Formingsprosesser med basis i bruksformer, arkitektur og miljø

No teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol foram avaliados a latência da convulsão (LC), em segundos, a latência de morte (LM), em segundos, e a porcentagem de sobrevivência. Os animais tratados com riparina III, nas doses 25 e 50 mg/kg, por via oral, aumentaram a latência da convulsão [ripIII-25: 91,00 ± 5,22 (7); ripIII-50: 91,13 ± 7,13 (8)] como também aumentaram a latência de morte [ripIII-25: 357,60 ± 42,88 (7); ripIII-50: 356,9 ± 38,7 (7)] comparando com os respectivos controles [LC: 64,15 ± 3,61 (13); LM: 209,5 ± 22,68 (22)] (Tabela 4).

Por via i.p., a riparina III não aumentou significativamente a latência da convulsão [ripIII-25: 79,69 ± 7,83 (13); ripIII-50: 80,08 ± 6,96 (12)], mas aumentou a latência de morte [ripIII-25: 353,4 ± 42,30 (14); ripIII-50: 345,9 ± 44,13 (13)] em relação aos respectivos controles [LC: 61,47 ± 2,40 (19); LM: 210,7 ± 18,68 (23)] (Tabela 4).

O diazepam, 1 mg/kg, como esperado, aumentou a latência da convulsão [DZP-1: 156,1 ± 14,40 (17)] comparando com os controles i.p. e v.o., de acordo com a Tabela 4.

A percentagem de sobrevivência dos animais tratados com riparina III, por via intraperitoneal, foi de 0% em ambas as doses. Contudo, por via oral, 10% dos animais de cada grupo de riparina III (25 e 50 mg/kg) sobreviveram, assim como, 100% dos animais tratados com diazepam sobreviveram (Tabela 4).

TABELA 4 - Efeito da administração intraperitoneal e oral da riparina III e diazepam nas convulsões induzidas por pentilenotetrazol em camundongos.

Grupo (mg/kg) Latência da Convulsão (s) Latência de Morte (s) Sobrevivência (%) Via Intraperitoneal Controle 61,47 ± 2,40 (15) 210,7 ± 18,68 (15) 0 RipIII-25 79,69 ± 7,83 (13) 353,4 ± 42,30 (14)** 0 RipIII-50 80,08 ± 6,96 (12) 345,9 ± 44,13 (13)* 0 Via Oral Controle 64,15 ± 3,61 (15) 209,5 ± 22,68 (22) 0 RipIII-25 91,00 ± 5,22 (7)** 357,6 ± 42,88 (7)** 10 RipIII-50 91,13 ± 7,13 (8)** 356,9 ± 38,7 (7)** 10 DZP-1 156,1 ± 14,40 (7)*** - 100

Os valores representam a média ± EPM da latência da convulsão e latência de morte. O número de animais está representado entre parênteses. Para análise estatística foi realizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05; *p<0,01; ***p<0,001 vs controle. O grupo DZP-1 foi significativo em relação aos controles intraperitoneal e oral.

6. DISCUSSÃO

A utilização de plantas medicinais tornou-se um recurso terapêutico alternativo de grande aceitação pela população e vem crescendo junto à comunidade médica, que preza por plantas cujas atividades biológicas tenham sido investigadas cientificamente, comprovando sua segurança e eficácia (CECHINEL & YUNES, 1998; KINGORN, 2001). Dessa forma, é de fundamental importância que haja estudos pré-clínicos como forma de screening de novas drogas com ações terapêuticas para que posteriormente possam ser realizados estudos mais aprofundados concernente ao potencial farmacológico da droga, assim como a sua segurança.

