Mental Representation of Fictional Characters

da doença de Chagas

A infecção pelo T. cruzi induz a ativação do sistema imune humoral para a produção de anticorpos capazes de atuar na defesa do organismo contra o parasito. O estabelecimento de métodos de diagnóstico para a pesquisa de anticorpos anti-T. cruzi, de diferentes classes e subclasses, que apresentem altas especificidade e sensibilidade tem sido alvo de muitos estudos.

Um dos objetivos do nosso trabalho foi verificar o desempenho da técnica de ELISA, desenvolvida e utilizada rotineiramente em nosso laboratório para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas, realizando a pesquisa de IgG total e suas subclasses IgG1, IgG2 e IgG3 em pacientes com diferentes manifestações clínicas da doença. A escolha da pesquisa de apenas três das quatro subclasses de IgG produzidas por seres humanos foi baseada nos níveis desses anticorpos detectados. Como já demonstrado por outros trabalhos, as subclasses IgG1, IgG2 e IgG3 são as de maior representatividade no soro humano (HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001; CERBAN et al., 1993; KAWANO et al., 1994).

Para a análise desses resultados não podemos deixar de considerar que os pacientes avaliados no estudo apresentam alta reatividade sorológica, pois fizeram parte desse trabalho aqueles cuja sorologia foi positiva na técnica de ELISA (reação de alta sensibilidade) simultaneamente a HAI, reação de baixa sensibilidade que em nossa experiência pessoal é positiva em apenas 80,0% dos pacientes reativos na ELISA. A alta reatividade dos soros dos pacientes selecionados foi posteriormente confirmada pela realização da reação de Imunofluorescência Indireta no grupo de pacientes que não fez parte do nosso estudo e que apresentou resultados discordantes entre estes dois testes (ELISA positiva e HAI negativa). Nesses pacientes com sorologia discordante, a taxa da positividade da terceira técnica foi de 85,0%.

A primeira etapa da avaliação sorológica consistiu no estabelecimento de critérios de interpretação para a reatividade de IgG e subclasses de IgG utilizando a

técnica de ELISA não comercial aplicada ao diagnóstico da doença de Chagas. Os anticorpos IgG total e IgG3 apresentaram os maiores índices de DO para todas as oito diluições de soro testadas (1:10 a 1:1.280), seguidos por IgG2 e IgG1. Nossos resultados, mesmo considerando a alta reatividade de todos os pacientes avaliados, contradizem alguns estudos que detectaram níveis mais elevados de IgG1, em soros de pacientes com infecção chagásica testados em apenas uma diluição de soro (HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001; CERBAN et al., 1993; MICHAILOWSKY et al., 2003; MORGAN et al., 1996; CORDEIRO et al., 2001). Alguns desses estudos detectaram IgG2 em níveis mais elevados (HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001; CORDEIRO et al., 2001), seguido por IgG3. Em outros foram verificados níveis mais elevados de IgG3 seguido por IgG2 (CERBAN et al., 1993; MICHAILOWSKY et al., 2003; MORGAN et al., 1996). Provavelmente, as diferenças nos níveis de anticorpos encontradas em outros trabalhos se devem a variáveis como a preparação antigênica utilizada, a população estudada e os diferentes protocolos das técnicas sorológicas aplicadas.

As faixas de diluição do soro capazes de discriminar as medianas de DO de todos os pacientes com infecção chagásica e grupo controle para cada imunoglobulina foram selecionadas por meio da análise estatística. Essas faixas de diluição foram diferentes para cada imunoglobulina. Para IgG total e IgG3, variaram de 1:10 a 1:1.280, com uma ampla diferença nas DOs do grupo com infecção chagásica e do grupo controle em todas as diluições testadas. A subclasse IgG2 também apresentou as diluições de soro selecionadas de 1:10 a 1:1.280, entretanto os valores de DO do grupo com infecção chagásica e do grupo controle foram mais próximos, especialmente nas quatro últimas diluições de soro testadas. Para IgG1 as diluições de soro selecionadas foram mais restritas (1:10 a 1:160), evidenciando a menor capacidade para essa imunoglobulina em diferenciar infectados de não infectados em diluições mais altas do soro. Esses resultados refletem os níveis de cada imunoglobulina detectada, demonstrando que os anticorpos com mais ampla capacidade de discriminação entre indivíduos com infecção chagásica e não infectados em nosso estudo são IgG total e IgG3.

