de neurônios a partir do mapa de atividades.
A finalidade da obtenção do mapa de atividades é a obtenção da distribuição virtual de neurônios, sobre a área de sensibilidade dos microeletrodos da MEA, a partir do estudo dos sinais eletrofisiológicos registrados. Isso é possível, caso exista pelo menos uma imagem fotográfica da cultura, que permite associar o mapa de atividades neuronais ao número de neurônios por microeletrodo, obtido na imagem fotográfica. De posse de ambos os resultados, é possível comparar os dois mapeamentos, virtual e real e validar o trabalho desenvolvido.
3.2 Metodologia para a Obtenção do Mapa de Atividades dos
Neurônios
A metodologia proposta para a primeira parte, de análise das atividades fisiológicas com o objetivo de obtenção do mapa de atividades dos neurônios, é resumida no fluxograma da Figura 3.1, que contém as seguintes etapas: (a) obtenção do registro das atividades eletrofisiológicas da cultura; (b) processamento das atividades eletrofisiológicas usando a abordagem de Análise de Componentes Independentes, ICA; e (c) detecção e quantificação das atividades neuronais, resultando em dois tipos de mapas para atividades dos neurônios: contagem de
Registro de atividades eletrofisiológicas
da cultura
Aplicação do ICA dividindo os sinais registrados em segmentos
Detecção de Spikes e Bursts e quantificação
Construção do mapa de atividades em contagem de Spikes e
em contagem de Bursts
Figura 3.1 – Diagrama da metodologia proposta caracterizando a análise e o processamento da atividade eletrofisiológica em uma cultura in-vitro.
3.2.1 Obtenção da atividade eletrofisiológica da cultura
O arranjo de 59 microeletrodos, que fica na região central da MEA, é mostrado na Figura 3.2(a), consistindo de um layout (8 x 8), de microeletrodos, sendo que as posições dos 4 cantos não são disponíveis para registro de sinais, nem a de coluna 1 e linha 5, que é utilizada para controle, como pode-se observar na Figura 3.2(b). O espaçamento entre os microeletrodos é de 200 µm, e a área referente aos 59 microeletrodos, é de 1.4 mm2. Cada microeletrodo
apresenta um diâmetro de 30 µm, sendo caracterizado pela baixa impedância para a captação de sinais.
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Figura 3.2 – Ilustração da configuração dos microeletrodos da MEA padrão de 59 microeletrodos: (a) imagem fotográfica da região central da MEA; (b) identificação
dos microeletrodos.
3.2.2 Processamento dos segmentos usando ICA
Nesta etapa, é usada a Análise de Componentes Independentes (ICA) sobre os segmentos dos registros eletrofisiológicos da cultura. Um segmento é uma porção de um sinal eletrofisiológico, correspondente a um período de tempo, adotada para efeitos de processamento simultâneo do ICA para todos os 59 microeletrodos.
O objetivo deste processamento é a separação dos sinais elétricos provenientes de neurônios distantes da cultura, que afetam os sinais registrados em vários microeletrodos, fazendo com que um neurônio afete apenas um microeletrodo, o microeletrodo adjacente, ou mais próximo.
Considerando-se que o sinal da atividade neuronal se propaga em todas as direções, o registro, por parte dos microeletrodos, acaba sendo redundante. Imaginando-se a associação de cada neurônio a um microeletrodo mais próximo, ao aplicar o ICA, obtêm-se para um microeletrodo, sinal composto apenas pelos potenciais de ação dos neurônios adjacentes.
3.2.3 Detecção e quantificação da atividade extracelular
Após a aplicação da técnica de ICA, é realizada a análise quantitativa dos sinais resultantes de cada microeletrodo da MEA.
Teoricamente, os sinais eletrofisiológicos podem ser analisados quanto a qualquer tipo de elemento do sinal registrado, como os spikes, bursts, ou mesmo os
ruídos. Para o presente trabalho, foram implementadas as técnicas de detecção de
spikes, além da detecção de bursts.
3.2.4 Mapa de atividades dos neurônios
O mapa de atividades dos neurônios, é uma representação visual de círculos concêntricos aos microeletrodos, sendo as dimensões proporcionais aos valores correspondentes às atividades medidas nos microeletrodos associados, após a aplicação de ICA, conforme ilustração na Figura 3.3.
11 81 18 88 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
Legenda: atividade espontânea normalizada Figura 3.3 – Exemplo de um mapa de atividades dos neurônios.
A dimensão desses círculos é obtida em função do número máximo e mínimo de spikes ou bursts, normalizado. Posteriormente, essa dimensão normalizada é usada para a obtenção do mapa virtual de distribuição de neurônios, calibrada com o mapa de contagem de neurônios a partir da imagem fotográfica do DIV 38. Entende- se por calibração, o fato de estabelecer um número adequado de neurônios
54 proporcional às atividades obtidas em função do número de spikes ou bursts, para o mapa virtual. É possível estabelecer esse número considerando-se que as contagens máxima e mínima de neurônios obtidas nos microeletrodos a partir da imagem fotográfica do DIV 38 seja proporcional às atividades máxima e mínima nos microeletrodos obtidas para o mapa virtual, em função do número de spikes ou
bursts.
O número normalizado de spikes é obtido levando-se em consideração a contagem máxima de spikes, Smax, e a contagem mínima, Smin. O número de spikes normalizados, CS, é tal que se a contagem é igual a Smax, CS = 1, e se a contagem é igual a Smin, CS = 0.
O número normalizado de bursts, CB, é obtido de maneira análoga, sendo que se a contagem é igual ao máximo, CB = 1, e se a contagem é igual ao mínimo, CB = 0.
Para a construção do mapa de atividades de neurônios, é adotado um procedimento, com os passos seguintes (Algoritmo 3.1):
Algoritmo 3.1. Construção do mapa de atividades de neurônios.
1) Determinar as posições dos 59 microeletrodos de sinais e do microeletrodo de referência;
2) Enumeração das linhas e colunas da matriz;
3) Enumeração das posições dos cantos com as respectivas posições (11, 81, 18, 88);
4) Para cada microeletrodo
{obter o número normalizado de spikes ou bursts;
desenhar o círculo na respectiva posição com o diâmetro igual ao número normalizado}