Aniba riparia (Nees) Mez, um herbáceo da família Lauraceae, popularmente conhecida como “louro”, “louro-faia” e “pau-rosa”, é encontrada na Amazônia, Brasil (MARQUES, 2001). Do fruto verde desta planta foram isoladas três alcamidas, sendo uma delas a riparina III (BARBOSA-FILHO et al., 1987). Alguns trabalhos mostraram que esta substância apresenta efeitos farmacológicos. Castelo-Branco et al., (1991) e Castelo- Branco, (1992) mostraram que a riparina III apresenta efeitos espasmolíticos e Thomas et al., (1994) concluiu que esse efeito estava relacionado com o metabolismo do Ca2+, devido à inibição de influxo de Ca2+ para o meio intracelular e da inibição da liberação dos estoques intracelulares de Ca2+, não envolvendo a participação da geração de AMPc. Além disso, foi verificado, em outros estudos, que a riparina III apresenta atividade antimicrobiana contra cepas multirresistentes de Staphylococcus aureus e Escherichia coli (CATÃO et al., 2005).

O nosso interesse em pesquisar compostos biologicamente ativos aliado com o fato da riparina III apresentar em sua estrutura química, a tiramina, uma amina simpaticomimética de ação indireta, levou-nos a testar os efeitos desta substância. Neste trabalho, os efeitos da riparina III foram estudados em vários modelos de comportamento animal, tais como o campo aberto, rota rod, labirinto em cruz elevado (LCE), placa

de sono induzido por pentobarbital e convulsão induzida por pentilenotetrazol. Estes testes são modelos clássicos para screening de atividades sobre o sistema nervoso central em animais e fornece informações tais como desempenho psicomotor, locomoção, atividades relaxante muscular, ansiolítica, antidepressiva, sedativo/hipnótica e anticonvulsivante.

No estado de ansiedade, as reações de comportamentos defensivos, reflexos autônomos, o despertar e a vigilância, a secreção de corticosteróides e as emoções negativas, ocorrem de uma maneira antecipada, independentemente dos eventos externos. A distinção entre um estado ansioso “patológico” e um “normal” não tem contornos nítidos, mas representa o ponto no qual os sintomas interferem com as atividades produtivas normais (RANG et al., 2003). O aparecimento dos benzodiazepínicos contribuiu para uma melhor compreensão das bases da ansiedade. Essas drogas foram introduzidas na clínica médica há mais de quatro décadas e são os agentes ansiolíticos de escolha devido a sua efetividade e relativa segurança. Entretanto, essas drogas podem induzir tolerância e dependência física (WALKER, 1990). Isto tem direcionado a pesquisa para novos e melhores agentes ansiolíticos. Drogas que reduzem a atividade serotonérgica central, tais como, o agonista parcial do receptor 5-HT1A, buspirona, e o antagonista 5-HT3, ondansetron, apresentam efeitos ansiolíticos, mas não causam sedação, desviando assim, um pouco a atenção dos benzodiazepínicos clássicos.

O estudo comportamental relacionado a ansiedade em modelos animais é baseado na afirmativa de que a ansiedade em animais é comparável a ansiedade em humanos. Apesar disso, não pode ser provado que um animal vive a ansiedade da mesma maneira que um ser humano. Por outro lado, é incontestável que diferentes modelos comportamentais em roedores indicam ansiedade, isto é, mudanças comportamentais e periféricas que, presumivelmente podem estar relacionadas com uma alta atividade do sistema nervoso simpático (OHL, 2003). Portanto, uma analogia, senão uma homologia, pode ser assumida entre a ansiedade em humanos e roedores.

Levando em consideração as várias maneiras de manter o animal sob o estresse, é bem conhecido na literatura, através de estudos de campo e observações laboratoriais, que roedores tendem a evitar a área desprotegida de um ambiente novo a qual são submetidos pela primeira vez (BARNETT, 1975; TREIT & FUNDYTUS, 1989). Em um experimento, geralmente representado por uma área definida, como no campo aberto, os roedores tipicamente começam a explorar o ambiente próximo às paredes enquanto evita a parte aberta, isto é, a área desprotegida. Para garantir que o animal exploraria a área desprotegida, em nosso experimento de campo aberto, colocamos o animal no centro deste ao invés da lateral. Outro ponto causador de estresse é o nível de iluminação do ambiente, sendo uma área clara mais aversiva para roedores, portanto produzindo uma aversão mais pronunciada do que uma área escura. Dessa maneira, em nossos experimentos, colocamos os animais em uma sala fechada pobremente iluminada com uma luz vermelha de 15W.

