- Maceração com etanol a 95 % (quatro vezes); - Concentração em evaporador rotativo.
- Dissolução em MeOH:H2O (7:3 v/v); - Agitação mecânica por 60 minutos.
- Partição em ampola de separação com hexano (seis vezes de 500 mL).
- Secagem com sulfato de sódio anidro; - Filtração sob pressão reduzida; - Concentração em evaporador rotativo.
- Partição em ampola de separação com CHCl3 (três vezes de 500 mL).
- Partição em ampola de separação com AcOEt (sete vezes de 500 mL).
** Reservada para estudos posteriores
Material botânico seco e pulverizado (2500 g)
Extrato Etanólico Bruto (108,28 g)
Solução Hidroalcoólica
Fase Hexânica (30,00 g)
Solução Hidroalcoólica I
Fase Clorofórmica (17,00 g)
Solução Hidroalcoólica II
Fase Acetato de Etila (43,00 g)
Solução Hidroalcoólica III
Solução Hidroalcoólica IV **
- Secagem com sulfato de sódio anidro; - Filtração sob pressão reduzida; - Concentração em evaporador rotativo.
- Secagem com sulfato de sódio anidro; - Filtração sob pressão reduzida; - Concentração em evaporador rotativo.
4.9. Avaliação f it oquímica pr eliminar dos const it uint es químicos
Esta triagem procura sistematizar, ou rastrear os principais grupos de constituintes químicos que compõem um extrato vegetal. É um exame rápido e superficial através de reagentes de coloração ou precipitação que irão revelar ou não a presença de metabólitos secundários presentes em um extrato. A triagem fitoquímica preliminar foi realizada com o extrato etanólico bruto, utilizando a metodologia descrita por Matos (1997). Os resultados do “screening” fitoquímico encontram-se sumarizados no Quadro 3 (p. 138), abaixo.
Quadro 3- Triagem fitoquímica realizada com o extrato etanólico bruto das partes aéreas de Croton grewioides Baill.
GRUPOS QUÍMICOS TESTES APLICADOS RESULTADOS
Alcalóides
Bouchardat (-)
Mayer (-)
Dragendorff (-)
Ácido sílico-tungstico (-)
Esteróides e terpenóides Lieberman-Buchard (++)
Taninos Cloreto férrico 2% (-)
Flavonóides
Shinoda (+)
Oxalo-bórico (++)
Saponinas Teste de espuma (-)
Nos resultados dos testes foram utilizadas as seguintes convenções: (-) Reação negativa
(+) Reação fracamente positiva (++) Reação positiva
(+++) Reação fortemente positiva
4.10. Biomonit orament o do ext r at o et anólico br ut o e f ases de Cr ot on grewioides Baill. com Ar t emia salina Leach.
O extrato etanólico bruto e as fases de Croton grewioides foram pesadas e submetidas a teste de triagem biológica utilizando a Artemia salina (San Francisco Bay Brand®, EUA) como organismo teste, para a avaliação da sua toxicidade. Os testes foram realizados no Laboratório de Ensaios Toxicológicos (LABETOX) da Universidade Federal da Paraíba
(UFPB), sendo armazenados sob resfriamento a 5 ºC até a execução do experimento. Foram utilizadas larvas de Artemia salina L., microcrustáceo da classe Anostraceae, na forma de náuplio, utilizando-se a Concentração Letal Média (CL50) como parâmetro de avaliação da
atividade biológica(LOPESet al., 2002).
Para a obtenção dos náuplios (larvas de 24 horas), cistos de Artemia salina foram mantidos em um recipiente contendo água salina (pH 8,5 e 29 ºC) o qual ficou sob iluminação artificial por 24 h. Após esse período houve a eclosão dos cistos e a obtenção das larvas.
Estas solubilizações (Quadro 4, p. 139) foram feitas para a obtenção de uma solução mãe de 10 mg/mL. A partir desta efetuou-se diluições para concentrações inferiores de 10 - 1000 μg/mL. Colocou-se 5 mL de cada uma dessas soluções em tubos de ensaio e adicionou- se 10 náuplios. Cada concentração foi testada em triplicata e repetida em dois experimentos. Um grupo controle foi preparado contendo apenas os solventes e as larvas. Deixou-se o conjunto em incubação sob luz artificial por 24 h e então se realizou a contagem do número de larvas vivas e mortas, para posterior determinação da Concentração letal Média. A CL50
foi determinada de acordo com o método estatístico de Probitus utilizando o Microcal Origin 6.0.
Quadro 4- Solubilização do extrato etanólico e fases de Croton grewioides
4.11. Fr acionament o cr omat ogr áf ico da f ase hexânica
A fase hexânica (30,00 g) foi solubilizada em metanol sob aquecimento e deixada em repouso no freezer durante 24 horas, produzindo um precipitado amarelo e um sobrenadante, que foi separado sob filtração em funil de Buchner à vácuo.