Para a avaliação do desempenho da técnica foram feitas as análises das curvas ROC que possibilitaram a identificação das diluições de cada imunoglobulina que apresentaram os maiores índices de sensibilidade, especificidade e ASC. Para IgG total todas as diluições avaliadas pela curva ROC apresentaram excelente desempenho, com

sensibilidade e especificidade de 100,0%, e ASC igual a 1,000. Esse seria um teste perfeito, capaz de detectar com 100,0% de certeza todos os indivíduos com infecção chagásica como reativos, e os não infectados como não reativos. Para IgG1 e IgG2 foi demonstrada uma limitação maior dessas imunoglobulinas para o desempenho da técnica. As diluições 1:10 a 1:40 apresentaram os melhores valores de sensibilidade, especificidade e ASC e apenas a diluição 1:10 apresentou valores de um teste perfeito para ambas as subclasses de imunoglobulinas. Para a pesquisa de IgG3 os melhores resultados foram com as diluições 1:10 a 1:320. No entanto, para IgG3, em nenhuma dessas diluições os valores de sensibilidade, especificidade e ASC garantiram que o teste fosse considerado perfeito, apesar do excelente desempenho da técnica.

A análise das curvas ROC verificou que na maioria das diluições utilizadas para a pesquisa de IgG1, IgG2 e IgG3 a especificidade apresentava-se mais elevada em relação a sensibilidade, indicando que o antígeno aplicado na técnica apresenta bom desempenho. Até o momento, não existe um teste sorológico disponível para o diagnóstico da doença de Chagas que apresente 100,0% de sensibilidade e especificidade, e é exatamente em busca desse resultado que diversos estudos têm sido realizados (MATSUMOTO et al., 1993; PRIMAVERA et al., 1990; UMEZAWA et al., 2004; UMEZAWA et al., 2003). Os kits de diagnóstico imunoenzimáticos disponíveis no mercado apresentam valores de especificidade de 93,3 a 100,0%, e sensibilidade de 97,7 a 100,0%, sendo constante a elevada sensibilidade com especificidade variável (OELEMANN et al., 1998). Em um estudo mais recente, cinco kits de ELISA comercialmente disponíveis foram avaliados para a determinação da sua acurácia no diagnóstico da doença de Chagas, demonstrando que os kits que usam antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos são mais específicos do que aqueles que usam antígenos íntegros, embora a sensibilidade seja variável (CABALLERO et al., 2007).

Para a determinação final de quais diluições seriam as mais aplicáveis para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas utilizando a técnica de ELISA não comercial, foi introduzida ainda a análise da variável DOmediana. A escolha dessa

variável foi baseada no fato de todas as nossas análises entre grupos de pacientes terem sido efetuadas com a observação das medianas das DOs. Foi estabelecido o valor de DOmediana igual ou superior a 0,200 para a seleção das diluições mais seguras para o

diagnóstico da doença de Chagas. Para IgG total e IgG3 as diluições de soro de 1:10 a 1:320 apresentaram os maiores valores de DOmediana, possibilitando o diagnóstico

seguro da doença de Chagas. Para IgG1 apenas a diluição 1:10 apresentou segurança para o diagnóstico, e para IgG2 foram selecionadas as diluições 1:10 e 1:20. Ressalta- se que para IgG3 e IgG2 mesmo nas diluições selecionadas com rigor pelas análises, houve pacientes com valores de DO abaixo do ponto de corte, o que seria um problema para o uso dessas diluições de soro. Para essas duas imunoglobulinas poderíamos pensar na aplicação do teste utilizando apenas a primeira diluição testada, entretanto, foi observado que até mesmo na diluição de soro mais baixa um paciente apresentou DO abaixo do PC para IgG3. Exatamente para uma análise mais refinada de qual seria a diluição mais aplicável ao diagnóstico em meio a uma população que pode conter indivíduos com diferentes características e passíveis de possuírem outras infecções, a próxima etapa do nosso trabalho foi realizada.

A seleção de quais diluições seriam aplicadas ao diagnóstico da doença de Chagas foi compatível com os níveis de IgG e subclasses de IgG detectados nos soros dos pacientes com infecção chagásica. Estes apresentaram em geral altos valores de DO para IgG total e IgG3 em toda a curva de titulação dos soros. Já IgG2 e IgG1 apresentaram valores mais baixos de DO os quais decresceram mais precocemente nas curvas de titulação.

5.3.2 Pesquisa da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio do