Data Acquisition System (DAS) (Jon Park, 2003) (Anon., u.d.) (Monitor Systems, u.d.)

Segundo Birkedal-Hansen (1993) a degradação da matriz extracelular envolve mecanismos distintos sendo iniciada pela dissolução mediada por metaloproteinases da matriz (MMPs) ou pela plasmina.

A regulação do turnover das macromoléculas da matriz extracelular é crítica para uma série de processos biológicos importantes, sendo realizada por enzimas

proteolíticas extracelulares excretadas localmente pelas células que pertencem a uma de duas classes: as metaloproteases ou as serinoproteases (ALBERTS et al., 1997; GRENIER; MAYRAND, 2001; PEREIRA et al., 2005; SORSA; TJÄDERHANE; SALO, 2004).

Sternlicht e Werb (2001) explicam que as enzimas proteolíticas são

classificadas em exopeptidases e endopeptidases quando clivam,

respectivamente, ligações terminais ou internas dos peptídios.

As metaloproteinases são um grupo de endopeptidases, dependentes de Ca++ ou Zn++ ligados no sítio ativo para possuírem atividade (ALBERTS et al. 1997) classificadas em 5 superfamílias, sendo uma delas a superfamília metzincin que contém um domínio com 3 histidinas que se ligam ao zinco no sítio catalítico. A superfamília metzincin é subdividida em 4 famílias: as serralisinas, as astacinas, as ADAMs (adamalisinas) e as metaloproteinases da matriz (MMPs) (MOTT; WERB, 2004; STERNLICHT; WERB, 2001).

As MMPs são uma família de enzimas proteolíticas que degradam os componentes da matriz extracelular como o colágeno, a gelatina e a elastina (HAAKE et al., 2004). As MMPs dos vertebrados atuam em diversos substratos, sendo capazes de degradar virtualmente todos os componentes da matriz extracelular (De SOUZA et al., 2005; STERNLICHT; WERB, 2001).

Como a cada momento são descobertos novos membros da família das MMPs, é difícil dizer com segurança quantas enzimas existem. Birkedal-Hansen (1993) afirma que a família dos genes MMP codificam pelo menos nove endopeptidases metal-dependentes.

Sternlicht e Werb (2001) afirmam que, até aquele ano, foram identificadas 25 MMPs nos vertebrados e 22 homólogos em humanos, além de outras nos invertebrados. Em 2002, De Souza e Line afirmaram que até aquele momento existiam pelo menos 16 MMPs humanas caracterizadas.

Rundhaug (2003) afirma que as MMPs são uma família de mais de 20 endopeptidases que contém zinco capazes de degradar vários componentes da matriz extracelular. Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) afirmam que as MMPs correspondem a uma família 23 de enzimas que degradam componentes da matriz extracelular, incluindo as membrana basais.

Todas as MMPs são derivadas de um protótipo estrutural com cinco domínios onde pela adição ou deleção de um ou mais domínios tem-se as variadas formas de MMP com suas particularidades. Todas as formas contêm um sítio de ligação para um Zn++ que se acredita que constitua o sítio ativo da enzima (BIRKEDAL-HANSEN, 1993; De SOUZA et al., 2005; PEREIRA et al., 2005; REYNOLDS; MEIKLE, 1997; RUNDHAUG, 2003; STERNLICHT; WERB, 2001).

As metaloproteinases são referidas de acordo com nomes específicos ou por uma numeração e agrupadas de acordo com a sua estrutura (NABESHIMA et

al., 2002).

Cotrim et al., em 2002, as classificam em 4 grupos principais, o das colagenases intersticiais, o das colagenases tipo IV, o das estromelisinas e o das MMPs ligadas à membrana.

Segundo Rundhaug (2003) as MMPs existem na forma solúvel (MMP-1, -3, -8, -10, -12, -13, -19 e -20, por exemplo) e na forma ligada à membrana, com um domínio trans-membrana e uma curta cauda citoplasmática, sendo então chamadas de MT-MMPs (MT1-, MT2-, MT3-, MT4- e MT5-MMP).

De Souza e Line (2002) e Pereira et al. (2005) listam algumas das MMPs humanas catalogadas, de acordo com o substrato em que atuam, como colagenases (MMP-1, -8 e -13), gelatinases (MMP-2 e -9), estromelisinas (MMP-3 e -10), metaloelastase (MMP-12), enamelisina (MMP-20) e metaloproteinases ligadas à membrana plasmática (MMP-14, -15, -16, -24, -17, -25 e -23).

