Na t ent ativa de se encont rar m ét odos m ais eficient es na identificação e quantificação de t ocoferóis em m at rizes alim ent ares, inúm eras pesquisas vêm sendo realizadas nas áreas de crom at ografia líquida de alt a eficiência ( CLAE) e da Espect roscopia na região do infraverm elho com Transform ada de Fourier ( FTI R) ( SI LVA, 2003; SOUSA, 2005; GUI NAZI et al., 2009; SI LVA et al., 2009; MAN et al., 2005; )
Geralm ent e, as concent rações de t ocoferóis são baixas fazendo com que haj a a necessidade de pré-concent ração das am ost ras. Um a alt ernativa para a análise de t ocoferóis por crom at ografia líquida de alt a eficiência dar- se por via diret a, que consiste em um m ét odo onde a am ost ra não necessit a de um a pré- concent ração ( saponificação) , ist o é, som ent e com a diluição dest a em um solvent e iner t e. Um dos problem as que pode ocorrer nest a t écnica é a cont am inação do inj et or e/ ou da coluna crom at ográfica. Um a saída seria a lim peza profunda da coluna utilizada para a separação dos com ponent es est udados ( LI MA e GONÇALVES, 1997; CARVALHO, 2007; RAMALHO et al., 2006) .
Segundo Paixão e St am ford ( 2004) , a saponificação é um procedim ent o necessário para o isolam ent o das vit am inas lipossolúveis encont radas na fração insaponificável dos alim ent os. Est e processo envolve um rom pim ent o das ligações ést eres na m at riz lipoprot éica, com liberação de diversos com post os, t ais com o, os ácidos graxos na form a de sais; glicerol; fosfolipídios e de out ras m oléculas encont radas no alim ent o. Ent re as frações insaponificáveis encont ram - se os est eróides, carot enóides, colesterol e vit am inas lipossolúveis liberadas em proporções variáveis, dependendo das condições de saponificação e ext ração. Em
cont rapart ida, essas vit am inas podem ser dest ruídas por exposição contínua a algum as condições de saponificação, ou ainda, pela presença de im purezas nos solvent es utilizados na ext ração. At ravés dest e procedim ent o, as form as est erificadas das vit am inas A e E são convertidas exaustivam ent e em form as alcoólicas livres.
3.7. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE
A CLAE é um im port ante m em bro de t oda um a fam ília de t écnicas de separação, um a vez que se consegue separar m isturas que cont êm um grande núm ero de com post os sim ilares. Dat am de 1968 os prim eiros t rabalhos publicados, os quais relat aram result ados experim ent ais com provando a possibilidade de se ut ilizar equipam ent os, que favorecessem análises de subst âncias com m aior rapidez, operando com um a fase m óvel líquida de alt a pressão e obt endo- se result ados satisfat órios ( COLLI NS et al., 2007) .
É usada em casos em que a am ost ra a ser analisada est á em solução, sendo os constit uint es a serem separados cham ados de solut os. A separação result a em um equilíbrio de dist ribuição do solut o ent re duas fases: um a fase fixa sólida ( fase est acionária) , em pacot ada no int erior de um a coluna, e um a fase m óvel, que at ravessa a fase fixa contida na coluna. Durant e a passagem da fase m óvel sobre a fase est acionária, os com ponent es da m istura são dist ribuídos ent re as duas fases, de t al form a que cada um dos com ponent es é seletivam ent e retido pela fase est acionária, result ando em m igrações diferenciais dest es com ponent es ( CI OLA, 1998) .
Em geral, se baseia na det erm inação individual de t odos os com ponent es present es em um a am ostra, at ravés do t em po de ret enção em relação à coluna, det ect or e fases m óveis utilizadas. Dependendo da fase m óvel usada o t em po de ret enção será diferent e, pois a int eração de
- tocoferol/ fase, m uda de solvente para solvente ( SALGADO et al., 2008; RAMALHO et al., 2006; FREI TAS, 2007; GUI NAZI , 2009; RI OS e PENTEADO, 2003; CARO, 2002; SI LVA, 2003; MARTI NS, 2006) .
Possui inúm eras vant agens em relação aos out ros m ét odos exist ent es: rapidez, precisão, reprodut ibilidade, sim plicidade, sensibilidade, m enor exposição a agentes ext ernos e separações eficientes ( COLLI NS et al., 2007)
A CLAE t em superado a crom at ografia gasosa ( CG) em virt ude da grande flexibilidade e aplicabilidade a diferentes m at rizes de am ost ras com o produt os farm acêuticos, alim entos, fluídos e tecidos biológicos e t ablet es m ulti- vit am ínicos. I st o acont ece porque, na CG, requer a derivação da am ost ra a com post os volát eis com o os ést eres t rim etilsilil acet at o, propionat o e t rifluoroacet at o, fazendo com que est as passem por et apas pré- crom at ográficas m uit o t rabalhosas ( SI LVA, 2003) . Por out ro lado, a CLAE pode ser execut ada a t em perat ura am bient e e sem derivação das am ost ras ( GI ACOMI NI , 2006) .