O teste do campo aberto é empregado para avaliar a atividade exploratória dos animais. A tendência natural do animal em um ambiente novo é a de explorá-lo, apesar do estresse e do conflito provocado por este ambiente (MONTGOMERY, 1958). Desta forma, a locomoção, rearing e grooming em roedores, observados no campo aberto, são os parâmetros comportamentais mais usados para descrever influências dos eventos da vida ou da administração de drogas (MONTGOMERY, 1958; ARAKAWA & IKEDA, 1991; REX et al., 1996).

Dados na literatura demonstraram que a redução na atividade locomotora espontânea dá uma indicação do nível de excitabilidade do sistema nervoso central (MANSUR et al., 1971), e, esta redução pode estar relacionada com a sedação resultante da depressão do sistema nervoso central (OZTURK et al., 1996; PEREZ et al., 1998). No presente estudo, a riparina III não alterou a atividade locomotora dos animais, em ambas doses utilizadas, tanto por via oral como intraperitoneal, sugerindo que a riparina III não apresenta efeito sedativo no campo aberto. O diazepam, na dose de 2 mg/kg, diminuiu a atividade locomotora mostrando seu efeito sedativo.

A atividade de rearing parece estar relacionada com a hiperatividade dopaminérgica. Estudos apontam que o aumento da atividade dopaminérgica induz um maior comportamento de rearing (SWANSON et al., 1997). Em alguns estudos o rearing tem sido focalizado como um aspecto de comportamento exploratório (JOHANSSON & AHLENIUS, 1989), mas outros sugerem que agentes ansiolíticos diminuem o número de rearing (HUGHES, 1972; STOUT, 1994). Nos experimentos deste trabalho, a riparina III reduziu o número de rearing, nas duas doses usadas, em ambas vias de administração. A dose de diazepam usada nesse estudo também reduziu o número de rearing.

De acordo com MacFarland & Reeder, (1974), quase todos os animais gastam uma significante parte do tempo no comportamento de grooming. Embora vários transmissores possam modular a expressão deste comportamento (MOODY et al, 1988; TRABER, et al., 2001), a dopamina está particularmente envolvida (COOLS et al., 2001; DRAGO et al., 1999). Neste estudo, houve uma redução de grooming no campo aberto, com a riparina III, em ambas vias e doses utilizadas nos experimentos. Na literatura, é referido que o aumento de grooming é observado em roedores apreensivos (ARCHER, 1973), e em um grande número de estudos, pesquisadores observaram que drogas ansiolíticas reduzem o grooming no campo aberto (BARROS et al., 1994; DUNN et al., 1981; MOODY et al., 1993).

Corroborando com trabalhos anteriores que observaram redução de rearing e grooming com drogas ansiolíticas, pode-se a partir da redução desses parâmetros induzidos pela riparina III no campo aberto, sugerir possível efeito ansiolítico desta substância, sem apresentar, contudo, um efeito sedativo (não alterou a atividade locomotora espontânea), comum à maioria dos ansiolíticos.

Alguns autores afirmam que os receptores dopaminérgicos D1 e D2 interagem na locomoção e na estereotipia. A locomoção depende da ativação dos receptores D1 (STARR et al., 1989), enquanto o comportamento estereotipado depende do receptor D2 (USHIJIMA et al., 1995). Além disso, tem sido relatado que a redução da atividade locomotora é causada pela diminuição da dopamina, de forma que a locomoção depende do aumento ou

redução desta monoamina (HSICH et al., 1994). Ainda em relação aos efeitos da riparina III no teste do campo aberto e levando em consideração essas afirmativas, pode-se sugerir que, esta substância não estimula os receptores dopaminérgicos do tipo D1, já que não alterou a atividade locomotora espontânea. Com relação ao rearing e o grooming (comportamentos estereotipados), alguns autores afirmam o envolvimento dos receptores dopaminérgicos do tipo D2. Assim sendo, já que a riparina III diminuiu esses parâmetros, pode-se sugerir que há um envolvimento desta substância, no teste do campo aberto, com esse tipo de receptor dopaminérgico, provavelmente estimulando os receptores D2 pré- sinápticos.

