Dehumanization by Theories in Science

morbidade da doença de Chagas

A tentativa de associação entre perfil imunológico e manifestações clínicas em pacientes com doença de Chagas apresentando formas clínicas distintas, tem sido objeto de estudo em diferentes grupos de pesquisa. A busca de um marcador que possibilite a distinção entre indivíduos com diferentes manifestações clínicas, e até mesmo que indique uma possível evolução para formas mais graves da doença é de grande importância, considerando que intervenções podem ser feitas para retardar a progressão da doença (CORDEIRO et al., 2001; SOLANA, et al., 1995).

Os fatores responsáveis pelos padrões distintos de imunoglobulinas produzidos são importantes para o esclarecimento dos mecanismos humorais indutores de proteção ou patogênese na doença de Chagas. Entretanto, estudos associando o

perfil de anticorpos produzidos e as manifestações clínicas desenvolvidas na doença de Chagas ainda são restritos.

Feitas estas considerações a última etapa do nosso estudo foi avaliar a aplicabilidade da pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi realizada pela técnica de ELISA não comercial aplicada a monitoração de morbidade da doença de Chagas.

A análise dos soros dos pacientes com diferentes formas clínicas em todas as diluições testadas possibilitou verificar que os níveis de IgG total e IgG3 foram os mais elevados e próximos entre si, seguidos por IgG2 e IgG1, respectivamente. A análise das medianas de DO dos quatro grupos com diferentes formas clínicas (IND, CARD 1, CARD 2 e DIG/MIS) possibilitou verificar que IgG total apresentou diferença significativa entre os diversos grupos clínicos nas diluições de 1:10 a 1:1.280, IgG1 nas diluições 1:10 e 1:20, IgG3 nas diluições 1:10 a 1:80 e que IgG2 não apresentou diferença significativa entre os grupos clínicos em nenhuma diluição de soro.

Para IgG total o grupo DIG/MIS apresentou valores de DO mais elevados, sendo esse grupo diferente estatisticamente de IND, CARD 1 e CARD 2 em todas as oito diluições testadas. Apenas na diluição 1:640 o grupo IND foi também diferente estatisticamente de CARD 1. Sendo assim nossos resultados indicam uma relação entre níveis mais elevados de IgG total em pacientes com manifestações digestivas puras ou mistas. A análise estatística aplicando o teste de correlação demonstrou que a correlação positiva encontrada entre as diferentes formas clínicas e IgG total em todas as diluições de soro indica que os dois fenômenos variam no mesmo sentido sendo possível associar níveis elevados dessa imunoglobulina em pacientes com diferentes manifestações clínicas da doença de Chagas, independente da gravidade da forma clínica, apesar dos valores de DO mais elevados no grupo DIG/MIS. Assim, foi possível verificar que a correlação positiva encontrada em todas as diluições de soro indica uma associação progressiva entre níveis mais elevados de IgG total e formas mais graves da doença de Chagas, como evidenciado nos gráficos de dispersão, que apresentam retas crescentes em direção ao grupo DIG/MIS. Entretanto, essa análise não nos permite afirmar a existência de uma correlação entre níveis progressivamente mais elevados de IgG total e evolução clínica da doença de Chagas, já que para o grupo CARD 2 os valores de DO foram em sua maioria inferiores aos valores de DO do grupo CARD 1 em todas as diluições de soro.

Alguns estudos avaliaram níveis de IgG total e outros anticorpos, na tentativa de associar elevação dessas imunoglobulinas e gravidade da forma clínica manifestada pelos indivíduos com infecção chagásica, identificando associação entre IgG e manifestações clínicas. Assim, GUSMÃO et al. (1982) avaliaram os níveis de IgG de 217 pacientes com diferentes formas clínicas da doença de Chagas de Goiás, divididos em quatro grupos clínicos distintos. Os testes sorológicos utilizados foram a reação de fixação do complemento, hemaglutinação indireta e ELISA. A média dos níveis de anticorpos na ELISA e na fixação do complemento entre os grupos distintos não demonstrou diferença significativa. Entretanto, através da hemaglutinação indireta foi possível verificar títulos ligeiramente mais elevados de anticorpos em pacientes apresentando alterações digestivas e cardiomiopatia severa, quando comparados com os pacientes nas formas indeterminada e cardíaca moderada. Em um estudo seccional ZAUZA, (2000) avaliou 835 pacientes com infecção chagásica do município de Virgem da Lapa, vizinho de Berilo, verificando níveis mais elevados de IgG por meio das técnicas de Imunofluorescência Indireta e hemaglutinação indireta nos indivíduos apresentando forma cardíaca da doença de Chagas. ZAUZA et al. (2001), avaliando 140 pacientes com infecção chagásica do mesmo município em um período de dez anos, verificaram um aumento estatisticamente significativo dos níveis de IgG no grupo de pacientes com evolução progressiva de cardiopatia. Esses resultados indicaram uma associação direta entre os níveis séricos desses anticorpos e a evolução da cardiopatia chagásica.