Para que a degradação seja controlada rigorosamente, vários mecanismos de regulação atuam como a secreção das proteases como precursores inativos,

pró-enzimas ou zimogênios, a ação de inibidores teciduais de metaloproteases (TIMPs) e os inibidores de serinoproteases (serpinas) (ALBERTS et al. 1997).

Na maioria dos casos as MMPs não são sintetizadas até serem necessárias e a sua transcrição pode ser induzida por sinais como citocinas, fatores de crescimento e estresse mecânico. A ativação das MMPs ocorre por ação de proteases séricas como plasmina e funina e, como acontece com algumas MMPs, por ação de outras MMPs que podem ativar outros membros da família como a já conhecida ativação da MMP-2 pela MT1-MMP que se dá pela remoção de um pró-domínio resultando em uma forma ativa, geralmente de peso molecular menor (RUNDHAUG, 2003; SORSA; TJÄDERHANE; SALO, 2004).

Regulação adicional da atividade das MMPs é exercida por inibidores

endógenos como a α2-macroglobulina e os inibidores teciduais de

metaloproteinases (TIMPs). As TIMPs são em número de 4 (TIMP-1, -2, -3 e -4) e sabe-se que além de exercer atividade de inibição das MMPs, também participam, em alguns casos, no processo de sua ativação como no caso da TIMP-2 que é necessária para a ativação da pró-MMP-2 pela MT1-MMP (RUNDHAUG, 2003, SORSA; TJÄDERHANE; SALO, em 2004).

A inibição das MMPs é também possível através de produtos sintéticos

como os quelantes do íon Zn2+_{, como batimastat e marimastat, e através do uso}

de tetraciclinas que possuem o potencial de inibir as MMPs por mecanismos como inibição da expressão do RNAm para MMPs, interferir com o processo de ativação da pró-enzima e tornar a MMP ativada mais susceptível à degradação (SORSA; TJÄDERHANE; SALO, 2004).

Segundo Birkedal-Hansen (1993) a atividade das MMPs é regulada pelo próprio processo de transcrição dos genes que as codificam, pela ativação de precursores, pela diferença na especificidade dos substratos e por inibidores. A regulação transcricional é mediada por citocinas, como as interleucinas e fatores de crescimento, e por hormônios como o paratormônio os quais têm a capacidade de estimular a transcrição de algumas e inibir as de outras. Componentes

microbianos como os LPS e lectinas possuem também a capacidade estimular a transcrição de certos tipos de colagenases. A regulação através da ativação de precursores se dá pela ruptura da ligação de um resíduo Cys do propeptídio do sítio ativo contendo o Zn++. Alguns inibidores têm também a capacidade de regular a ação das MMPs, são eles as α-macroglobulinas e os Inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs). As α-macroglobulinas têm a capacidade de capturar as moléculas de MMP através de ligações específicas. Os TIMPs, formam complexos bimoleculares não covalentes com formas ativas ou latentes de MMPs. Diferentes células produzem e liberam MMPs de diferentes maneiras. O padrão de resposta da MMP dos PMNs é singular devido ao armazenamento em grânulos e liberação rápida levando a um substancial aumento nos níveis destas enzimas em questão de minutos, mantendo a resposta pelo recrutamento de novas células se o estímulo permanece.

Reynolds e Meikle (1997) relatam que a ativação das MMPs é mediada por fatores como a plasmina, capaz de ativar a colagenase e a estromelisina-1. A estromelisina também pode participar da ativação de outras MMPs como a MMP-9 (gelatinase-B) e a colagenase. Alguns produtos exógenos como os lipopolissacarídeos (LPS) liberados pelas bactérias do biofilme dentário podem ativar colagenases. A MMP ligada a membrana (MT1-MMP ou MMP-14) também participa no processo de ativação de colagenases.

Sternlicht e Werb (2001) relatam que para exercerem sua função, nos processos fisiológicos ou patológicos, as MMPs precisam estar presentes no tipo celular e região pericelular no momento certo, na quantidade certa e precisam ser ativadas ou inibidas apropriadamente. São, portanto, fortemente reguladas nos níveis transcricional e pós-transcricional, assim como no nível protéico por ativadores, inibidores e por sua localização na superfície celular. A maioria das MMPs são reguladas no nível transcricional e estabilização pós-transcricional do RNAm. Quanto à secreção, a maioria das MMPs são secretadas tão logo seja traduzido o seu RNAm, sendo então constitutivas do tecido, no entanto, a MMP-8 e a MMP-9 podem ser sintetizadas por granulócitos na medula óssea sendo

armazenadas em grânulos dos neutrófilos circulantes e liberadas quando estes são ativados por mediadores inflamatórios.

