A autorização de introdução no mercado de novos medicamentos requer uma avaliação abrangente do seu potencial genotóxico. Extensas revisões mostram que muito compostos que são mutagênicos nos testes de mutação bacteriana reversa (Ames) são carcinogénicos em roedores. A adição de testes in vitro com células de
mamíferos aumentam a sensibilidade na deteção de genotoxicidade e amplia a deteção de eventos genéticos, porém diminui a especificidade, isto é, aumenta a incidência de resultados positivos que podem não estar relacionados com carcinogenotoxicidade em roedores (International Conference on Harmonisation 2011).
A utilização de uma bateria em testes é considerada necessária uma vez que nenhum teste é capaz de detetar todos os mecanismos genotóxicos relevantes para a tumorigênese. São considerados como testes padrão para os estudos de genotoxicidade as seguintes opções (International Conference on Harmonisation 2011):
Avaliação da mutagenicidade através do teste de mutação reversa bacteriana. Esse teste tem mostrado a deteção de mudanças genéticas relevantes e a maioria da genotoxicidade em roedores e carcinogénese humana;
Avaliação de alterações cromossómicas em células de mamíferos in vitro e/ou in vivo.
Vários sistemas in vitro com células de mamíferos são largamente utilizados e considerados devidamente validados, entre eles estão: ensaio de aberração cromossômica metafásica, ensaio com micronúcleos e ensaios de mutação genética (MLA - Mouse Lymphoma Assay) com células de linfoma de ratinho (L517Y Tk – timidina quinase). Esses três testes são considerados atualmente igualmente adequados e portanto, considerados intercambiáveis para a avaliação de dano cromossômico quando utilizados em conjunto com outros testes de genotoxicidade. Por essa razão pode optar-se por uma análise em micronúcleos de eritrócitos (no sangue periférico ou medula óssea) ou em células de medula óssea em metáfase. Na análise citogenética também podem ser usados linfócitos de animais tratados com a substancia teste, embora tal método seja menos difundido (International Conference on Harmonisation 2011).
Nos testes in vivo e in vitro que avaliam aberrações cromossómicas em células em metáfase podem ser detetados um amplo espectro de alterações na integridade cromossômica. Rutura da cromatina ou dos cromossomas podem resultar em formação de micronúcleos, portanto os testes que detetam tanto
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aberração cromossómica como micronúcleos são considerados indicados para a deteção de clastógeneos. Os micronúcleos também podem ser formados na fase de anáfase, desta forma será possível detetar o potencial dos compostos em induzir aneuploidia. O teste MLA deteta mutações no gene Tk que resulta tanto em mutações genética como em dano cromossómico, há evidências que esse teste possa demonstrar a perda de cromossomas (International Conference on Harmonisation 2011).
Existem duas opções de bateria de testes padrão que são considerados adequados para os estudos de genotoxicidade, tanto no Brasil como na Europa. Como pode ser visto abaixo (International Conference on Harmonisation 2011; Agência Nacional de Vigilância Sanitária 2013).
Opção 1
Um teste para mutação genética em bactérias;
Um teste citogenético para avaliação de dano cromossómico (in vitro - teste de aberração cromossómica em metáfase ou teste de micronúcleos) ou um teste in vitro de mutação genética em célula de linfoma tk de ratinho;
Um teste in vivo para genotoxicidade, geralmente um teste de dano cromossómico utilizando células hematopoiéticas de roedores, também para micronúcleo ou aberrações cromossômicas em células na metáfase.
Opção 2
Um teste para mutação genética em bactéria;
Uma avaliação de genotoxicidade in vivo em dois tecidos, geralmente um teste de micronúcleo usando células hematopoiéticas de rato e um segundo ensaio in vivo. A guideline ICH S2-R1 complementa descrevendo que o segundo teste normalmente é quebra da hélice de ADN em células do fígado, a menos que sua utilização não seja adequada.