Em outro estudo a associação entre níveis de IgG e formas clínicas não foi evidenciada. PRIMAVERA et al. (1990) avaliaram os níveis de IgG, IgM e IgA em 506 soros de pacientes apresentando infecção chagásica aguda e crônica com diferentes manifestações clínicas (formas indeterminada, cardíaca e digestiva), soros de pacientes com outras infecções não relacionadas e soros de indivíduos saudáveis. Duas preparações antigênicas distintas (formas amastigotas e tripomastigotas) foram testadas em comparação aos antígenos de epimastigotas de extrato bruto utilizados convencionalmente na imunofluorescência indireta, demonstrando as formas amastigotas serem as melhores fontes de antígenos para a detecção desses anticorpos. Nesse estudo, anticorpos IgG anti-amastigota foram detectados em todos os indivíduos com infecção chagásica sem diferença entre os pacientes apresentando diferentes formas clínicas. Entretanto, IgA e IgM foram encontrados predominantemente em pacientes com manifestações digestivas e na fase aguda.

Provavelmente, a discordância entre esses resultados possa ser atribuída em parte aos diferentes intervalos de tempo estabelecidos para cada estudo, ao número de pacientes avaliados e sua origem, às diferenças de população de T. cruzi neles encontradas, e as variações das diferentes técnicas sorológicas empregadas.

A pesquisa das subclasses de IgG em nosso estudo revelou que para IgG1 na diluição de soro 1:10 os pacientes do grupo IND apresentaram diferença significativa na DO em relação ao grupo CARD 1, e na diluição 1:20 o grupo IND foi diferente estatisticamente de CARD 1 e CARD 2. IgG3 foi a subclasse de anticorpo que apresentou os maiores valores de DO para todos os pacientes avaliados. A análise de IgG3 revelou ainda que pacientes do grupo IND apresentaram diferença significativa em relação aos grupos CARD 2 e DIG/MIS nas diluições de soro 1:10 a 1:80. A subclasse IgG2 não demonstrou diferença nos níveis de DO obtidos para os quatro grupos de formas clínicas avaliados.

Alguns trabalhos também sugerem níveis mais elevados de IgG1 e IgG3, sem associação direta com formas clínicas. CERBAN et al. (1993) avaliaram 28 pacientes assintomáticos e com manifestações cardíacas provenientes de uma área endêmica na Argentina, que apresentavam idades entre 20 a 40 anos. Nesse estudo foi testada a reatividade de IgG1, IgG2 e IgG3, por ELISA e immunobloting, com a utilização de dois tipos de antígenos, a fração acídica do citosol e formas epimastigotas. Foram encontrados níveis mais elevados de todas as subclasses de IgG nos pacientes com manifestações cardíacas mais graves. Nesse estudo foi detectada uma alta prevalência de IgG1 e IgG3, com níveis mais baixos de IgG2 e IgG4, quando formas epimastigotas foram usadas como antígeno. Quando a fração acídica do citosol foi empregada, IgG1 foi a principal subclasse detectada em todos os pacientes avaliados como já demonstrado por vários autores e diferentemente de nossos resultados. Apesar de os pacientes cardíacos apresentarem níveis mais elevados de todos os anticorpos testados, nesse trabalho não houve associação de nenhuma subclasse de IgG com o grupo de pacientes cardíacos.

