Innovation and Failure

5. DISCUSSÃO

A anafilaxia é uma das desordens imunológicas mais comuns e o modelo de sensibilização seguida de broncoprovocação, empregado no presente trabalho, é um dos mais freqüentemente utilizados no estudo do comportamento contrátil das vias aéreas frente a reações que envolvam a participação do sistema imune (Capaz et al.,1993; Jancar et al., 1997; Steil et al., 1998). Esse método clássico de sensibilização provoca resposta anafilática evidente tanto in

vivo como in vitro, esta também conhecida como reação de Schultz-Dale (Capaz

et al., 1993; Tavares de Lima & da Silva, 1998). O procedimento de

broncoprovocação pela repetição da exposição ao antígeno por inalação ao animal sensibilizado (Manzolli et al., 1999), corresponde a um modelo de resposta asmática precoce, sendo assim classificada em razão do desencadeamento da resposta broncoconstrictora após a reapresentação ao antígeno.

Os resultados obtidos neste trabalho, com animais sensibilizados e/ou sensibilizados e posteriormente desafiados antigenicamente mostraram-se eficazes tanto na fase aguda quanto na fase tardia do processo asmático. Podemos verificar uma resposta broncoconstrictora marcante, como evidenciado pelo desconforto respiratório, no momento da broncoprovocação, sendo necessária, por algumas vezes, a retirada do animal da câmara de inalação, para se evitar a morte do animal por incapacidade respiratória. Nas traquéias isoladas desses animais desafiados com o antígeno sensibilizante, o desenvolvimento de hiperreatividade demonstra a eficácia quanto à fase tardia,

o que não ocorre quando os experimentos são realizados imediatamente após o desafio, conforme descrito abaixo. Esses resultados, portanto, mostram a eficácia de nosso modelo e a reprodutibilidade do método.

Quando os experimentos foram realizados imediatamente após o desafio antigênico observou-se uma discreta, por vezes estatisticamente significativa, redução na resposta contráctil máxima nas CCE obtidas para mediadores que atuam através da ativação de seu receptor específico (ACh e 5-HT) em traquéias isoladas. A redução provavelmente ocorreu por uma dessensibilização ou taquifilaxia do receptor no momento da broncoprovocação. Complementando a isso foi observado que ocorreu redução da resposta máxima nas CCE ao cálcio que teve sua entrada induzida pela adição prévia de serotonina em traquéias de animais sensibilizados e desafiados 24 h antes, quando comparado a CCE obtidas com traquéias de animais do grupo controle não sensibilizado, opondo-se ao observado quando a pré-contração fora realizada com outros mediadores (acetilcolina e potássio) onde houve aumento das respostas máximas. A redução da resposta possivelmente tenha ocorrido como um efeito taquifilático residual, que foi confirmado quando os animais do grupo teste foram tratados com metilsergida, um antagonista competitivo dos receptores da serotonina, 40 minutos antes da broncoprovocação. Nesse caso a redução da resposta observada anteriormente foi abolida. Nas traquéias de animais desafiados no dia anterior e tratados com metilsergida 40 minutos antes do desafio, não se observou, por outro lado, presença de hiperreatividade, talvez por um efeito residual do bloqueador sobre os receptores serotonérgicos ou

mesmo por um efeito profilático em inibir parcialmente a resposta contráctil imediata, uma vez que nestes animais não se observaram sinais de desconforto respiratório no momento do desafio antigênico. Está bem estabelecido na literatura que a metilsergida pode reduzir a resposta asmática nessas situações (Misawa et al., 1988).

Os resultados demonstram, entretanto, que há padrões diferentes na sinalização dos mecanismos fisiopatológicos da hiperreatividade quando se analisam diferentes mediadores. Observamos a participação marcante de canais do tipo VOC na sinalização do mecanismo contrátil de traquéias de animais sensibilizados e desafiados antigenicamente em CCE obtidas para a serotonina, possivelmente durante a instalação da fase tardia que, para o nosso modelo experimental pode ser visualizada 24 h após a broncoprovocação. Não ocorreu hiperreatividade nas CCEs ao cálcio mediado por serotonina em traquéias de animais broncoprovocados quando comparados com traquéias do grupo naive, ao contrário do que ocorreu quando sua entrada se fez com ACh e KCl. Justificamos esse achado pela presença de nifedipina no líquido nutritivo no momento da confecção das CCEs ao cálcio, para se isolar apenas os canais do tipo ROC. No momento em que foram realizadas CCEs ao cálcio cuja entrada foi mediada pela serotonina na ausência de nifedipina no líquido nutritivo em traquéias de animais desafiados antigenicamente, observamos aumento significativo das respostas máximas, comparadas ao grupo controle não sensibilizado. o que vem a confirmar nossa hipótese. este fato apresenta grande importância na compreensão dos mecanismos da fase tardia do