Segundo Birkedal-Hansen (1993) a colagenase dos PMN são liberadas de grânulos específicos existentes nestas células quando estas são ativadas enquanto que as dos fibroblastos são transcritas de acordo com a demanda. O grupo das estromelisinas atuam em diversos substratos como a proteína núcleo das proteoglicanas, colágeno tipos IV e V, fibronectina e laminina e é expressada por células estromais mediante estímulos por citocinas como o IL-1, o EGF e o TNF-α. As gelatinases são talvez as mais distribuídas das MMPs e podem ser produzidas por fibroblastos, queratinócitos, células endoteliais, monócitos/ macrófagos, osteoblastos e condrócitos. Algumas formas de gelatinases podem ser expressas por PMNs. Além da proteína gelatina, estas enzimas podem clivar elastina e colágeno dos tipos IV, V, VII e X.

Segundo Wahl e Corcoran (1993) as lesões inflamatórias crônicas são povoadas por células mononucleares como monócitos e macrófagos, portanto estas células podem ser importantes fontes de mediadores da destruição tecidual. Já foi demonstrado que estas células são capazes de produzir várias metaloproteinases da matriz como colagenases que degradam colágenos I, II e III, colagenase de 92 kDa capazes de degradar gelatina e colágenos tipo IV e V e estromelisina que degrada a fibronectina, as proteoglicanas, e a laminina e os colágenos IV e V. A produção de metaloproteinases por estas células é dependente de ativação primária por substâncias como lipopolissacarídeos bacterianos (LPS), concanavalina A (Con A) e linfocinas que levam à produção de prostaglandina E2 (PGE2) e AMP cíclico (cAMP) intracelular.

De acordo com De Souza e Line (2002) fibroblastos gengivais, ceratinócitos, macrófagos e leucócitos polimorfonucleares são capazes de expressarem MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8 e MMP-9.

Tanto a MMP-1 quanto a MMP-8 são colagenases, sendo que a MMP-8 é liberada por neutrófilos infiltrados enquanto a MMP-1 é expressada por fibroblastos, monócitos, macrófagos e células epiteliais (HAAKE et al. 2004a).

A MMP-1, ou colagenase 1, é uma enzima com 52 kDa na forma inativa e 41 kDa na forma ativa que é expressa in vivo em áreas de rápida remodelação tecidual fisiológica ou patológica. É expressa por fibroblastos, ceratinócitos, condrócitos, monócitos, macrófagos, hepatócitos e uma variedade de células tumorais. Os substratos já identificados desta enzima são os colágenos dos tipos I, II, III, VII, VIII e X, além de agrecana, serpins e α2-macroglobulina (NABESHIMA

et al., 2002; WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999). Lynch e Matrisian (2002) relatam

que além destes substratos a MMP-1 ainda degrada o colágeno tipo XI, gelatina, entacina, fibronectina, laminina, tenacina e vitronectina.

A MMP-1 cliva o colágeno tipo I, que é posteriormente degradado por outras enzimas (De SOUZA; LINE, 2002), pois após clivado, o colágeno I desnatura-se formando a gelatina que é degradada pela MMP-2 e MMP-9 (COTRIM et al. 2002; STAMENKOVIC, 2000).

A MMP-8 é uma colagenase que já teve a sua produção atribuída exclusivamente aos neutrófilos, no entanto sabe-se hoje que outras células têm a capacidade de produzi-la.

De acordo com Kubota, T. et al. (1996), a MMP-1 e a MMP-8 têm capacidade de degradar o colágeno tecidual pela clivagem da molécula no domínio da tripla hélice resistente à proteinase. A MMP-3, ou estromelisina-1 é um membro da família das metaloproteinases com a capacidade de degradar vários tipos de substratos como proteoglicanas, fibronectina, laminina e colágenos tipo IV e XI.

A MMP-2, ou gelatinase A, tem 75 kDa na sua forma inativa e 65 kDa na forma ativa e a MMP-9, ou gelatinase B, tem 92 kDa na forma inativa e 84 kDa quanto ativada (STAMENKOVIC, 2000; WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999).

A MMP-2 é expressa por uma variedade de células normais ou tumorais (WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999) e tem a capacidade de degradar gelatina, colágenos dos tipos IV, V e X na sua forma nativa, além de laminina, TGF-β, e colágenos dos tipos I, II e III desnaturados (KUBOTA, Y. et al., 2002; STAMENKOVIC, 2000).