MICHAILOWISKY et al. (2003), e SOLANA et al. (1995) corroboraram os resultados de CERBAN et al. (1993) ao detectarem níveis mais elevados de IgG1 e IgG3 em todos os pacientes avaliados. No primeiro estudo, pacientes assintomáticos e com manifestação cardíaca, oriundos de Minas Gerais, apresentaram níveis de IgG1 e IgG3 mais elevados na técnica de ELISA, porém utilizando antígenos paraflagelares derivados de T. cruzi. SOLANA et al. (1995) avaliaram a reatividade de 100 pacientes

com diferentes formas clínicas, provenientes da Argentina e do Brasil para essas subclasses de imunoglobulinas, utilizando a técnica de ELISA com uma fração ribossomal de epimastigotas como antígeno. A distribuição dos isotipos de anticorpos revelou que 100,0% dos pacientes apresentavam IgG1, 85% IgG3 e 50% IgG2. Mais uma vez, nenhuma associação entre as diferentes manifestações clínicas e o perfil de subclasses foi encontrada.

A dosagem das subclasses de IgG de duas populações indígenas (Mataco e Toba) portadoras de infecção chagásica da Argentina através da técnica de ELISA demonstrou níveis similares de IgG1 para ambas, com diferença na produção de IgG2, IgG3 e IgG4, sendo entretanto, mais elevados os níveis de IgG1 e IgG3 nas duas populações (MOTRAN et al., 1994).

Em outros trabalhos, a associação entre a subclasse IgG2 e cardiopatia foi observada. Assim como nos estudos anteriores, MORGAN et al. (1996), detectaram níveis mais elevados de IgG1 e IgG3 em todos os pacientes avaliados. Entretanto, foi observada uma associação entre níveis de IgG2 mais elevados e formas cardíaca e cardio-digestiva não observada em nossos estudos e em vários outros citados anteriormente. Nesse trabalho de MORGAN et al., foram utilizadas formas epimastigotas como antígeno na técnica de ELISA, para avaliar 73 pacientes de uma área endêmica de Minas Gerais, que apresentavam as formas clínicas indeterminada, cardíaca, digestiva e mista, com idades variando entre 20 e 84 anos. Os níveis de IgG1 foram mais elevados em todos os pacientes, mas sem diferença entre os níveis de IgG1 e IgG3 nos diferentes grupos clínicos avaliados. Este mesmo grupo de pesquisa, avaliou ainda a especificidade das diferentes subclasses de IgG por meio da técnica de western blot em relação a diferentes antígenos em pacientes com formas clínicas distintas da doença de Chagas. Foi observado que algumas subclasses de anticorpos ligavam prevalentemente a alguns antígenos em determinados grupos de formas clínicas quando comparados com outros. Isto é, independentemente do grupo clínico, os perfis de antígenos reconhecidos por cada isotipo de anticorpo diferiam entre si. Esse resultado indicou correlação entre níveis de subclasses de IgG e forma clínica, já que bandas de IgG3 foram encontradas predominantemente em pacientes na forma indeterminada e digestiva, enquanto bandas de IgG2 foram predominantes em pacientes na forma cardíaca (MORGAN et al., 1998).

VERÇOSA et al. (2007) utilizaram antígenos flagelares (FRA) e citoplásmicos (CRA) para analisar o perfil de subclasses de IgG de pacientes

apresentando diferentes manifestações clínicas, através da técnica de ELISA, verificando que IgG2 anti-FRA foi a subclasse detectada em níveis mais elevados nos pacientes com acometimento cardíaco. As outras subclasses foram detectadas em quase todos os pacientes avaliados, sendo que apenas IgG2 apresentou níveis significativamente mais elevados no grupo cardíaco em relação às outras formas clínicas. Foi sugerido pelo estudo que IgG2 poderia ser um bom marcador para monitoração da progressão da doença, assim como fator preditivo para risco cardíaco.

Entretanto, outros grupos encontraram diferentes resultados quando avaliaram a produção dessas subclasses de IgG. HERNANDEZ-BECERRIL et al. (2001) avaliaram 12 pacientes com idades entre 34 e 67 anos, que apresentavam cardiopatia, provenientes de áreas rurais do México, através da técnica de ELISA, empregando antígenos íntegros de T. cruzi. Esses autores verificaram que os níveis de IgG1 e IgG2 foram mais elevados que IgG3 em todos os pacientes analisados. Nesse estudo, constatou-se que os pacientes com cardiomegalia severa apresentavam níveis mais elevados de IgG2, produzindo uma associação direta entre essa forma clínica e a subclasse IgG2, como já demonstrado por MORGAN et al. (1996), fato este não verificado em nosso estudo.