Em relação à coluna crom at ográfica, a fase reversa é preferida pela excelent e reprodução do t em po de ret enção, rápido equilíbrio e robust ez da coluna, além de perm itir m elhores aj ust es para a separação dos int erferent es. Na fase reversa os t ocot rienóis são eluídos com o um grupo ant es dos t ocoferóis. Quant o aos t ocoferóis, o δ-tocoferol é eluído prim eiro, sendo seguido pelos dim etil subst it uídos - e -t ocoferol que são m uit o difíceis de serem separados e por últim o o - t ocoferol ( SI LVA, 2003) . Tem sido report ado a separação dos hom ólogos - e - t ocoferol em coluna de fase rev ersa C30 ( SCHI EBER et al., 2002) , pent afluorofenil ( PFPS) e oct adecil polivinil álcool ( ODPVA) ( ABI DI e MOUNTS, 1997; KAMAL- ELDI N et al., 2000) .
Para colunas de fase reversa a fase m óvel m ais em pregada é basicam ent e m et anol puro ou m ist uras de m et anol- água cont endo at é 10% de água ( SÁNCHEZ- PÉREZ et al., 2000) . Alguns analist as t rabalham com m ist uras de água- acet onit rila-m et anol, acet at o de etila e clorofórm io, n- hexano e isopropanol, em várias proporções ( RI OS e PENEDO, 2003; SOUSA, 2005; LI ANG et al., 2011; BOSCHI N e ARNOLD,2011) .
As colunas de fase norm al são capazes de separar os isôm eros - e - t ocoferol e t ocot rienóis e apresent am com o vant agens a habilidade de t rabalharem com solvent es orgânicos perm itindo um a alt a solubilidade de lipídeos, suport arem alt a concentração de lipídeos, os quais são facilm ent e elim inados por solvent es não polares, e habilidade de prover am pla faixa de seletividade com o uso de diferent es m odificadores polares na fase m óvel ( SI LVA, 2003) .
Em coluna de fase norm al usualm ent e são utilizados na separação de com post os t ocol eluent es com post os por um alcano com o hexano, hept ano, iso- oct ano, com um a pequena quantidade de m odificador polar que pode ser um álcool com o et anol, m et anol, but anol, ou um éter com o t et rahidrofurano, m etil, t- butil, isopropil, ou um clorohidrocarbono com o diclorom et ano, clorofórm io ( GUI NAZI , 2009; GI MENO et al., 2000; GOTOR et al., 2007; CARO, 2002; SI LVA, 2003; PYKA e SLI WI OK, 2001; CHUN et al., 2006; CARVALHO, 2007) .
O det ect or m ais utilizado nas det erm inações de t ocoferóis e t ocot rienóis é o de fluorescência em virt ude da sua m aior especificidade ( RI OS e PENTEADO, 2003; GOTOR, et al., 2007; GUI NAZI , 2009; BOSCHI N e ARNOLD, 2011) , em bora exist am aut ores que utilizam o det ect or de UV para a det ecção de vitam ina E em produt os com o óleos, leit e e produt os lácteos, carnes, noz, ração, sem ent es e bebidas ( PYKA e SLI WI OK, 2001; SI LVA, 2003; SOUSA, 2005; CARVALHO, 2007; LI ANG et
al., 2011) , devido este apresent ar- se com o um det ect or m ultiuso, além de sua praticidade.
Norm alm ent e, a quantificação é feit a por padronização ext erna com uso de curvas de padronização, independent e do tipo de coluna ou det ect or usado, em vários tipos de m at rizes, desde alim ent os processados ou não, óleos, sem ent es ou m esm o t ecidos e fluídos biológicos ( I WASE, 2000; GI MENO et al., 2000; TURNER e MATHI ASSON, 2000; CARLUCCI et
al., 2001; BRUNI et al., 2002; SCHI EBER et al., 2002; ESCRI VÁ et al., 2002; SI LVA, 2003) . Segundo Rupérez et al., ( 2001) a quantificação t am bém pode ser feit a por padronização interna utilizando com o padrão int erno 5,7 dim etilt ocol e o t ocol ( crom anol desm etilado obtido dos t ocoferóis) ou o - t ocoferol acet at o em crom at ografia em coluna de fase reversa e o o-hidroxibifenil em coluna de fase norm al.
3.8. Espectroscopia por infravermelho com transformada de