O estudo das comunidades macrofúngicas, em especial de ectomicorrízicas, teve recentemente um impulso significativo com o desenvolvimento e aplicação de métodos moleculares, que permitiram obviar muitos dos problemas inerentes à identificação de espécies pelos métodos convencionais. A metodologia de identificação molecular mais utilizada baseia-se na amplificação, recorrendo à reacção da polimerase em cadeia (PCR), da região do DNA que contém o conjunto de genes que codificam o RNA ribossómico (rRNA), nuclear ou mitocondrial (Buscot et al., 2000; Martin & Rygiewicz, 2005).
Nos organismos eucariotas, o conjunto de genes de rRNA existe em múltiplas cópias (até 200 num genoma haplóide) (Bruns et al., 1991), encontrando-se alinhados em tandem em um ou dois cromossomas (Soll, 2000). Cada unidade repetitiva do rDNA é constituída por (i) regiões conservadas, correspondentes aos três genes 18S, 5,8S e 28S (regiões codificantes); (ii) regiões não codificantes, e por isso menos conservadas, que correspondem aos designados espaçadores internos transcritos (ITS); (iii) e espaçadores intergénicos não transcritos (IGS), que separam as diferentes unidades de transcrição (Figura 4.1) (White et al., 1990; Martin & Rygiewicz, 2005). Devido a possuir regiões pouco conservadas entre espécies, a identificação ou estabelecimento de relações filogenéticas em fungos é efectuada recorrendo-se à região ITS, localizada entre os genes 18S e 28S do rRNA e que geralmente inclui também a região codificante do gene 5,8S do rRNA (White et al., 1990; Redecker et al., 1999; Anderson et al., 2001; Diez et al., 2001; Gomes et al., 2002; Moyerson et al., 2003; Oda et al., 2004). As diferenças na região ITS são detectadas por sequenciação dos produtos amplificados (Redecker et al., 1999; Anderson et al., 2001; Diez et al., 2001; Moyerson et al., 2003; Oda et al., 2004) ou pela variação dos fragmentos obtidos pela actividade de endonucleases de restrição, pela técnica designada PCR/RFLPs (Anderson et al., 2001; Gomes et al., 2002; Martin & Rygiewicz, 2005).
São várias as razões que tornam a região ITS adequada à identificação de fungos: (i) a facilidade de amplificação por PCR desta região, uma vez que na maioria das espécies fúngicas esta região possui um comprimento de 650 a 900 pb; (ii) a existência de múltiplas cópias destas sequências no genoma em análise, permitindo a amplificação a partir de amostras de DNA reduzidas, diluídas ou bastante degradadas; (iii) a existência de um elevado polimorfismo inter-especifico nas sequências amplificadas,
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sendo a variabilidade intra-específica muito reduzida (Buscot et al., 2000) e, finalmente, (iv) a possibilidade de utilização de iniciadores nucleotídicos universais (White et al., 1990; Gardes & Bruns, 1993; Egger, 1994; Martin & Rygiewicz, 2005). De facto, múltiplos iniciadores oligonucleotídicos têm vindo a ser concebidos para a amplificação desta região, de modo a diferenciar eficazmente as espécies fúngicas (White et al., 1990; Gardes & Bruns, 1993; Egger, 1994; Martin & Rygiewicz, 2005). No entanto, a maioria dos investigadores recorrem frequentemente ao par ITS1 e ITS4 ou então ITS4 e
ITS5 (White et al., 1990; Martin & Rygiewicz, 2005), por permitirem uma maior
variabilidade entre espécies.
Figura 4.1 Representação esquemática da região de rDNA, que contém as unidades repetitivas dos genes
que codificam o RNA ribossómico nuclear. A localização dos iniciadores nucleotídicos, vulgarmente utilizados na amplificação da região ITS para identificação molecular fúngica, é igualmente representada. Os rectângulos representam os genes com sequências conservadas, enquanto as linhas representam as regiões espaçadoras mais variáveis. As setas a vermelho indicam os locais de ligação dos iniciadores nucleotídicos e a direcção da polimerização (adaptado de White et al., 1990).
4.1.7 Objectivos
No estudo da comunidade macrofúngica associada a povoamentos de C. sativa, no nordeste transmontano, foi evidenciada a presença do fungo H. fasciculare pertencente ao grupo trófico dos fungos saprófita-lenhícola (Capítulo 3). O seu isolamento a partir de um carpóforo de Amanita muscaria infectado por este fungo saprófita, sugeriu o estabelecimento de uma interacção entre estas duas espécies fúngicas. No entanto, apesar de existir uma documentada acção antagonista de H. fasciculare contra outras espécies fúngicas saprófitas, lenhícolas e patogénicas, derivado sobretudo da sua
28S DNAr 18S DNAr
Unidade repetitiva do rDNA 18S
5.8S
28S 5S
rDNA
ITS-1 ITS-2 IGS-1 IGS-2
5.8S ITS-2 ITS-1 ITS1F ITS5 ITS1 SR6R ITS4 ITS4R LR1 200 pb ITS 28S DNAr 18S DNAr
Unidade repetitiva do rDNA 18S
5.8S
28S 5S
rDNA
ITS-1 ITS-2 IGS-1 IGS-2
5.8S ITS-2 ITS-1 ITS1F ITS5 ITS1 SR6R ITS4 ITS4R LR1 200 pb ITS
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elevada taxa de crescimento, nunca foram reportados efeitos desta espécie sobre a comunidade de espécies ectomicorrízicas. Assim sendo, o presente trabalho teve como objectivo avaliar o potencial mecanismo antagonista do fungo saprófita-lenhícola
H. fasciculare sobre o fungo ectomicorrízico P. tinctorius, em condições in vitro. A
escolha de P. tinctorius deveu-se ao facto (i) de se tratar de um fungo ectomicorrízico, que ocorre naturalmente nos povoamentos de C. sativa na região transmontana, (ii) por possuir uma vasta distribuição geográfica, formando associações simbióticas com raízes de mais de 20 géneros de plantas hospedeiras (Cairney & Chambers, 1997), inclusive com o castanheiro (Martins et al., 1996; Martins et al., 1997; Martins, 2004), e (iii) por a micorrização com P. tinctorius demonstrar efeitos positivos em plantas de castanheiro (Martins et al., 1996; Martins et al., 1997; Martins, 2004).
Após caracterização morfológica e molecular dos fungos interactuantes (H. fasciculare e P. tinctorius), o(s) mecanismo(s) antagonista(s) adoptado pelo fungo
H. fasciculare foi avaliado pelo crescimento radial e análise morfológica (macroscópica
e microscópica) das colónias fúngicas interactuantes. Aspectos particulares relacionados com a agressividade de H. fasciculare foram igualmente estudados pela avaliação da acidificação do meio de interacção.
Os estudos desenvolvidos permitirão avaliar a interacção estabelecida entre os fungos H. fasciculare e P. tinctorius, a qual poderá ser relevante para o estabelecimento de medidas que permitam a sobrevivência e a persistência de espécies fúngicas ectomicorrízicas num determinado ecossistema do solo, com consequências ao nível da produtividade agrícola e florestal.
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4.2 RESULTADOS