CORDEIRO et al. (2001) descreveram o predomínio de IgG1 e IgG2 nos anticorpos da sorologia convencional, enquanto IgG1 e IgG3 predominaram na pesquisa de anticorpos líticos quando foi utilizada a técnica de citometria de fluxo e epimastigotas fixados e tripomastigotas vivos como antígenos. Anticorpos IgG3 foram também predominantes em nosso estudo embora a metodologia empregada por nós tenha sido a técnica de ELISA. Os anticorpos líticos são considerados os responsáveis pelo mecanismo de lise mediada pelo Complemento. A estes anticorpos é atribuído importante papel no controle da parasitemia em pacientes com infecção chagásica crônica (KRETLLI e BRENER, 1982) além de mediarem o fenômeno de ADCC (antibody-dependent-citotoxic cell) que ocorre na infecção chagásica (LIMA- MARTINS et al., 1985). Segundo estes autores os anticorpos líticos presentes no soro humano seriam IgG1 e IgG2, entretanto ainda há controvérsia sobre o papel de IgG1 na lise mediada pelo Complemento.

O mecanismo de lise mediada pelo Complemento pode ser observado por experimentação “in vitro” apenas quando tripomastigotas vivos são empregados como antígenos, não sendo detectado quando são utilizados antígenos de formas epimastigotas do parasito morto ou fixado, íntegro ou não, comumente empregadas no

diagnóstico sorológico da doença de Chagas (KRETLLI e BRENER, 1982). Desta forma constatou-se que existe uma dissociação entre os anticorpos detectados no diagnóstico da infecção chagásica e os anticorpos protetores e responsáveis pela resistência ao parasito. Tais evidências levaram esses autores a sugerir o emprego de metodologias que pesquisam os anticorpos líticos como um importante critério de cura, sendo sua presença indicadora de infecção ativa, ou seja, presente em pacientes tratados não curados. O trabalho de CORDEIRO et al. (2001), indicou o uso potencial de IgG1 anti-epimastigotas para o diagnóstico da infecção e revelou uma maior reatividade de IgG2 anti-epimastigotas nos pacientes com a forma indeterminada e cardíaca.

Em um estudo realizado com camundongos imunizados com frações FRA e CRA de antígenos de T.cruzi, foram testadas as reatividades das subclasses IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3. Níveis mais elevados de IgG3 e IgG1 foram detectados na imunização com antígenos CRA, em contraste, a imunização com FRA resultou em mais altos níveis de IgG1, sem a detecção de IgG2 e IgG3 (PEREIRA et al., 2003).

A ausência de associação entre níveis das diferentes subclasses de IgG e as distintas formas clínicas pode ter sido influenciada diretamente pela alta reatividade sorológica apresentada pelos pacientes do nosso estudo. É provável que se os pacientes avaliados no nosso trabalho apresentassem grandes diferenças de reatividade, evidenciada pela necessidade de uma terceira ou quarta técnica sorológica de diagnóstico, essas diferenças na produção de IgG1, IgG2 e IgG3 seriam detectadas entre os grupos de pacientes com formas clínicas distintas.

Nossos dados demonstraram baixos níveis de IgG1 em todos os pacientes avaliados, independente da forma clínica apresentada e da diluição do soro testada. Uma vez que esses indivíduos apresentam alta reatividade, seria esperado que os níveis de IgG1 fossem os mais elevados em todos os pacientes, independente de forma clínica, pois a literatura indica essa subclasse como a mais predominante no soro humano. Sendo assim, os baixos níveis de IgG1 detectados na população do nosso estudo não seriam justificados pela triagem dos pacientes com elevada reatividade, mas talvez devido a menor produção dessa subclasse por parte desses pacientes. Esses resultados para a pesquisa de IgG1 encontrados em nosso trabalho contradizem todos os estudos realizados e já comentados anteriormente (CERBAN et al., 1993; MICHAILOWISKY et al., 2003; SOLANA et al., 1995; MORGAN et al., 1996; HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001; CORDEIRO et al., 200), que detectaram

IgG1 como a principal subclasse de IgG produzida por pacientes com diferentes manifestações clínicas da doença de Chagas. Em todos esses trabalhos, a produção de níveis elevados dessa subclasse apresentou-se como fator comum nos diferentes grupos clínicos. IgG1 é uma imunoglobulina cuja produção é regulada por citocinas caracterizadas como anti-inflamatórias, e que indica um balanço mais eficiente entre citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias. Essa subclasse poderia estar relacionada com um melhor controle da resposta imune, daí sua associação com a forma indeterminada da doença, indicando que indivíduos que não apresentem alterações cardíacas ou digestivas teriam níveis mais elevados de IgG1, fato esse não observado em nosso estudo. Pelo contrário, em nosso trabalho os pacientes do grupo CARD 1 e CARD 2 apresentaram níveis ligeiramente mais elevados dessa imunoglobulina, não estatisticamente significativos em relação aos outros grupos clínicos.