Além do campo aberto, outra possibilidade de aumentar a aversão de um roedor contra uma área desprotegida é elevando-a e impedindo o animal de ver o chão, ou a bancada, como pode ser visto nos testes de labirinto em cruz elevado (LCE) e placa perfurada, respectivamente. Desse modo, para ratificar os efeitos ansiolíticos da riparina III, foram realizados mais dois testes para drogas ansiolíticas, o LCE e a placa perfurada, além de um teste para avaliar o efeito sedativo/hipnótico, o tempo de sono induzido por pentobarbital.

Na pesquisa de novos ansiolíticos efetivos e seguros, os farmacologistas investigam na natureza fontes de novos fármacos para ansiedade originados do reino vegetal (PETKOV & STANEVA, 1963). O teste da placa perfurada foi estudado para explorar o potencial ansiolítico da riparina III. Neste teste é medido o comportamento exploratório em roedores (FILE & WARDILL, 1975). O número de vezes que o animal coloca a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips), tem sido registrado como um parâmetro para avaliar as condições de ansiedade em animais. Neste modelo, doses não-sedativas de benzodiazepínicos e outras drogas ansiolíticas, aumentaram o número de head dips em camundongos, enquanto seus antagonistas o reduziram (CRAWLEY, 1985).

Estudos realizados por Takeda et al., (1998), demonstraram que, ansiolíticos benzodiazepínicos, tais como, o diazepam e o clordiazepóxido, apresentaram efeitos consistentes no comportamento de head dips no teste da placa perfurada, ou seja, ambos aumentaram o número de head dips em doses que estes compostos não produziam sedação. Esta observação é consistente com resultados anteriores, que mostraram aumento na freqüência de head dips após injeções de doses não sedativas de diazepam. No entanto, este efeito foi revertido com doses maiores de diazepam, o qual induziu sedação (SUZUKI et al., 1990). Estudos realizados com compostos ansiogênicos, tais como, FG7142 e β-CCM, ambos derivados da β-carbolina, mostraram que estas drogas reduziram o número de head dips (TAKEDA et al., 1998). Estes efeitos sugerem que a redução no comportamento de head dip pode refletir estado ansiogênico do animal, e que ambos os estados ansiolíticos e ansiogênicos podem ser avaliados usando o teste da placa perfurada (TAKEDA et al., 1998). Com base nestes estudos e, em informações que a expressão de um estado ansiolítico em animais pode ser refletida por um aumento no comportamento de head dip, os resultados deste estudo forneceram evidências de que a riparina III apresentou efeito ansiolítico, já que, nas doses de 25 e 50 mg/kg, tanto por via intraperitonal como oral, mostrou aumento deste comportamento.

O teste do labirinto em cruz elevado baseia-se no fato de que roedores têm aversão a lugares abertos e elevados (MONTGOMERY, 1958). Neste modelo, os animais geralmente restringem a maioria de suas atividades aos braços fechados. Uma atividade relativamente baixa nos braços abertos é indicativa de ansiedade. No entanto, o LCE é o modelo mais popular para pesquisas de novos agentes ansiolíticos do tipo benzodiazepínicos (PELOW et al. 1985; RODGERS et al. 1997). Este modelo experimental é muito sensível para determinar a influência do receptor GABAA/Benzodiazepínico no processo de ansiedade, pois, roedores submetidos ao tratamento com ansiolíticos, como por exemplo, diazepam, cruzam mais vezes pelos braços abertos e permanecem mais tempo nestes braços quando comparados aos animais controle (ZANGROSSI JR. 1997) enquanto que, drogas como a buspirona, que atua em receptores serotonérgicos, apresenta resultados muito variáveis em relação a este teste.

No presente estudo, o LCE foi usado para confirmar o efeito ansiolítico da riparina III, sugerido pelo teste do campo aberto e evidenciado no teste da placa perfurada. Como esperado, o diazepam, usado como droga ansiolítica de referência, produziu significante aumento em todos os parâmetros analisados, ou seja, número de entradas nos braços abertos (NEBA), percentual do número de entradas nos braços abertos (PEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) e percentual do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA). A riparina III aumentou todos esses parâmetros quando administrada por via oral, no entanto, quando administrada por via intraperitoneal, aumentou apenas na maior dose (50 mg/kg), os parâmetros NEBA e TPBA.

