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O potencial de poluição do solo por glyphosate foi avaliado por amostras coletadas com sonda na profundidade de 0-10 cm em nove pontos distribuídos de forma sistemática perpendicular ao curso d‘água (a cada dois metros, em linha contínua cinco metros antes do término da parcela ), em quatro períodos distintos: 1) anterior ao plantio das mudas (―branco‖) (junho/13); 2) vinte e cinco dias após a primeira aplicação de herbicida (julho/13); 3) antes da segunda intervenção de manutenção, cerca de cinco meses após o plantio (novembro/13); 4) após vinte e cinco dias da segunda intervenção de manutenção (janeiro/14). O segundo manejo químico necessitou uma reaplicação para que as falhas fossem corrigidas, logo o período aguardado para realizar a ultima coleta de solo partiu desta ultima intervenção. O período de 25 dias para análise de glyphosate em solo foi determinado de acordo com Prata (2002), que indica que o valor de meia-vida de dissipação da molécula em solo variou entre 14,5 e 25,8 dias para as condições analisadas.

Para coleta da água de enxurrada foram projetados coletores que possuíam uma fenda perpendicular ao solo, tornando possível armazenar somente a solução de enxurrada, sem possibilidade de dissolução por entrada direta de água de chuva. Outro ponto importante foi a conexão deste com um galão plástico. Esta estrutura impediu a diluição da solução coletada, uma vez que somente os cinco litros iniciais eram armazenados (Figura 3). Os coletores foram instalados na porção inferior do plantio, junto às margens do curso d‘água, dentro das parcelas. Para minimizar a possibilidade de veios preferenciais nas parcelas que dificultassem a coleta da água, canais direcionadores foram abertos em formato de V, iniciando da abertura do coletor (Figura 4).

Figura 3 - Coletor de água de enxurrada utilizado para obter amostras de água para avaliação de resíduos de glyphosate e AMPA em experimento de restauração florestal implantado em Itu-SP. A fenda azul capta a água de enxurrada, que é conduzida por uma mangueira até um galão enterrado

Figura 4 – Coletores instalados na extremidade inferior das parcelas utilizadas para avaliação do experimento; os canais abertos objetivaram direcionar a água de enxurrada para captação

Seis avaliações temporais foram realizadas: após os três primeiros eventos de chuva observados seguidos das duas primeiras manutenções com herbicida/roçagem nas parcelas. A intenção nesse caso é avaliar quanto e por quanto tempo após a pulverização, resíduos de herbicida podem ser eventualmente carreados para o curso d‘água. Como os tratamentos mecânicos, independente da frequência, tendiam a apresentar os mesmos resultados para resíduos de glyphosate/AMPA, e devido aos custos associados às análises das moléculas serem elevados, somente o tratamento com aplicação de glyphosate (Trat-1) e roçada sempre que necessário (Trat-2) tiveram solo e água de enxurrada analisados.

As amostras foram armazenadas a 4 ºC até o momento da análise. Devido a problemas de transporte, as amostras referentes a quatro pontos de coleta da segunda coleta da primeira chuva foram perdidas.

3.2.3.3.2 Análise de Glyphosate e AMPA Instrumentação

Resíduos de glyphosate e seu metabólico ácido aminometilfosfônico (AMPA) foram analisados no laboratório AgroSafety Monitoramento Agrícola Ltda, Piracicaba, SP.

Os procedimentos para extração e análise de solo e sedimento foram os mesmos, exceto que para o sedimento houve necessidade de remover a água por pressão com auxílio de mangueira e coleta da solução concentrada contendo o sedimento decantado. Para tal, 5 g de solo/sedimento e 25 mL de solução 0,6 N de KOH foram adicionados a tubos falcon e agitados por 1 h (200 rpm - Mesa Agitadora Orbital AL 410, American Lab), mantidos em ultra-som por 15 min (Lavadora Ultrassonica Unique, Ultra Cleaner) e centrifugados a 1800 rpm, por 10 min (Nova Técnica NT-820). O sobrenadante foi removido e o pH ajustado a 6,5- 7,5 com solução 5 N de HCl. Então, uma alíquota de 6 mL do extrato foi filtrado (Chromafil Syringe Filters, PET-20/15 MS) com o auxílio de uma seringa hipodérmica (BD Plastipak 10 mL) para posterior retirada de 4 mL do filtrado e adição de 16 mL de água deionizada. A solução final foi vertida a uma coluna cromatográfica de vidro, com torneira e placa porosa, empacotada com dois gramas de resina altamente básica (Sigm A-Aldrich, Dowex® 1X8 chloride form, 100-200 mesh), diluída em água mili-Q. Para condicionamento da coluna, adicionou-se 60 mL de solução NaOH 1 N, seguida de duas eluições com 6 mL de ácido acético 1 N e duas lavagens com 11 mL de água mili-Q, devendo o pH do coletado se

colunas com 15 mL de acetona 40% sob fluxo de 2 mL min-1, seguido pela passagem de 10 mL de solução 0,5 N de HCl. Os extratos foram coletados e evaporados a 65ºC, seguidos da adição de 0,7 mL de ácido acético e 1,5 mL de trimetil ortoacetato, com homogeneização em vórtex e ultra-som (10 min) para a derivatização. Após isso, esse material foi submetido a banho-maria (80ºC, 1 hora – Chapa aquecedora Marconi Modelo MA 239) e à evaporação total do solvente em concentrador a 35ºC. A ressuspensão foi feita com 1 mL de acetato de etila, com posterior acondicionamento em vial para injeção em GC/MS.

