parede desempenha individualmente. A inibição da síntese de quitina (Bowers et ai.,
1974), de glucano (Tkacz, 1984) e mutantes (Bailou et ai, 1980) com manoproteínas cujas cadeias de carbohidratos são mais curtas (mutantes mnn7 a mnnlO) , resultam em qualquer dos casos na lise celular. Parece de facto existir uma inter-relação entre todos os constituintes, formando uma estrutura complexa e cujas características resultam principalmente da existência de uma arquitectura onde todos os componentes têm particular importância para a sua funcionalidade como organelo vital da levedura.
Várias evidências experimentais sugerem a interacção entre os diferentes componentes da parede. A extracção de quitina da parede, mesmo após tratamentos exaustivos para remoção de possíveis contaminações, é acompanhada da presença de manoproteínas e glucano (Holan et a!., 1981). Também a sensibilidade à acção de quitinase é apenas verificada após digestão do glucano com glucanase p-(l-6) (Molano et
ai, 1980) sugerindo a existência de ligações entre o glucano e a quitina. Ligações estas
que, devido ao local de síntese dos dois polímeros, só pode ocorrer extracelularmente. A despolimerização da quitina da parede de S. cerevisiae faz com que todo o (3-glucano seja alcalino-solúvel (Mol e Wessels, 1987). Em Candida albicans foi demonstrada a
existência de ligação covalente entre a N-acetilglucosamina e o glucano p-(l-6). A digestão enzimática do glucano alcalino-insolúvel da parede de Candida albicans origina a obtenção de resíduos de glucosil-N-acetilglucosamina o que é de facto uma evidência de ligações entre os 2 polissacáridos (Surarit et ai, 1988).
Existem também factos indicando a existência de uma ligação do glucano com manoproteínas. A extracção alcalina do glucano (Fleet e Manners, 1976, 1977) ou a hidrólise do glucano com glucanases resulta na solubilização de manoproteínas (Zlotnick
et ai, 1984; Bacon, 1981). Por sua vez a solubilização de manoproteínas com glucanase
origina a obtenção de pequenas quantidades de glucose (Shibata et ai., 1983; van Rinsum
et ai, 1991; Kitamura, 1982). Segundo van Rinsum et ai (1991), o glucano está
covalentemente ligado a manoproteínas através de cadeias de carbohidratos N-ligadas. Estas cadeias são diferentes em composição relativamente ás normalmente descritas, dado que são constituídas por N-acetilglucosamina, manose e p-glucose, numa proporção respectivamente de 1:17:18.
A utilização de papulacandina B, que provoca a inibição da síntese do glucano, resulta na secreção das manoproteínas para o meio (Murgui et ai, 1985). Trabalhos utilizando aculeacina A (Valentin e/ ai, 1986) permitiram esclarecer que as manoproteínas secretadas para o meio, em paredes deficientes em glucano alcalino-solúvel, são as solubilizáveis enzimaticamente com glucanase. Pelo contrário, as manoproteínas cuja extracção é possível através de SDS a quente, são normalmente integradas na parede independentemente da presença ou não de glucano alcalino-solúvel.
A ligação de proteínas ao glucano foi testada in vitro por Mrsa et ai (1992), usando como modelo a (3-glucanase integral da parede celular, codificada pelo gene BGL2. De acordo com o mesmo autor a ligação de proteínas ao glucano é independente da existência de características particulares das proteínas. Proteínas com localização intracelular possuem afinidade in vitro para ligação ao glucano. A invertase e fosfatase
ácida não possuem essa afinidade, o que pode de alguma maneira justificar a sua localização periplasmática. No entanto, esta falta de afinidade para ligação ao glucano não parece ser causada pelas suas extensas fracções osídicas, mas sim por motivos estruturais da própria proteína.
Muitos factores estão ainda por esclarecer relativamente à estrutura da parede da levedura. No entanto, com os dados disponíveis e relatados neste capítulo, podemos considerar como um modelo possível da arquitectura da parede o esquematizado na figura
Figura 1.6. Representação esquemática da parede celular de levedura. EP, espaço
periplasmático; MC, membrana celular; PM, proteína de membrana; PEP, proteína do espaço periplasmático; GPI, proteína ancorada à membrana celular através de uma "âncora de glicosilfosfatidilinositol"; PCG, proteína ligada covalentemente a cadeias de glucano; PE, proteína da parede cuja extracção é possível com SDS a quente.
