A avaliação interferência do OELaII na atividade antimicrobiana da Oxacilina 1µg (OXA01) e de outros antibióticos de uso clínico (CLO30, MPM10, CPM30, AMI30, CFO30 e CLI02) sobre as cepas de S. aureus testadas foi determinada pelo método de disco-difusão (Kirby-Bauer, 1966), modificado (OLIVEIRA et al., 2006).
Culturas de S. aureus contendo aproximadamente 1,5 x 108 UFC/mL foram preparadas conforme descrito no item 4.6.1. e inoculadas em superfície de Agar Mueller Hinton. Discos comerciais de agentes antimicrobianos (ATM) foram aplicados na superfície do meio e a cada disco foram adicionados 20 µL da CIM do OELaII, previamente determinada.
Para avaliar o efeito da combinação OELaII+ATM, discos de ATM, sem adição de OELaII foram testados para cada cepa de S. aureus. Após incubação das placas a 37°C/18h, foi realizada a leitura dos diâmetros dos halos de inibição (HI) de crescimento.
Os diâmetros dos halos de inibição de crescimento de cada associação OELaII+ATM foram comparados aos determinados pelo ATM isoladamente: valores superiores ou iguais a 2,0 mm foram considerados como indicação de sinergismo; a ocorrência de efeito indiferente foi considerada para diâmetros inferiores que 2,0 mm; e a obtenção de diâmetro inferior ao determinado pelo ATM isoladamente indicou efeito antagônico (CLEELAND; SQUIRES, 1991).
4.9 Avaliação da interferência do OELaII na atividade antimicrobiana da Oxacilina sobre cepas de S. aureus
A interferência do OELaII na atividade antimicrobiana da OXA também foi avaliada pelo Método de Checkerboard, como descrito por Cleeland e Squires (1991), utilizando-se, para isso, placas de cultura com 96 poços, de fundo redondo, estéreis e com tampas apropriadas.
Aos poços das placas foram adicionadas alíquotas de 100 µL de culturas microbianas contendo aproximadamente 106 UFC/mL, obtidas como descrito no item 4.6.1., 100 µL de caldo BHI, 25 µL OELaII e 25 µL Oxacilina.
Os valores de CIM de OELaII e de OXA, previamente determinados, foram utilizados para obtenção das diferentes combinações OELaII+OXA testadas. Foram usadas
concentrações finais iguais a 1/2, 1/4, 1/8, e 1/16 x CIM de OELaII e de OXA, associadas como esquema da Figura 13.
Figura 13 - Esquema utilizado para avaliação da interferência do OELaII na atividade antimicrobiana da Oxacilina sobre cepas de S. aureus, pelo método de Checkerboard.
Fonte: O autor (2012).
As placas de culturas, fechadas por tampas apropriadas, foram incubadas durante 24 horas em estufa bacteriológica a 35ºC. Após esse período foi realizada a inspeção visual do crescimento microbiano e a leitura das absorbâncias em leitora de Elisa Bio-Tek a 620nm. Os resultados obtidos foram avaliados quanto a interferência do OELaII na atividade antimicrobiana da OXA. Para isso, foram construídos gráficos do tipo isobologramas (utilizando-se as combinações nas quais não foi verificada crescimento microbiano) como descrito por Rosato et al. (2007) e calculado o Índice da Concentração Inibitória Fracionada (ICIF), obtido pela aplicação das fórmulas (EUCAST, 2000):
Oxacilina (CIM)
CIM óleo essencial L. alba na combinação CIF óleo essencial L. alba II =
CIM óleo essencial L. alba isolado
CIM Oxacilina na combinação CIF Oxacilina =
CIM Oxacilina isolada
ICIF = CIF óleo essencial L. alba II + CIF Oxacilina
Onde CIF = concentração Inibitória Fracionada
O Índice CIF (ICIF) foi interpretado como: efeito sinérgico para ICIF ᵞ 0,5, efeito aditivo ou indiferente para ICIF > 0,5 e < 1,0, e efeito antagonista para ICIF >1,0 (ROSATO et al., 2007).
4.10 Estudo do Mecanismo de Ação do OELaII sobre cepas de S. aureus
O estudo do mecanismo de ação do OELaII na inibição/morte do crescimento de cepas-padrão de S. aureus foi realizado pela avaliação da atividade antimicrobiana do óleo nas fases de crescimento exponencial e estacionário, assim como pela ação do cloranfenicol sobre o crescimento exponencial (MUROI; KUBO, 1996).