Neste experimento, foi observado que a riparina III parece ser mais eficaz após administração oral quando comparado com a administração intraperitoneal. Contudo, a aparente discrepância pode ser devido ao diferente número de animais usado em cada condição. Por exemplo, na primeira condição (administração oral) o número de animais utilizado foi maior. É amplamente descrito na literatura que testes comportamentais requerem um maior número de animais por causa da variabilidade do teste. Ainda assim, a riparina III mostrou que apresenta um efeito ansiolítico tanto no teste da placa perfurada quanto no teste do labirinto em cruz elevado, do mesmo modo que o diazepam.

Agentes ansiolíticos aumentam e agentes ansiogênicos reduzem a entrada e o tempo gasto nos braços abertos do labirinto em cruz elevado (PELLOW et al., 1985). De fato, trabalhos anteriores mostram que o flumazenil, antagonista competitivo do receptor GABAA/Benzodiazepínico, preveniu os efeitos ansiolíticos do diazepam no LCE (KURIBARA & MARUYAMA, 1996; KURIBARA et al., 1998; LUSCOMBE et al., 1991). Com a finalidade de investigar o mecanismo de ação do efeito ansiolítico da riparina III, foi utilizado o flumazenil para avaliar o possível envolvimento do sistema gabaérgico. Para tanto, foi escolhido o teste do LCE, por ser mais sensível para testar drogas ansiolíticas do tipo benzodiazepínicas (PELOW et al. 1985; RODGERS et al. 1997). Além disso, a via de administração usada para tratar os animais com riparina III foi a via oral, por ter apresentado melhores efeitos ansiolíticos. Os resultados mostraram que o flumazenil

reverteu o efeito ansiolítico da riparina III em todos os parâmetros analisados, do mesmo modo que reverteu os efeitos do diazepam, sugerindo assim, que a riparina III apresenta efeito ansiolítico, e, este efeito parece estar relacionado com o sistema gabaérgico, mais especificamente envolvido com os receptores GABAA/Benzodiazepínico.

De acordo com a literatura, os benzodiazepínicos, tais como o diazepam, agem como ansiolíticos (em doses baixas) e anticonvulsivantes, produzindo também sedação e efeito relaxante muscular em doses mais altas (ONAIVI et al., 1992; WOLFFGRAMM et al., 1994). Por esta razão, no presente trabalho, foram utilizadas diferentes doses de diazepam nos testes realizados. Por exemplo, nos testes de campo aberto e rota rod foi utilizada uma dose mais elevada (2 mg/kg) para causar sedação e relaxamento muscular, respectivamente. No entanto, nos testes da placa perfurada e LCE, a dose utilizada foi de 1 mg/kg para evidenciar o seu efeito ansiolítico. Ainda com base neste argumento, foi possível verificar o efeito sedativo/hipnótico da riparina III no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital e o efeito anticonvulsivante no teste das convulsões induzidas por pentilenotetrazol.

O teste do tempo de sono induzido por pentobarbital permite verificar se determinada droga possui um efeito sedativo/hipnótico, considerando-se para tanto o conceito de que, quando duas drogas possuem o mesmo efeito farmacológico, eles se somam. Portanto, o princípio deste teste é verificar se uma droga possui a capacidade de potencializar o efeito sedativo e hipnótico do pentobarbital sódico, embora algumas drogas desprovidas de ação central, como por exemplo, a adrenalina e a histamina, também apresentam resultados positivos (RILEY & SPINKS, 1958).

Os resultados da riparina III mostraram uma diminuição da latência do sono em ambas vias e doses, e um aumento da duração do sono em ambas doses por via oral e, na dose de 50 mg/kg, por via intraperitoneal. A literatura diz que a diminuição da latência e o aumento na duração do sono são classicamente relatados por drogas depressoras do SNC (WILLIANSON et al., 1996). No entanto, este teste não é específico, visto que compostos

que interagem com a biotransformação do pentobarbital, pelo complexo citocromo P-450, podem apresentar o mesmo efeito de drogas depressoras no SNC (GOLOUBKOVA et al., 1998). Desse modo, o prolongamento da hipnose pelo pentobarbital sódico pode ser devido às propriedades sedativo/hipnóticas (FUJIMORI, 1965) atribuídas à inibição do metabolismo do pentobarbital (KAUL & KULKARNI, 1978) ou mecanismos centrais envolvidos na regulação do sono (N’GOUEMO et al., 1994). Além disso, o efeito sedativo/hipnótico da riparina III, neste experimento, não foi corroborado no teste do campo aberto, no qual os animais tratados com riparina III, em ambas vias e doses, não tiveram alteração da atividade locomotora espontânea.