Para a análise de água, alíquotas de 2 mL de cada amostra foram filtradas com o auxílio de uma seringa hipodérmica (BD Plastipak 10 mL) em unidades filtrantes descartáveis de poliéster (Chromafil Syringe Filters, PET-20/15 MS), previamente condicionados com água destilada. O coletado foi armazenado em vials para injeção em LC/MS/MS.

Procedimentos

As análises de solo e sedimento foram realizadas em cromatógrafo gasoso (Thermo Scientific, modelo CG Trace 1310) acoplado a espectrômetro de massas quadrupolo simples (GC/MS) (Thermo Scientific, modelo ISQ). A separação foi realizada utilizando coluna BPX5 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm. A fase móvel foi constituída por rampa de temperatura, com mudança linear descrita como: 60 ºC, 1 min; 15 ºC min-1, 165 ºC, 0 min; 5 ºC min-1, 220 ºC, 0 min; 50 ºC min-1, 300 ºC, 3 min. O gás de arraste foi hélio a fluxo 1,1 m min-1. O volume injetado foi de 2 μL, com temperatura do injetor a 250 ºC. As recuperações foram de 53,30 ± 5,01 % e 57,70 ± 6,78 % para o glyphosate e o seu metabólito AMPA, respectivamente. Para sedimentos, os limites de detecção e quantificação foram iguais a 417 e 1250 μg kg-1_,

respectivamente. Para solos, esses limites foram iguais a 167 e 500 μg kg-1_{, respectivamente.}

As análises de água foram realizadas em cromatógrafo líquido (Thermo Scientific, modelo Accela) acoplado a espectrômetro de massas triploquadrupolo (LC/MS/MS) (Thermo Scientific, modelo TAQ Quantum Access). A separação foi realizada utilizando coluna Hypercarb (50 mm x 2,1 mm, com 5 μm para tamanho de partículas). A eluição da fase móvel foi realizada por gradiente, utilizando as fases A (1 % de ácido fórmico em água) e B (0,1 % de ácido fórmico em metanol), com mudança linear descrita como: 0 min, 95 % A, 5 % B, 300 μL min-1_{; 1,5 min, 75 % A, 25 % B, 300 μL min}-1_{; 1,6 min, 10 % A, 90 % B, 300 μL min}- 1_{; 1,8 min, 10 % A, 90 % B, 500 μL min}-1_{; 3,8 min, 10 % A, 90 % B, 500 μL min}-1_{; 3,9 min,}

95 % A, 5 % B, 500 μL min-1_{; 5,7 min, 95 % A, 5 % B, 500 μL min}-1_{; 5,9 min, 95 %, 5 %,}

300 μL min-1_{. O volume injetado foi de 25 μL, com coluna à temperatura de 50 ºC. As}

recuperações foram iguais a 96,0 ± 8,6 % e 89,4 ± 15,1 % para o glyphosate e seu metabólito AMPA, respectivamente. Já os limites de detecção e quantificação foram iguais a 16,7 e 50 μg L-1_{, respectivamente.}

Padronização

O padrão ‗Branco‘ correspondeu à solução 0,6 N KOH. O ‗Controle‘ correspondeu à adição de 200 μL das soluções padrões de glyphosate e AMPA, ambos na concentração de 100 ng μL-1 _{(Sigma Aldrich, > 99% de pureza) anteriormente à etapa de ajuste de pH. A}

amostra ‗Fortificada‘ correspondeu à adição de 100 μL das soluções padrões de glyphosate e AMPA (100 ng μL-1_{) às amostras de solo (5 g), com 15 mim de tempo de reação para que os}

procedimentos analíticos fossem retomados. O ‗Padrão Coluna Derivatizado‘ correspondeu à solução de 0,7 mL de ácido acético acrescida de 1,5 mL de trimetil ortoacetado, submetida a banho-maria (80 ºC, 1 h), com posterior evaporação total do solvente em concentrador até 35ºC e ressuspensão com 1 mL de acetato de etila. Todos esses padrões (‗Branco‘, ‗Controle‘, ‗Fortificada‘ e ‗Padrão Coluna Derivatizado‘) foram analisados a cada vinte amostras de solo e/ou sedimento.

O padrão ‗Fortificado‘ para as amostras de água foi elaborado pela adição de 200 μL do padrão de glyphosate e AMPA, na concentração de 10 ng μL-1_{, a 10 mL de água grau}

HPLC, os quais também foram analisados a cada 20 amostras.