Historicamente existe uma maior experiência com a Opção 1, obtida com as guidelines ICH S2A e S2B. Entretanto, as duas opções são consideradas igualmente aceitáveis. Quando ocorre resultado positivo nos ensaios in vitro com células de
mamíferos, os resultados claramente negativos em dois ensaios in vivo devidamente conduzidos, com tecido exposição adequados, são considerados provas suficientes para atestar a ausência de potencial genotóxico (International Conference on Harmonisation 2011).
Em ambas as Opções de estudos in vivo as doses podem ser administradas de forma única ou reiterada. Em casos de administrações reiteradas, os testes devem ser planeados para incorporar parâmetros genotóxicos (endpoints) ao estudo, se for justificado cientificamente. Quando mais de um parâmetro for avaliado em ensaios in vivo, recomenda-se estudos com dose única. Muitas vezes, existem suficientes informações sobre adequamento de dose nos estudos toxicológicos de dose reiterada antes de iniciar os estudos de genotoxicidade. Tais dados podem ser usados para determinar quando será apropriado utilizar dose aguda ou reiterada (International Conference on Harmonisation 2011).
Os resultados negativos dos compostos nos testes de genotoxicidade, realizados e avaliados conforme os parâmetros mais atuais descritos nas guidelines, fornecem garantia suficiente da ausência de atividade genotóxica e testes adicionais não serão necessários. Compostos que apresentem resultados positivos nos testes padrão deverão, dependendo do seu uso terapêutico, ser testados de forma mais ampla (International Conference on Harmonisation 2011).
Existem diversos ensaios in vivo que podem ser usados nos testes da Opção 2, sendo que alguns deles podem ser integrados nos estudos de dose reiterada. O fígado é o tecido tipicamente escolhido em função do nível de exposição e capacidade de metabolização, mas a escolha do tecido e do estudo devem basear- se no conhecimento sobre o potencial mecanismo de ação, do metabolismo in vivo, e o nível de exposição dos tecidos alvos (International Conference on Harmonisation 2011).
Mudanças numéricas em cromossomas podem ser evidenciadas em ensaios com células de mamíferos (in vitro) e ensaios de micronúcleos (in vitro e in vivo). Elementos dos protocolos padrão que podem indicar potencial genotóxico são a elevação no índice mitótico, indução de poliploidia e avaliação de micronúcleos. O teste preferencial nos testes citogenéticos da Opção 2 é o teste de micronúcleos
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porque incluem uma maior capacidade para detetar perda cromossômica (potencial para aneuploidia) (International Conference on Harmonisation 2011).
O guia da Anvisa (2013), assim como o guia ICH S2-R1 (2011), descrevem que:
“Um ensaio de mutação genética é geralmente considerado suficiente para dar suporte a todos os estudos clínicos de dose única. Estudos com doses múltiplas necessitarão de suporte de pelo menos um dos dois conjuntos de testes descritos como “opção 1” e “opção 2”. E os resultados dos testes de genotoxicidade devem estar concluídos anteriormente à realização das Pesquisas Clínicas fase 2.”
A sugestão de tais testes não implica que outros estudos sejam inadequados ou inapropriados, e testes adicionais podem ser realizados para obtenção de mais dados sobre o composto. Espécies alternativas, incluindo não roedores, podem ser usadas conforme as necessidades do estudo, desde que o método empregue seja devidamente validado (International Conference on Harmonisation 2011).
Em alguns casos, os testes padrão podem ser modificados, sendo tal procedimento aconselhado (International Conference on Harmonisation 2011):
Como suporte para estudos clínicos exploratórios; Para compostos-teste tóxicos em bactérias;
Para compostos que tenham alerta estrutural para atividade genotóxica; Quando exista limitação em relação ao uso de testes in vivo.
Resultados de estudos comparativos têm demonstrado que, no sentido qualitativo, muitas mutações em células germinais são detetadas como genotoxicidade em testes com células somáticas, porém apresentam resultado negativo nos testes in vivo o que indica a ausência de genotoxicidade em células germinativas (International Conference on Harmonisation 2011).