processo asmático, uma vez que a histamina e, a serotonina, esta última com maior importância no rato (Xu et al., 1992), estão fortemente envolvidas na reação imediata, assim como vários outros mediadores, citocinas e células inflamatórias implicados nesse processo (Liu et al., 2003a; Liu et al., 2003b; Nag

et al. 2003; Fukuno et al., 2003; Eum et al., 2003; Beech et al.,1997;) Esses

fatores também contribuem para as alterações relatadas nas horas que se seguem à broncoprovocação, na fase tardia, também conhecida como inflamatória.

Nesta fase inflamatória, padronizada em nossos experimentos em 24 horas após o desafio antigênico, há migração de neutrófilos, eosinófilos e macrófagos (Qutayba et al., 2000; Barnes et al. 1988). Estas células, por sua vez, juntamente com outras células do próprio tecido lesionado promovem a liberação de citocinas, quimiocinas e outros fatores inflamatórios que, por atuarem em receptores ligados à tirosina quinase, levam a alterações intracelulares de indução ou inibição de síntese protéica, que culminam em alterar as respostas celulares a diferentes estímulos. Estas alterações ficam bem caraterizadas, por exemplo, na responsividade a estímulos contrácteis aplicados à célula muscular lisa da árvore traqueobrônquica, que se torna maior a uma série de estímulos. Farmacologicamente, o aumento dessa responsividade a um dado agonista pode ser caracterizada através de uma resposta máxima aumentada (também conhecida como “hiperreatividade”), uma menor CE50 (hipersensibilidade) ou uma combinação desses dois parâmetros

presente trabalho demonstram o desenvolvimento de hiperreatividade, inespecífica aos estímulos contráteis aqui empregados (K+, ACh e 5-HT), uma vez que, na maior parte dos casos, houve aumento significativo apenas na resposta máxima sem o desvio à esquerda na curva concentração efeito, indicativo do desenvolvimento de hipersensibilidade.

As respostas contrácteis obtidas em traquéias de animais sensibilizados e posteriormente desafiados com o antígeno sensibilizante demonstraram aumento significativo na resposta máxima (hiperreatividade) quando comparadas àquelas obtidas do grupo controle. A participação de canais de cálcio na hiperreatividade se mostra significativa, e é corroborada por outros autores que sugerem que eventos inflamatórios alteram a atividade de canais iônicos (Bonnet et al., 2003; Akbarali et al., Janssen et al., 2001; 2000; Beech et

al., 1997; Chiba et al., 1994). Observamos que o padrão de resposta se

apresenta diferenciado, embora a hiperreatividade tenha sido inespecífica para os diferentes agonistas analisados. Os resultados aqui apresentados dão suporte à hipótese de que essa diferenciação seja decorrente, pelo menos parcialmente, da maior disponibilidade de cálcio promovida por ativação de canais VOC e ROC.

Para estudar a participação dos canais de cálcio operados por receptor (ROC), as curvas concentração-efeito (CCE) foram construídas através da sua prévia ativação com a adição dos agonistas ACh ou 5-HT às soluções superperfusoras isentas de cálcio e com EGTA. Está bem descrito na literatura que a ativação de receptores, por exemplo, os muscarínicos M3 presentes nas

células musculares lisas das vias aéreas, produz contração por aumento da concentração intracelular de cálcio através de sua liberação de estoques internos ou sua entrada por canais da membrana sarcoplasmática, ROCs ou VOCs (Barnes, 1990; Rodger e Pyne, 1992; Chubert et al., 1994). Nos nossos experimentos, a participação dos canais de cálcio (tipo VOC) nesse caso é pouco provável ocorrer, uma vez que os experimentos foram realizados na presença de nifedipina, em concentração capaz de abolir as respostas contráteis induzidas pela solução despolarizante rica em K+ (dados não mostrados). Assim, as contrações produzidas pela adição de cálcio na presença de ACh ou 5-HT são decorrentes da entrada de cálcio para o citoplasma por canais ROC.