O líquido sobrenadante inicial foi concentrado em rotaevaporador, e, após destilação completa do solvente, obteve-se a fase hexânica II (25,00 g). Uma alíquota desta fase (15,00 g) foi submetida à cromatografia de adsorção em coluna (CC) usando-se sílica gel 60 como fase estacionária e como eluentes, os solventes hexano, AcOEt e MeOH individualmente ou em misturas binárias, em gradiente crescente de concentração. Foram coletadas 116 frações
SUBSTÂNCIAS SOLVENTES
Extrato Etanólico DMSO + H2O salina artificial Fase Hexânica Cremofor + H2O salina artificial Fase Clorofórmica Cremofor + H2O salina artificial Fase Acetato de Etila DMSO + H2O salina artificial
de 125 mL cada, e os resultados obtidos após o fracionamento cromatográfico, são fornecidos no Quadro 5 (p. 140), abaixo.
Quadro 5- Fracionamento cromatográfico da fase hexânica II
FRAÇÕES SOLVENTE PROPORÇÃO (%v/v)
1-6 Hex 100 7-16 Hex : AcOEt 95:5 17-37 Hex : AcOEt 90:10 38-45 Hex : AcOEt 85:15 46-55 Hex : AcOEt 80:20 56-64 Hex : AcOEt 75:25 65-74 Hex : AcOEt 70:30 75-82 Hex : AcOEt 60:40 83-86 Hex : AcOEt 50:50 87-91 Hex : AcOEt 40:60 92-96 Hex : AcOEt 30:70 97-101 Hex : AcOEt 20:80 102-106 Hex : AcOEt 10:90 107-108 AcOEt 100 109-110 AcOEt: MeOH 90:10 111-112 AcOEt: MeOH 70:30 113-116 MeOH 100
As frações foram analisadas comparativamente através de cromatografia em camada delgada analítica (CCDA) utilizando diferentes sistemas de eluição e reunidas, quando semelhantes, em 25 grupos de acordo com os Rfs, após análise à luz UV e impregnação com
Quadro 6- Sistemas de eluições utilizados no processamento cromatográfico da fase hexânica II de Croton grewioides, frações coletadas para cada sistema de eluição e grupos de frações obtidos após análise em CCDA.
A fração 26-33 (109,3 mg) foi submetida a uma nova cromatografia em coluna preenchida com sílica flash (ART 7734 MERCK - 0,04 – 0,063) e eluída com hexano, AcOEt e MeOH, puros ou em misturas binárias seguindo gradiente de concentração, obtendo-se 40 subfrações que foram monitoradas por CCDA. A subfração 2-3 (50,1 mg) foi cromatografada seguindo a metodologia anterior, obtendo-se 25 subfrações, que após análise em CCDA, a subfração 8 apresentou-se na forma de um óleo amarelo sendo então codificada como Cg-2 (15,3 mg) (0,006%) (Fluxograma 2, p. 142).
As frações 05, 39, 40 e 66-67 apresentaram-se como cristais, óleo amarelo-alaranjado, amarelo-esverdeado e amarelo, respectivamente, sendo codificados como Cg-10 (105,1 mg) (0,042%), Cg-4 (35,2 mg) (0,014%), Cg-3 (81,4 mg) (0,032%) e Cg-1 (208,1 mg) (0,083%) (Fluxograma 2, p. 142).
A fração 23 (75,7 mg) foi submetida a cromatografia em coluna com sílica flash (ART 7734 MERCK - 0,04 – 0,063) e eluída com hexano, AcOEt e MeOH, puros ou em misturas binárias seguindo gradiente de concentração, obtendo-se 23 subfrações que foram reunidas em 7 grupos após monitoramento por CCDA. A subfração 10 apresentou-se na forma de um óleo amarelo sendo então codificada como Cg-5 (9,3 mg) (0,003%) (Fluxograma 2, p. 142).
FRAÇÕES COLETADAS SISTEMA DE ELUIÇÃO GRUPOS APÓS CCDA
1-6 Hex (100%) 1-4; 5; 6-10; 11-12; 13-19; 20; 21-22; 23; 26-33; 34-38 7-16 Hex : AcOEt (95:5 v/v) 17-37 Hex : AcOEt (90:10 v/v) 38-45 Hex : AcOEt (85:15 v/v) 39; 40; 41-51; 52-56; 57-58; 59-61; 62-65 46-55 Hex : AcOEt (80:20 v/v) 56-64 Hex : AcOEt (75:25 v/v) 65-74 Hex : AcOEt (70:30 v/v) 66-67; 68-77; 78-82; 83-91 75-82 Hex : AcOEt (60:40 v/v) 83-86 Hex : AcOEt (50:50 v/v) 87-91 Hex : AcOEt (40:60 v/v) 92-96 Hex : AcOEt (30:70 v/v) 92-95; 96-107 97-101 Hex : AcOEt (20:80 v/v) 102-106 Hex : AcOEt(10:90 v/v) 107-108 AcOEt (100%) 109-110 AcOEt: MeOH (90:10 v/v) 111-112 AcOEt: MeOH (70:30 v/v) 113-116 MeOH (100%)
Fluxograma 2- Fracionamento cromatográfico da fase hexânica II das partes aéreas de