As convulsões são propostas como resultado do desequilíbrio das atividades excitatórias ou inibitórias neuronais, seguida do aumento da excitação glutamatérgica ou redução da inibição gabaérgica (ELISABETSKY et al., 1999). As convulsões do tipo tônico-clônica generalizadas podem ser estudadas através de modelos que utilizem a administração sistêmica de substâncias químicas convulsivantes, muito usadas como screening de drogas anticonvulsivantes (SWINYARD, 1949; SWINYARD et al., 1952).

A inibição das convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol (PTZ) é uma metodologia extensamente utilizada para avaliar o efeito anticonvulsivante de drogas em animais (LOWSON et al., 1991). O PTZ é um agente protótipo das substâncias químicas sistêmicas convulsivantes (PAPY et al., 1971). É um derivado tetrazólico (STONE, 1970) que atua de forma semelhante a bicuculina, induzindo convulsões por inibir canais de íons cloreto associados a receptores GABAA. Apresenta ação convulsivante em camundongos, ratos, gatos e primatas, e quando administrado pela via parenteral produz inicialmente abalos mioclônicos, que se mantêm sustentados evoluindo para convulsões generalizadas do tipo tônico-clônica. As convulsões induzidas por PTZ são como descargas elétricas anormais na atividade cerebral (PRINCE et al., 1978). De maneira geral, o PTZ permite a identificação eficaz de compostos contra crises de ausência e permite uma avaliação genérica do potencial anticonvulsivante de uma droga (KUPFERBERG & SCHMUTZ, 1997). Sabe-se que os benzodiazepínicos produzem seus efeitos sedativos, hipnóticos,

ansiolíticos e anticonvulsivantes pela sua interação com receptores GABAA (GOODCHILD, 1993; SHADER & GREEBLAT, 1993).

O diazepam, utilizado como padrão positivo nos experimentos, aumentou a latência da convulsão e obteve 100% de sobrevivência dos animais. A riparina III aumentou a latência da convulsão apenas por via oral, em ambas doses, contudo, aumentou a latência de morte em ambas vias e doses utilizadas. Além disso, por via oral, os grupos tratados com riparina III 25 e 50 mg/kg obtiveram 10% de sobrevivência dos animais. Esses resultados sugerem que a riparina III apresenta um possível efeito anticonvulsivante e que este efeito pode estar relacionado com o sistema gabaérgico devido a sua interação com o receptor GABAA/Benzodiazepínico, como visualizado no teste do labirinto em cruz elevado.

O teste da barra giratória rota rod foi proposto por Dunham & Miya, (1957). Consiste em colocar camundongos sobre uma barra que gira a uma velocidade constante e verificar a capacidade do animal equilibrar-se sobre a mesma. Esse teste mede o efeito de relaxamento muscular ou incoordenação motora (CARLINI & BURGOS, 1979). Nesse caso, quanto mais intenso for o efeito, menor será o tempo em que o animal consegue se equilibrar sobre a barra. Ressalta-se, no entanto, que se trata de um método não-específico, uma vez que mede indistintamente, efeitos neurológicos, estimulantes e depressores sobre a coordenação motora, aos quais também é atribuído o termo neurotoxicidade (DALLMEIER & CARLINI, 1981). A riparina III não alterou a coordenação motora no teste do rota rod, nas doses e vias utilizadas, diferenciando-se do diazepam 2 mg/kg (droga ansiolítica que nesta dose apresenta efeito relaxante muscular), que aumentou o número de quedas e diminuiu o tempo de permanência na barra. Estes resultados sugerem que as ações da