Para avaliar os canais de cálcio dependentes de voltagem (VOC) utilizamos preparações mantidas em soluções despolarizantes (KCl, 60 mM) sem cálcio, com adição de EGTA e na presença atropina (Chubert et al., 1994). A estimulação do tecido nessas condições leva a abertura de canais de cálcio dependentes de voltagem. Uma vez que a solução extracelular era desprovida de cálcio, a sua adição em concentrações crescentes produzia seu influxo por esses canais, com desenvolvimento gradual da força contrátil, à medida que sua concentração extracelular se tornava maior. Essa hipótese é reforçada pelo fato de que essas contrações foram bloqueadas pela nifedipina (dados não mostrados).

Nesses experimentos, houve desenvolvimento de hiperreatividade para as contrações induzidas pela adição de cálcio feita conforme a descrição acima, observação que difere daquelas feitas por Chiba e Misawa (1995). Não temos

elementos que expliquem essa diferença entre o presente trabalho e os resultados descritos por esses autores, mas talvez ela seja devida aos diferentes protocolos de imunização como a freqüência de administração do antígeno, ou ao próprio antígeno utilizado. Entretanto, outros autores já relataram, de acordo com nossos resultados, que a hiperreatividade do músculo liso das vias aéreas ao K+ também ocorre tanto em tecidos de ratos como em tecidos de cobaias (Perpina et al., 1990; Piercy et al., 1993).

Para avaliar a participação de canais de cloro ativados por cálcio (Cl(Ca))

utilizamos um derivado fenamato, o ácido niflúmico, por ser um inibidor seletivo dos canais de Cl- em contrações induzidas por agonistas (Teixeira et al., 2000). Acredita-se que a abertura de canais de cloro de pequena condutância seja responsável por parte da despolarização encontrada para alguns neurotransmissores. Essa despolarização, por sua vez, acaba por abrir canais de cálcio dependentes de voltagem, com influxo desse íon para o interior da célula e aumento da sua concentração no mioplasma (Janssen e Sims, 1992, Criddle et al., 1996). Nossos resultados demonstram que a presença de ácido niflúmico na solução extracelular diminuiu a força máxima desenvolvida na curva concentração-efeito para a ACh quando comparada com a situação controle. Entretanto, para os animais desafiados, mesmo com uma menor força máxima, a hiperreatividade pode ser demonstrada. Por outro lado, o ácido niflúmico aboliu a hiperreatividade para a 5-HT, indicando que o mecanismo envolvido para o seu desenvolvimento deve envolver a ativação de canais de cloreto.

Chiba e Misawa (1995) propuseram a participação de canais de cálcio operados por receptor (ROCs) na hiperreatividade induzida por antígenos, em detrimento da participação de canais de cálcio dependentes de voltagem. Eles sugeriram que a hiperreatividade a ACh e devia a uma maior liberação intracelular de cálcio ou à abertura dos canais ROC. Os resultados aqui apresentados corroboram os resultados obtidos para a ACh por Chiba e Misawa (1995), uma vez que nossas preparações se mostraram hiperreativas em condições normais ou em condições que envolvessem a ativação de canais operados por receptor.. Por outro lado, nossos dados nos permitem afirmar que, para a 5-HT, ocorre a participação de ambos os tipos de canais, VOC e ROC, e que os primeiros parecem ser ativados em maior proporção quando há a ativação dos mecanismos que acabam por tornar o tecido hiperreativo. O desenvolvimento da hiperreatividade, nesse caso, ocorreu somente naquelas preparações mantidas sem nifedipina. Em todas as situações nas quais houve a adição do bloqueador dos canais de cálcio tipo-L, não observamos hiperreatividade. A presença do ácido niflúmico também aboliu o surgimento dessa resposta, conforme descrito acima. Esses dados corroboram os achados de Teixeira et al. (2000) que propuseram um modelo de ativação da resposta contrátil para a 5-HT, envolvendo a abertura de canais de cloreto com ativação subseqüente de canais de cálcio tipo-L. Como os efeitos entre niedipina e ácido niflúmico não são aditivos, especula-se que os dois bloqueiam vias que são partes de uma cascata comum de eventos.

Em suma, os resultados aqui apresentados demonstram que a hiperreatividade induzida pela sensibilização e desafio antigênico leva a um siginificante aumento na responsividade contrátil em resposta a entrada de cálcio extracelular mediado tanto por canais VOC, como ROC. Esse aumento de responsividade possivelmente possua mecanismos sinalizadores intracelulares diferentes para alguns agonistas contráteis, principalmente para a serotonina, em que além da participação marcante não só dos canais de cálcio operados por receptor, foi demonstrada uma possível participação de canais de cloro ativados pelo cálcio como mecanismo adicional à sua resposta contrátil