por Moura et al., 1994 que se baseia na reação direta entre a uréia e a diacetilmonoxima (2,3- butadiona monoxima) na presença da tiossemicarbazida e íons cádmio em meio ácido.
Durante os ensaios, em duplicata, foram utilizadas alíquotas de 0,1 ml de plasma. Estas amostras foram imersas em água fervente durante 10 minutos para que ocorresse a reação entre a uréia e a diacetilmonoxima. Ao final da reação, as amostras apresentaram uma cor rosa-púrpura, cuja resultante foi proporcional à concentração de uréia.
Em seguida, foi adicionado 2ml da amostra na cubeta de vidro do espectrofotômetro SHIMADZU-UV-1203 séries e foi medida a 540 nm. Para o cálculo da concentração de uréia nas amostras de soro foram utilizadas como padrões de referências, soluções do substrato e piruvato de sódio correspondentes à atividade enzimática de 20, 40, 60, 80 e 100 mg/dl. As absorbâncias dos padrões foram medidas no espectrofotômetro e utilizadas para o levantamento da curva padrão para obtenção do Fc, cujo valor foi utilizado no cálculo da concentração das amostras.
4.13.6 Determinação da concentração de creatinina
A dosagem de creatinina plasmática foi realizada pelo método colorimétrico utilizando o kit da LABTEST, cujo princípio baseia- se no método de Jaffé (1886) modificado onde a creatinina reage com solução de picrato, em meio alcalino, produzindo um complexo de picrato de cratinina de cor amarelo-avermelhado. Decorridos os 10 minutos de incubação em banho-maria a 37 ºC, a adição do ácido acético 11,4 mol/L (acidificante) abaixa o pH para 5,0 bloqueando a reação e ao mesmo tempo promovendo a decomposição do picrato de creatinina, permanecendo inalterada a cor derivada dos cromogênos, que foram medidas espectrofotometricamente.