O valor de pH do meio influencia profundamente a solubilidade de uma molécula protéica, já que por meio de alterações na carga total desta molécula ocorrerão também mudanças nas interações proteína-solvente, proteína-proteína e proteína-polímero.
A carga total de uma molécula protéica como a BSA depende em grande parte do valor de pH do meio. Após o enovelamento da proteína, as regiões hidrofóbicas encontram-se normalmente no interior da molécula, enquanto que as regiões hidrofílicas encontram-se normalmente na superfície da molécula. Estas últimas regiões apresentam grupos de substituição nos seus aminoácidos que podem estar protonados ou desprotonados conforme o valor de pH, fenômeno este que pode ser descrito matematicamente pela equação de Henderson-Hasselbalch:
] [ ] [ log HA A pH pKa ? ? ?
Em que pKa é –log (x) da constante de dissociação, pH é –log [H+
], A- a base conjugada
do ácido e HA o ácido na forma molecular. Levando-se em conta que o valor de pKa é distinto para cada grupo de substituição, utiliza-se esta equação para, dado o pH do meio, inferir sobre o estado (protonado ou desprotonado) do grupo de substituição. São estes grupos que interferem na carga total da molécula de proteína, que será a somatória de todas as cargas. Para simplificações na modelagem matemática assume -se que a densidade superficial de cargas na molécula protéica seja homogênea.
Outro conceito importante é o de ponto isoelétrico ou pI, que é definido como sendo o valor de pH no qual a carga total da molécula protéica é igual a zero. Acima do pI a superfície da
molécula está negativamente carregada e abaixo do pI a superfície da molécula está positivamente carregada. A precipitação da proteína deve ocorrer mais facilmente para este valor de pH, uma vez que a repulsão eletrostática é mínima quando a carga total da molécula é zero.
De maneira geral, o aumento do pH promove a formação do ELS. Em relação à mistura (ELL+ELS), a concentração do ELS aumenta com o aumento do pH, como é evidenciado pelo valor apontado pelo prolongamento da linha de amarração. Tendo em mente que o pI da BSA é de aproximadamente 4,8, pode-se afirmar que, nos experimentos realizados o valor experimental para o pH=5,0 é aquele que mais se aproxima do pI. Como discutido anteriormente, o pI é o ponto no qual a carga total da molécula protéica é nula. Logo, com o efeito de repulsão eletrostática diminuído, há uma maior facilidade de interação entre as moléculas protéicas, o que muitas vezes leva à precipitação ou formação de cristal.
Em relação aos dados obtidos para o PEG-2000, observou-se a influência do pH na formação do ELL e da mistura (ELL+ELS). Para as retas referentes ao ELS não há variação significativa: o prolongamento de todas leva à concentração de 100% de BSA. Há um aumento no coeficiente angular das linhas de amarração para o ELL bem como um enriquecimento de BSA na fase topo conforme o valor de pH aproxima-se do pI. Isso indica que, para aquele valor de concentração de PEG na alimentação (no caso 15%), há uma progressiva dificuldade de haver a formação de um ELL. Essa tendência será observada também para todos os outros PEG’s. O fenômeno pode ser explicado pelo fato de que com a carga total próxima de zero no pH = 5,0 para aquela concentração de PEG na alimentação pode haver uma migração energeticamente favorável de uma parcela das moléculas de BSA para a fase superior, a qual é rica em moléculas de PEG que são eletricamente neutras. Para as retas referentes à mistura (ELL+ELS) que tiveram
como ponto de alimentação 20% de PEG há um aumento no coeficiente angular da linha de amarração conforme o valor de pH aumenta. O fenômeno de enriquecimento na concentração de BSA para o caso do ELL pode ser explicado pelo mesmo fato de que com a carga total próxima de zero no pH = 5,0 para aquela concentração de PEG na alimentação pode haver uma migração energeticamente favorável de uma parcela das moléculas de BSA para a fase superior, a qual é rica em moléculas de PEG que são eletricamente neutras. No entanto, pode também ter ocorrido um fenômeno de enriquecimento na concentração de BSA para o caso do ELS, que se explica pelo fato de que com a carga total próxima de zero no pH = 5,0 para aquela concentração de PEG na alimentação há uma diminuição nas interações eletrostáticas (repulsivas) entre as moléculas protéicas, o que muitas vezes leva à precipitação ou formação de cristal.
As Figuras a seguir representam as dados referentes ao PEG-2000.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 XPEG g/g X BSA g/g
Figura 4. Sistemas contendo BSA e PEG 2000, a 25ºC, com valor de pH igual a 4,0, o ELL é representado por círculos, o equilíbrio de transição é representado por losangos e o ELL é
representado por círculos
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 XPEG g/g X BSA g/g
Figura 5. Sistemas contendo BSA e PEG 2000, a 25ºC, com valor de pH igual a 5,0, o ELL é representado por círculos, o equilíbrio de transição é representado por losangos e o ELL é
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 XPEG g/g XBSA g/g
Figura 6. Sistemas contendo BSA e PEG 2000, a 25ºC, com valor de pH igual a 6,0, o ELL é representado por círculos, o equilíbrio de transição é representado por losangos e o ELL é
representado por círculos
Em relação aos dados obtidos para os demais PEG’s as mesmas tendências quanto ao aumento do valor de pH foram observadas.
Para as retas referentes ao ELS não há variação significativa. Conforme o valor de pH aumenta, o coeficiente angular das retas de amarração para o ELL também aumenta, relacionado a um enriquecimento de BSA na fase topo decorrente da dificuldade de haver a formação do ELL. Em relação à mistura (ELL+ELS) há um enriquecimento do ELS conforme o valor de pH aumenta. Particularmente para o PEG-10000, houve com o valor de pH = 6,0 uma generalização do ELS para três sistemas (15%, 20% e 25% de PEG na alimentação) e a formação da mistura
(ELL+ELS) para o sistema com 10% de PEG na alimentação, que nos demais valores de pH apresentou o ELL.
Nos casos em que mais de um sistema com ELS foi observado, os prolongamentos de linha de amarração encontraram-se sempre na composição de 100% de BSA. Como esse ponto é comum a todos os sistemas, sugere-se que a BSA precipitada seja composta somente de proteína. A única exceção são os sistemas contendo PEG 6000. Não se pôde encontrar uma razão para esse comportamento. Essa abordagem de inferência da composição do sólido formado pelo prolongamento das linhas de amarração foi recentemente desenvolvida e está apresentada em Watanabe (2007).