A elevada complexidade dos materiais lenhino-celulósicos só permite que estes sejam totalmente degradados na presença de sistemas multi-enzimáticos complexos. Assim, a aplicação de algumas dessas enzimas no tratamento de fibras do papel pode resultar na conveniente modificação das suas propriedades (Teeri, 1998). A utilização de enzimas com elevada afinidade pelos constituintes
processo (Pommier et al., 1989, 1990; Bhat et al., 1991; Jackson et al., 1993; Ryan et al., 1998b; Mansfield et al., 1999). Tendo em consideração que a celulose é o componente maioritário, a actividade celulolítica é considerada como determinante na modificação efectiva das características das fibras do papel.
As enzimas: actividade catalítica
Os estudos bioquímicos revelam que a modificação da celulose requer a presença de vários tipos de enzimas hidrolíticas, designadas genericamente por endoglucanases, exoglucanases ou celobiohidrolases e β-glucosidases. Todas apresentam especificidade para hidrolisar as ligações
β(1→ 4) glicosídicas, mas o seu modo de acção sobre a celulose é variável, provavelmente devido a diferentes arranjos estruturais (Secção “As enzimas: arranjo estrutural”). A ruptura da ligação glicosídica pode ocorrer segundo dois mecanismos, resultando ou não na inversão da configuração do carbono anomérico (Henrissat, 1994; Tuula, 1998). Este mecanismo é comum a quase todas as glicanases, nomeadamente às xilanases (apresentadas a seguir) (Prade, 1995).
Estas enzimas podem actuar sinergeticamente, dependendo da natureza do substrato, da dosagem e da razão de concentração entre elas. O mecanismo hidrolítico proposto é apresentado na Figura 1.35. (Henrissat, 1994; Béguin e Aubert, 1994; Tuula, 1998).
A utilização de hemicelulases na modificação das fibras está essencialmente associada à aplicação de xilanases. A heterogeneidade das hemiceluloses, nomeadamente do xilano, exige, tal como a celulose, um sistema enzimático (cooperativo) complexo para que a sua solubilização completa ocorra (Sunna e Antranikian, 1997). A actividade hidrolítica mais importante está associada às endoxilanases e às β-xilosidases, mas a presença de α-arabinofuranosidases, α-glucuronidases e acetilxilano esterases também é necessária:
• As endoxilanases hidrolisam as ligações glicosídicas no interior das cadeias de xilano, resultando na despolimerização acentuada do substrato; o ataque não é aleatório e depende da natureza do xilano (comprimento, ramificação e grau de substituição da cadeia).
• As β-xilosidases são exoglucosidases que hidrolisam xilo-oligossacarídeos curtos e xilobiose a partir do terminal não-redutor, libertando xilose; ao degradarem a xilobiose (pela qual têm grande afinidade), reduzem a acção inibitória que esta exerce sobre as endoxilanases. A formação de xilose inibe a acção das β-xilosidases.
• As α-arabinofuranosidases, α-glucuronidases e acetilxilano esterases permitem a remoção dos grupos de substituição nos heteroxilanos, aumentando a acessibilidade das cadeias à acção das
endoxilanases e das β-xilosidades; entre elas, o efeito sinergético está associado ao aumento da acessibilidade dos grupos de substituição que permanecem. Algumas são activas em substratos poliméricos intactos; outras só hidrolisam oligossacarídeos curtos (obtidos pela acção das endoxilanases).
Em cada grupo, existem enzimas com especificidade diferente relativamente ao substrato, pelo que o efeito sinergético também ocorre entre enzimas do mesmo tipo (por exemplo, entre endoxilanases que actuem sobre substratos ramificados e não ramificados).
Tendo em consideração que a constituição intricada das fibras condiciona a acessibilidade das xilanases ao xilano estrutural, o aumento da efectividade destas enzimas exige geralmente a combinação com outras actividades hidrolíticas (nomeadamente a celulolítica) ou tipos de tratamento (por exemplo, tratamentos químicos ou mecânicos) (Suurnäkki et al., 1996a; Gübitz et al., 1997; Ryan
et al., 1998a).
Tendo em consideração a especificidade e modo de acção, é usual a classificação das celulases como:
1) endoglucanases, efectivas na degradação de celulose amorfa, atacam aleatoriamente as ligações glicosídicas no interior da cadeia celulósica e aumentam o número de sítios disponíveis para a intervenção das exoglucanases; conduzem a uma despolimerização rápida do substrato.
2) exoglucanases ou celobiohidrolases degradam eficazmente as regiões cristalinas da celulose mediante a clivagem de dímeros de celobiose nas extremidades (redutora ou não-redutora) das cadeias celulósicas; o seu modo de acção está associado a uma despolimerização lenta do substrato.
3) β-glucosidases hidrolisam a celobiose a glucose, minimizando a acção inibitória que a presença de celobiose exerce sobre as actividades endo- e exo-glucanolíticas.
Na figura, os hexágonos a cheio representam as extremidades redutoras das moléculas de celulose.