1.2. FLOCULAÇAO
1.2.1. INTRODUÇÃO
Em determinadas condições, verifica-se a existência de um fenómeno de agregação entre leveduras formando aglomerados de várias centenas ou milhares de células. Este processo de agregação celular, denominado floculação distingue-se das outras formas de aglomeração por ser asexuada e reversível através do uso de agentes quelantes como o EDTA.
Do ponto de vista biotecnológico, a floculação de leveduras reveste-se de particular importância, principalmente na indústria cervejeira. A obtenção de um produto final, isento de leveduras, sem recorrer ao uso de processos dispendiosos como a filtração e/ou centrifugação, é apenas possível se as leveduras dispersas se agregarem formando flocos que se depositam ou vêm à superficie devido à libertação de dióxido de carbono proveniente da fermentação. Bioreactores de floculação são importantes dado que permitem a obtenção de óptimos rendimentos e altas densidades celulares (Teixeira e Mota, 1990; Teixeira et ai, 1990).
Industrialmente, a levedura ideal seria aquela que permanecesse dispersa durante a fermentação, floculando apenas quando as características do produto final fossem as desejadas. No entanto, para que isto seja possível, é necessário um conhecimento detalhado dos mecanismos existentes ao nível molecular que provocam, em determinadas condições ou fase do crescimento da levedura, a sua agregação. O conhecimento dos mecanismos moleculares e factores envolvidos na interacção entre as leveduras, permitirá ainda estabelecer métodos de imobilização de células, com interessantes aplicações biotecnológicas.
Sob um ponto de vista mais lato, o estudo da floculação de leveduras, serve ainda de modelo para a interacção de células em geral, bem como pode contribuir para elucidar
sobre a estrutura da parede, identificação dos seus constituintes e posterior modelação por engenharia genética das características estruturais da parede de acordo com as necessidades práticas da aplicação de determinada levedura.
1.2.2. GENERALIDADES
Os estudos de floculação têm sido efectuados usando essencialmente a levedura
Saccharomyces. No entanto, este fenómeno é comum a outras leveduras, tendo sido
realizados trabalhos também em Kluyveromyces (Bajpai e Margaritis, 1986; Hussain et ai, 1986; Teixeira e Mota, 1990), Schizosaccharomyces pombe (Johnson e/ ai, 1987; Sousa
et ai, 1993), e Hansenula anómala (Saito et ai, 1990).
A floculação de leveduras, resulta de interacções entre células adjacentes, ao nível da superfície celular. Vários factores, como o pH, composição do meio, temperatura, presença de iões e carbohidratos, exercem influência na floculação e grande parte dos estudos da agregação de leveduras baseia-se na observação do efeito de alguns destes factores na floculação. No entanto, a comparação dos resultados obtidos por vários autores é dificultada devido ao facto de serem utilizados diferentes métodos de extracção de componentes da parede, de doseamento do grau de floculação e de leveduras com características genéticas diferentes.
Dado que a interacção entre leveduras adjacentes levando à sua adesão, depende essencialmente de determinadas características da sua superfície celular, pois é esta a estrutura fisicamente interveniente no fenómeno, alguns trabalhos foram efectuados na tentativa de observar uma característica particular da parede de células floculantes. Por microscopia electrónica e coloração com óxido de tungsténio, foi observada a existência de pequenas fímbrias associadas à parede de células floculantes de Saccharomyces
não confirmam estes resultados, dado que usando microscopia electrónica de varrimento ou de transmissão, não foram detectadas quaisquer diferenças entre paredes de células floculantes e não floculantes (Lyons e Hough, 1970, 1971; Miki et ai, 1982a; Johnson et
ai, 1989). Trabalhos mais recentes, mostraram a existência de fímbrias associadas à
superfície celular de leveduras floculantes (Straver et ai., 1994), e cuja acumulação na parede coincide com um aumento de hidrofobicidade. Outros autores, sugerem também a existência de uma correlação entre a floculação e a hidrofobicidade da superfície celular (Kamada e Murata, 1984; Amory et ai., 1988; Smit et ai, 1992).
Também o oxigénio parece influenciar a floculação por aumento de hidrofobicidade da parede (Straver et ai., 1993b). O oxigénio como factor influente nas características floculantes de leveduras é descrito ainda por outros autores (Miki et ai., 1982b; Soares et
ai., 1991).