A detecção eletroquímica da hibridização de DNA e RNA pode ser realizada, basicamente, de quatro maneiras distintas:
(1) monitoramento do aumento / decréscimo da corrente de pico de oxidação / redução de uma molécula eletroquimicamente ativa capaz de se ligar ao DNA na forma de simples fita ou dupla fita;
(2) monitoramento do aumento / decréscimo da corrente de pico de oxidação / redução das bases nitrogenadas eletroativas presentes no DNA, tais como a guanina e a adenina;
(3) monitoramento do sinal eletroquímico de um substrato, após a hibridização com uma sonda repórter marcada com uma enzima;
(4) monitoramento do sinal eletroquímico de nanopartículas metálicas ligadas à sonda de captura após a sua hibridização com a sequência alvo (KERMAN, 2004).
Os métodos que utilizam marcadores são significativamente mais populares do que aqueles que não os utilizam, pois existem muito mais maneiras nas quais a transdução pode ser planejada com alta sensibilidade e seletividade. A utilização de mediadores eletroquímicos é uma maneira, amplamente empregada, de promover a oxidação indireta do DNA.
Os métodos indiretos requerem que as moléculas mediadoras sejam capazes de sofrer um processo de transferência eletrônica reversível na superfície do eletrodo. Portanto, os indicadores da hibridização são moléculas pequenas e eletroativas capazes de se intercalar na fita de DNA ou se ligar aos sulcos da molécula de DNA. Geralmente, essas moléculas indicadoras possuem maior afinidade pelo DNA de fita dupla, porém podem também ser
moléculas que se ligam preferencialmente ao DNA simples fita. Sendo assim, a concentração da molécula indicadora na superfície do eletrodo varia quando a hibridização ocorre, resultando em uma variação do sinal eletroquímico. Além de viabilizar a diferenciação entre o DNA dupla fita e de fita simples, a molécula indicadora deve possuir uma resposta voltamétrica bem definida e a um baixo potencial. As moléculas indicadoras mais comuns são o azul de metileno e alguns corantes orgânicos, assim como a antraquinona, daunomicina, etc (ODENTHAL, 2007; LIU, 2012).
Os ensaios eletroquímicos com DNA que utilizam enzimas como amplificadores de sinal foram desenvolvidos por comparação com os imunoensaios enzimáticos. Estas são capazes de amplificar o sinal analítico, promovendo, desta forma, alta sensibilidade. Geralmente, o sinal analítico é baseado em um processo redox do produto de uma reação enzimática. As enzimas podem ser ligadas diretamente a uma fita de DNA ou via interação estrepitavidina/avidina-biotina entre outras. A utilização de enzimas como moléculas marcadoras em ensaios de afinidade é devido à sua capacidade de transformar o evento de hibridização em uma ampla faixa de moléculas detectáveis. As enzimas mais comumente utilizadas são a fosfatase alcalina, peroxidase de raiz forte e a glicose oxidase. Todas essas enzimas possuem uma alta estabilidade relativa, baixo custo e alta velocidade de conversão (PAREDES, 2012).
A nanotecnologia têm se mostrado um campo interdisciplinar emergente desde o final da década de 80. Os nanomateriais possuem uma superfície particular com tamanho reduzido e propriedades macroscópicas de tunelamento quântico, o que fornece a estes materiais características mecânicas, elétricas, magnéticas, óticas e térmicas especiais, além da atividade química. Os nanomateriais tornaram-se uma ferramenta atraente para aplicação na detecção eletroquímica, pois possuem propriedades únicas que são de grande valia para a área de biossensores eletroquímicos de DNA (LIU, 2012).
A detecção eletroquímica direta do DNA envolve a medida de uma variação físico- química ocorrendo na superfície do transdutor devido à hibridização do DNA (LIU, 2012). O monitoramento do sinal de oxidação da base nitrogenada guanina, é de longe, o método sem marcação mais popular de detecção do evento biológico de hibridização. Isso ocorre devido a sua simplicidade, versatilidade, podendo ser utilizado também no estudo de pequenas moléculas capazes de se ligarem ao DNA. A guanina é a base nitrogenada mais facilmente oxidável, com um pico de oxidação sendo observado em potencial ao redor de 1,0 V (vs. Ag/AgCl) na maioria dos materiais eletródicos (potenciais mais anódicos são observados em nanotubos de carbono do tipo bambu) (ODENTHAL, 2007; POURNAGHI-
AZAR, 2009). Sua oxidação é reportada como sendo uma reação irreversível envolvendo quatro elétrons (Figura 8). Desta forma, a detecção da hibridização é possível devido ao fato da disposição das bases influenciar no sinal eletroanalítico. Assim, o DNA nativo (dsDNA), o desnaturado (ssDNA) e o degradado apresentam, cada um, um comportamento característico (WANG, 2000; MARQUES, 2009).
Figura 8: Reação de oxidação da base nitrogenada guanina sobre a superfície de carbono (WANG, 2000).
Segundo trabalhos descritos na literatura, o monitoramento baseado no sinal de oxidação da guanina, presente na sonda e no DNA alvo, na superfície de eletrodos de carbono é a estratégia mais simples, rápida e aplicável (WANG, 2000; MARQUES, 2009; POURNAGHI-AZAR, 2009).
Atualmente os eletrodos impressos têm sido desenvolvidos como uma ferramenta adequada para a execução de análises eletroquímicas devido às suas propriedades únicas, tais como, tamanho reduzido, baixo limite de detecção, resposta rápida e alta reprodutibilidade. Além disso, a tecnologia dos eletrodos impressos é uma técnica bem estabelecida para a fabricação de biossensores.
As tintas de carbono, ouro, platina e prata são as mais empregadas na fabricação de eletrodos impressos. No entanto outros materiais podem ser facilmente utilizados. As tintas de carbono e ouro são amplamente utilizadas como material eletródico para o desenvolvimento de sensores descartáveis.
A tinta de carbono é especialmente utilizada devido à sua química superficial, baixa corrente de fundo, ampla janela de potencial, baixo custo e passividade química. No entanto, a velocidade de transferência eletrônica nos eletrodos a base de tinta de carbono é baixa quando comparada àquela obtida com eletrodos metálicos. Entretanto, esta desvantagem pode ser superada por meio da modificação da superfície com nanoestruturas, tais como nanotubos de carbono ou nanopartículas de ouro. Estes melhoram a transferência eletrônica na superfície do eletrodo e, consequentemente, as características analíticas oferecidas pelo sensor (PAREDES, 2012).
Portanto, o desenvolvimento de genossensores utilizando como transdutor eletrodos impressos de carbono possibilita a combinação da alta seletividade do evento de hibridização com a compatibilidade de microfabricação (LUO, 2009).