Enzimas: arranjo estrutural
A maioria das celulases são compostas por dois domínios globulares, funcional e estruturalmente distintos (Figura 1.36.). O domínio catalítico, é responsável pela actividade hidrolítica; o domínio de ligação (CBD), é responsável pela ligação da enzima ao substrato. Em função do seu arranjo estrutural e composição, os domínios (hidrolíticos ou de ligação) podem ser agrupados em famílias; a existência de várias conformações torna possível um elevado número de combinações e aumenta a diversidade das enzimas. Os dois domínios são ligados por um péptido relativamente longo e flexível. Esta estrutura modular não é restrita às celulases, tendo já sido reconhecida noutras enzimas, nomeadamente algumas xilanases, quitinases, mananases (Henrissat, 1994; Prade, 1995).
Figura 1.36.: Estrutura das celulases (apresentado em Henrissat, 1994).
O estudo da organização estrutural dos domínios catalíticos permite justificar (pelo menos em parte) o diferente modo de acção das várias enzimas sobre os substratos. As endoglucanases tem centros activos relativamente abertos em comparação com os das exoglucanases, o que facilita a sua intervenção no interior das cadeias de celulose. Pelo contrário, as exoglucanases têm centros activos com conformação em forma de túnel, o que provavelmente limita a sua acção às extremidades das cadeias. Há no entanto enzimas em que esta relação (conformação/actividade) não se verifica (Teeri, 1998).
Para que a degradação dos substratos insolúveis seja efectiva, é indispensável que estes domínios se encontrem ligados a domínios de ligação. Ao contrário do que se verifica no caso dos substratos solúveis, a solubilização decresce acentuadamente quando a hidrólise decorre na presença de enzimas cujo CBD foi removido (Henrissat, 1994; Kilburn et al., 1990; Teeri, 1998; Suurnäkki et al., 1998, 2000). Apesar de se saber que a presença dos CBD’s é necessária à actividade das enzimas celulolíticas, a sua função na hidrólise não está ainda totalmente esclarecida. Além de serem responsáveis pela adsorção da enzima à superfície do substrato, dando início ao processo hidrolítico, admite-se que possam desorganizar as cadeias de celulose de modo a aumentar a área disponível para ligação com outras enzimas e a facilitar a hidrólise (o entumecimento da estrutura celulósica aumenta a acessibilidade do domínio catalítico).
A afinidade dos CBD’s relativamente à celulose é variável, mas todos apresentam a capacidade de se ligarem de modo dinâmico, permitindo a processividade das exoglucanases e a mobilidade das endoglucanases. A sua relevância na actividade hidrolítica dos domínios catalíticos depende do tipo de enzima em questão: no caso das exoglucanases, a presença dos CBD’s aumenta a efectividade do domínio catalítico; no caso das endoglucanases, pode não causar alterações significativas (Suurnäkki
et al., 2000).
Assim como as dos CBD’s, as funções dos “ligantes” são ainda motivo de investigação. Apesar de se ter verificado que a sua presença é necessária ao desempenho adequado dos dois domínios constitutivos (de modo a evitar que estes se obstruam mutuamente), a sua função exacta é ainda desconhecida. Uma das hipóteses apontadas é que possam contribuir para que o domínio catalítico não desnature após a adsorção do domínio de ligação: uma das causas da adsorção irreversível (ou pouco reversível) das proteínas em superfícies sólidas é a sua desnaturação; no caso da desnaturação ocorrer nos CBD’s, a presença do “ligante” evitaria que ela se transmitisse ao domínio catalítico, preservando a sua configuração e actividade (Henrrisat, 1994).
Tal como nas celulases, o arranjo e composição das xilanases permite que sejam classificadas em famílias. As famílias de xilanases estão divididas em dois grupos: as xilanases ácidas de elevado peso molecular (> 30 kDa) e as básicas de baixo peso molecular (< 30 kDa) (Prade, 1995).
A efectividade das enzimas no tratamento das pastas
O principal problema no tratamento enzimático das pastas de papel está relacionado com a complexidade das interacções enzima/substrato, cuja compreensão é indispensável à optimização desta técnica. A variabilidade de substratos disponíveis na indústria papeleira condiciona a eficiência das enzimas e dificulta a optimização dos métodos biológicos (Suurnakki et al., 1996; Mooney et al., 1998). De facto, a acção das enzimas varia em função da composição inicial da pasta a tratar, provavelmente em consequência da diferente acessibilidade e digestibilidade da matriz fibrosa. Alguns dos factores que limitam a hidrólise são: (i) a natureza da fibra (porosidade, área superficial específica, organização molecular dos constituintes das fibras); (ii) o grau de organização molecular dos componentes; (iii) o conteúdo em lenhina; e (iv) o estado da superfície das fibras, nomeadamente pela presença de produtos aditivos.
Além das características do substrato, a especificidade e as propriedades das enzimas afectam a extensão da degradação. Alguns factores relevantes são: (i) a processividade, ou seja, a capacidade que
libertarem completamente o substrato; (ii) a não-produtividade da ligação, ou seja, a frequência com que as enzimas se ligam ao substrato numa conformação não adequada ao acto catalítico; (iii) a extensão relativa das actividades endo- e exoglucanolíticas; (iv) a extensão relativa da actividade exoglucanolítica em cada um dos terminais da cadeia celulolítica; e (vi) a reversibilidade/irreversibilidade da adsorção.
