O sobrenadante de cada amostra que foi congelada ao final do processo de expressão e posteriormente analisado em gel de SDS page. Além dos clones 1 e 2, foram aplicados no gel amostras de controle negativo que não tinham o gene de interesse. O resultado do gel indicou a presença de duas bandas sendo correspondentes aos clones 1 e 2, ambos com 24 h. As duas bandas apareceram na marca acima de 20 kDa aproximadamente, o que seria a proteína não glicosilada, porém, isso não foi confirmado. Como a proteína de interesse apresenta um peso molecular aproximado de 40 kDa contando com a glicosilação, o resultado do gel indicou que as bandas marcadas com setas indicam que o experimento de expressão não confirmou se as bandas estão relacionadas com a proteína de interesse , devendo ser otimizado.
Figura 48: Gel de proteína SDS-PAGE
6 CONCLUSÃO
Com os resultados obtidos nos experimentos de modelagem molecular dos quatro modelos quiméricos, foi possível identificar as principais regiões que apresentaram problemas nas estruturas. Nas avaliações feitas com o programa Verify 3D, foram detectados vários problemas relacionados ao ambiente químico ocupado por aminoácidos que se encontram nas regiões linkers., no entanto, pouquíssimos problemas foram encontrados nos linkers em relação aos ângulos torcionais da cadeia principal, cujos dados foram apresentados na forma de diagrama de Ramachandran. Os principais problemas encontrados no diagrama de Ramachandran ocorreram em regiões próximas das cadeias alfa e beta do eCG, tais problemas foram encontrados nas quatro construções citadas no trabalho. Em todas as construções, a melhor parte das estruturas consistiu nos domínios CH2 e CH3 da IgG.
Em relação aos linkers, os resultados demonstraram problemas quanto ao ambiente químico ocupado pelos resíduos que os compõem, assim como problemas de geometria, principalmente no linker CTP, portanto, há certa dificuldade para as estruturas atingirem enovelamento satisfatório por conta das regiões linkers, pois não há como saber como seria o movimento dessas estruturas sem um experimento de dinâmica molecular.
O linker CTP que faz parte da própria cadeia beta do eCG é uma porção importantíssima, já que possui muitos sítios de glicosilação importantes para o funcionamento da estrutura, portanto, optou-se por não exclui-lo das construções.
Os experimentos feitos com Pichia pastoris resultaram no processo de transformação em que as colônias cresceram contendo o gene para a expressão da proteína eCG. Entretanto, apesar dos resultados da expressão indicarem a presença da proteína não glicosilada, não foi confirmada a identidade da banda como sendo a proteína de interesse, além disso, não foi possível identificar a proteína através de técnicas com anticorpo contra eCG.
7 PERSPECTIVAS
Além de realizar experimentos com dinâmica molecular das estruturas, as perspectivas para a continuidade do projeto seriam escolher uma das construções para que a mesma possa ter o gene sintetizado e inserido em um vetor de expressão apropriado para clonagem e expressão do gene. Além disso, espera-se que a produção da proteína seja obtida numa escala que permita sua purificação e caracterização bioquímica e biofísica, como, por exemplo, estudos estruturais por cristalografia da eCG já que a mesma não apresenta estrutura cristalográfica no PDB. Concomitantemente, devem ser feitos testes em animais que validem sua atividade in vivo. Finalmente, o escalonamento do processo de produção para atingir a larga escala e substituir a eCG obtida das éguas prenhes.
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