A produção mais elevada da subclasse IgG2 tem sido associada com alterações cardíacas em humanos, essa subclasse tem sua produção regulada por citocinas pro-inflamatórias, o que estaria relacionado com uma resposta imune mais exacerbada e destruição tecidual. Baseado na regulação de citocinas para induzir a produção de imunoglobulinas, IgG2 seria regulada por IL-12, INF- e TNF- , citocinas que caracterizam o perfil de resposta Th1, em geral predominante nos indivíduos com as manifestações graves da doença. Em contrapartida, IgG1 e IgG3 seriam reguladas por citocinas anti-inflamatórias, como IL-4, IL-5, IL-10 e TGF- , que caracterizam o perfil de resposta Th2 (BRIERE et al., 1994) predominante em pacientes assintomáticos. Isso explicaria em parte a associação encontrada entre IgG2 e cardiopatia chagásica observada em alguns trabalhos (VERÇOSA et al., 2007; CORDEIRO et al., 2001; MORGAN, et al., 1996; HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001). Consequentemente IgG1 e IgG3 que não se associam às formas graves da doença de Chagas estariam presentes em todos os pacientes independentemente da forma clínica.

Em nosso estudo os níveis de IgG2 não foram associados a manifestações cardíacas, sejam leves ou graves. Foi possível verificar que em todas as diluições de soros trabalhadas, a produção de IgG2 não apresentou diferença significativa entre os diferentes grupos de formas clínicas, sendo possível observar essa diferença apenas entre os infectados e o grupo controle. Verificamos apenas que os pacientes com as formas CARD 1, CARD 2 e DIG/MIS apresentaram níveis ligeiramente mais elevados em relação ao grupo IND. O teste de correlação demonstrou a ocorrência de correlação

positiva entre as diferentes formas clínicas e IgG2 apenas na diluição 1:160, indicando que somente nessa diluição os dois fenômenos variam no mesmo sentido sendo possível associar níveis elevados de IgG2 em pacientes com diferentes manifestações clínicas da doença de Chagas, independente da gravidade da forma clínica.

A subclasse IgG3 apresentou os maiores níveis detectados para todos os pacientes. Isso em parte estaria em concordância com trabalhos de CERBAN, et al. (1993), SOLANA et al. (1995), MORGAN et al. (1996) e MICHAILOWISKY et al. (2003), que detectaram níveis dessa subclasse mais elevados em todos os pacientes avaliados, porém associado a IgG1. Foi também possível observar que os pacientes do grupo IND produziram os mais altos níveis dessa subclasse em comparação aos outros grupos clínicos. Sendo a produção dessa subclasse induzida por citocinas anti- inflamatórias, esse resultado estaria de acordo com a associação entre ausência de manifestações clínicas e níveis mais elevados de IgG3. A análise de correlação para a subclasse IgG3 demonstrou uma correlação negativa com as formas clínicas da doença de Chagas indicando que as duas variáveis variam em sentido inverso, ou seja, quanto menos grave a manifestação da doença, maiores são os níveis de IgG3. Este resultado está de acordo com o demonstrado pela técnica sorológica empregada que verificou valores mais elevados de DO em pacientes com a forma indeterminada da doença, sugerindo que essa subclasse de imunoglobulina possa ser empregada como indicador de prognóstico.

Já para IgG1 não foi encontrada correlação estatística significativa entre as formas clínicas e essa subclasse de anticorpo, diferentemente do que já foi citado na literatura, quando foi sugerida a importância de IgG1 como marcador de prognóstico da forma indeterminada da doença de Chagas (CORDEIRO et al., 2001).

A seleção dos pacientes de alta reatividade sorológica em nosso estudo pode ser um dos principais fatores responsáveis pelos resultados obtidos. Outras