Finalmente, devem ainda considerar-se as condições em que o tratamento decorre, uma vez que estas afectam o comportamento das enzimas relativamente a um dado substrato, nomeadamente a adsorção (Senior et al., 1990; Kaya et al., 1994; Buchert et al., 1993). As variáveis de processo mais importantes são:
(i) a consistência das pastas: a operação a consistência elevada favorece a adsorção enzimática provavelmente porque permite a redução das tensões de corte na suspensão (menor desnaturação) e aumenta a superfície de ligação disponível na vizinhança das enzimas;
(ii) a agitação: a agitação moderada promove a adsorção pois garante a dispersão da enzima na suspensão, tornando-a acessível a novas superfícies de ligação; pelo contrário a agitação intensa (aumento da tensão de corte) é responsável pela desactivação enzimática;
(iii) o tempo de reacção: a manipulação das enzimas durante períodos de tempo longos resulta na sua desnaturação ou perda de actividade; a extensão das alterações depende da agressividade das condições operatórias;
(iv) a temperatura: a temperatura do processo pode provocar alterações de conformação nas enzimas, tornando-as incapazes de adsorver e degradar os substratos; em condições extremas, causa a sua desnaturação;
(iv) o ambiente químico: o pH afecta o entumecimento e a carga superficial das fibras, alterando a acessibilidade à matriz fibrosa e a adsorção das enzimas; a concentração de metais pesados na suspensão pode inibir a acção enzimática.
Tendo em consideração a importância das relações substrato/enzima/condições operatórias, a probabilidade de seleccionar enzimas adequadas a um determinado processo é mais elevada se forem tidos em conta os seguintes aspectos: (i) especificidade; (ii) peso molecular das enzimas (baixo, de modo a facilitar a penetração nas fibras); (iii) actividade e estabilidade nas condições de processo; (iv) ponto isoeléctrico (a adsorção é mais efectiva se as enzimas estiverem carregadas positivamente, ou seja, com carga contrária à superfície das fibras).
Mecanismos para modificação enzimática das fibras
A acção das enzimas (celulases e/ou hemicelulases) sobre as fibras pode resultar no aumento da resistência do papel e/ou da drenabilidade das pastas. Estas alterações são geralmente consideradas como consequência de uma melhor ligação entre fibras e da diminuição das interacções fibra/água. O mecanismo responsável pela modificação enzimática das fibras permanece ainda em estudo. O conhecimento desses mecanismos é essencial à aplicação correcta das enzimas, em função dos benefícios pretendidos. Segue-se uma breve descrição das interpretações que se propõem justificar as alterações detectadas.
Com base nos trabalhos de Lee et al. (1983) e Oltus et al. (1987), Pommier e colegas (1989) descrevem o mecanismo de acção enzimática como um efeito de “descascamento”. Os autores sugerem que as enzimas promovem a desfibrilação da superfície das fibras, removendo material com elevada área superficial específica e elevada afinidade pela água, mas que pouco contribui para o potencial de ligação das fibras. A modificação das interacções água/fibra favorece a drenabilidade sem afectar as propriedades mecânicas do papel. A perda de resistência e de drenabilidade só ocorre quando as fibras são danificadas em resultado de uma acção enzimática extensa: as pastas modificam- se, verificando-se a redução do tamanho médio das fibras e o aumento da percentagem de finos em suspensão.
No caso das fibras primárias, a actividade das enzimas é direccionada essencialmente para melhorar o potencial de ligação das fibras, uma vez que a capacidade de drenagem das pastas primárias é geralmente elevada. Em condições adequadas, a desorganização da camada exterior da parede celular favorece a flexibilidade e aumenta os pontos de ligação entre as fibras (Mansfield et al., 1999).
Jackson et al. (1993) sugerem que as enzimas podem actuar como adjuvantes de floculação ou hidrolisar os finos e os componentes celulósicos e hemicelulósicos acessíveis nas regiões expostas no exterior das fibras, limpando a sua superfície. De acordo com estes autores, a “floculação enzimática” ocorre quando a dosagem de enzima aplicada é baixa: os finos e fibras pequenas agregam, entre si ou em redor de fibras maiores, reduzindo a quantidade de material de pequenas dimensões em suspensão e melhorando a capacidade de drenagem. Quando a concentração de enzima aumenta, o mecanismo de floculação é menos significativo e a fragmentação das fibras tende a predominar.
Esta teoria não é aplicável a todas as situações. De facto, a especificidade das enzimas deve ser considerada, podendo em alguns casos conduzir a alterações substanciais nas propriedades de resistência do papel, mesmo quando a concentração de enzima é reduzida: Pere et al. (1995) verificaram que a aplicação de endoglucanases em dosagens poucos significativas reduz a viscosidade
responsável pela melhoria da drenabilidade (Jackson et al., 1993; Stork et al., 1995; Viesturs
et al., 1996).