Curvas de crescimento das cepas-padrão de S. aureus foram determinadas previamente para que pudessem ser obtidas culturas microbianas nas fases de crescimento exponencial e estacionário. Para isso, culturas microbianas puras mantidas em ágar estoque sob refrigeração, foram repicadas para caldo BHI e incubadas a 35ºC durante 16-18h. Após esse período, as culturas tiveram sua densidade celular ajustada em solução salina 0,85% estéril, em aproximadamente 106 UFC/mL, com descrito no item 4.6.1.. As suspensões microbianas obtidas foram incubadas em estufa bacteriológica a 35ºC. O crescimento microbiano foi acompanhado pela contagem de colônias em meio sólido e a leitura de absorbância a 620nm, após 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 24 h, e os resultados expressos em UFC/mL.
4.10.1 Efeito do OELaII sobre cepas de S. aureus nas fases de crescimento exponencial e estacionário
Nos ensaios de determinação do mecanismo de ação do OELaII sobre cepas-padrão de S. aureus, foram utilizadas suspensões de S. aureus ATCC 6538P, S. aureus ATCC 14458, S. aureus ATCC 33591 e S. aureus CCBH 5330) contendo aproximadamente 106UFC/mL, obtidas como descrito no 4.6.1.. Alíquotas de 100 µL dessas culturas foram adicionadas a placas com 96 poços contendo 125 µL de caldo BHI em cada poço.
Nos tempos 0, 4 e 8 horas (fases exponencial de crescimento) e 24 horas (fase estacionária) de incubação a 35ªC foram adicionados 25 µL de OELaII, para obtenção de concentrações finais iguais a 1 e 2 x CIM (Figura 15), previamente determinada. A contagem das células viáveis foi determinada após 4 e 24 horas da adição de óleo essencial, e os resultados expressos em UFC/mL (MUROI; KUBO, 1996) (Figura 14).
Figura 14 - Esquema para a determinação do efeito do OELaII sobre cepas-padrão de S. aureus nas fases de crescimento exponencial e estacionário. A: tempos (0, 4, 8 24h) nos quais o OELaII foi adicionado ao inoculo microbiano em crescimento; B horários referentes ao plaqueamento, para tempo de contato igual a 4h; C horários referentes ao plaqueamento, para tempo de contato igual a 24h.
Fonte: O autor (2012). OELaII = 1 x CIM OELaII = 2 x CIM 25 µL B C A 106 UFC/mL 100 µL T(h) |---//---|---|---|---//---|---|---|---| 48 32 28 24 12 8 4 0 Plaqueamento e Incubação (35°C/24h)
Contagem de colônias e cálculo de Unidades Formadoras de Colônia (UFC /mL)
+
125 µL BHI
4.10.2 Efeito do OELaII sobre cepas de S. aureus na fase exponencial de crescimento, na presença de cloranfenicol.
Efeito do OELaII sobre S. aureus na fase exponencial de crescimento na presença de cloranfenicol foi determinado sobre culturas de cepas-padrão contendo aproximadamente 106 UFC/mL, obtidas como descrito no item 4.6.1.
As culturas bacterianas foram incubadas por 4 horas a 35ºC, sendo então fracionadas em seis grupos de tubos de ensaio (n=2). A dois desses grupos foram adicionados 25 µL de OELaII em concentração final de 1/2 e 1 x CIM ou 1 e 2x CIM. A um deles foram adicionados 25 µL de Tween 80 a 1%, como controle do experimento. Os outros três grupos foram tratados com 25 µL de cloranfenicol na concentração final de 5 µg/mL. O primeiro grupo tratado com cloranfenicol não recebeu a adição de OELaII, servindo de controle de inibição de divisão celular. Os outros dois grupos foram incubados por mais um período de 2h, para inibir a divisão celular, e então foi adicionado o OELaII (25 µL/poço) em concentração final de 1/2 e 1 x CIM ou 1 e 2x CIM. A contagem das células viáveis foi determinada após 2, 4, 6, 8 e 12 horas de incubação, e os resultados expressos em UFC/mL (MUROI; KUBO, 1996) (Figura 15).
Figura 15 - Esquema para a determinação do efeito do OELaII sobre cepas-padrão de S. aureus na fase de crescimento exponencial na presnça de cloranfenicol.
Fonte: O autor (2012).
4.11 Efeito do tempo de exposição ao OELaII, a Oxacilina e as associações