A produção de MMP-2 ocorre na sua forma inativa, ou Pró-MMP-2 e é necessário para que ocorra a sua ativação a ação da MT1-MMP, com a participação de uma molécula de TIMP-2 como ponte, formando um complexo trimolecular (KUBOTA, Y. et al., 2002; NABESHIMA et al., 2002; PATTAMAPUN et

al. 2003).

Kubota, Y. et al. (2002) estudando o efeito da IL-1α na ativação de MMP-2 em fibroblastos isolados de ceratocistos, mostraram que esta citocina tem a capacidade de aumentar a produção de MT1-MMP nos fibroblastos, fazendo com que a ativação de MMP-2 seja aumentada. Foi sugerido então neste estudo que a IL-1α, através do aumento da produção de MT1-MMP com maior ativação de MMP-2 desempenha um papel crucial no crescimento intra-ósseo do ceratocisto.

De Souza et al. (2005) descrevem a MMP-9, ou gelatinase B como uma enzima expressa por leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, ceratinócitos e células endoteliais que atua nos colágenos do tipo IV, V e IX, em proteoglicanas e na elastina e tem sua expressão controlada por fatores como o TNF-α, a IL-1, o PDGF e o EGF.

Stamenkovic (2000), relata que a MMP-9 tem a capacidade de degradar gelatina, colágenos do tipo I, IV, V e X, além de TGF-β na forma latente.

Assim como a MMP-2, a MMP-9 também é produzida na sua forma inativa no entanto o seu mecanismo de ativação in vivo ainda não está completamente elucidado (KUBOTA, Y. et al., 2000; KUBOTA, Y. et al., 2002). Van Den Steen et

A MMP-9 atua na biologia óssea de maneira a participar na regulação do

turnover ósseo mas quando desregulada na sua síntese, secreção ou ativação

resulta em reabsorção óssea patológica (Van Den STEEN et al., 2002).

Kubota, Y. et al. (2000) estudaram o mecanismo de expansão dos cistos odontogênicos enfocando os efeitos da IL-1α na secreção e ativação de MMP-9. A análise zimográfica mostrou a presença da gelatinase de 92 kDa, a forma inativa da MMP-9 em fluidos coletados de cistos dentígeros e cistos radiculares e de 83 kDa, a MMP-9, ativa principalmente em ceratocistos. Fragmentos cultivados dos cistos coletados mostraram produção de MMP-9, além de MMP-2, quando incubados com IL-1α além de ativação de Pró-MMP-9 em MMP-9.

Chang et al. (2002) publicaram trabalho que teve o objetivo de determinar os efeitos das bactérias Porphyromonas endodontalis e Porphyromonas gingivalis na produção e secreção de metaloproteinases da matriz em culturas de células do ligamento periodontal. Células de polpas dentárias e de ligamento periodontal humanos foram obtidas de terceiros molares retidos e então cultivadas. A análise zimográfica mostrou que a enzima MMP-2 começou a aumentar a partir do quarto dia de cultura de células pulpares com P. endodontalis e P. gingivalis e continuou aumentando até o oitavo dia de forma dose-dependente. A MMP-9 também foi detectada na análise zimográfica mas em pequena quantidade. Na cultura de células do ligamento periodontal ocorreu efeito semelhante. Este estudo mostra que o P. endodontalis e o P. gingivalis, desempenham um importante papel na destruição tecidual e desintegração da matriz extracelular em lesões pulpares e periapicais através da indução das células residentes locais a produzirem MMPs.

Shin et al. (2002) realizaram um trabalho com o objetivo de verificar se as MMP-1, -2 e -3 estariam aumentadas nos tecidos pulpares inflamados e lesões periapicais e a sua distribuição nestes tecidos. Foram obtidas 12 polpas com diagnóstico clínico de inflamação aguda, 12 com inflamação crônica, 10 lesões periapicais e 10 polpas normais como controle. Foram feitas ELISA e análises imuno-histoquímica com anticorpos anti-MMP-1, anti-MMP-2 e anti-MMP3. Os

resultados mostraram que nas polpas com pulpite aguda, a MMP-1 e a MMP-3 se localizaram predominantemente nos neutrófilos e macrófagos, assim como na matriz extracelular. As células inflamatórias típicas da inflamação crônica marcaram fracamente. A MMP-2 expressou fracamente nas células inflamatórias e fibroblastos de todos os grupos experimentais. A MMP-1, -2 e -3 marcaram em plasmócitos, linfócitos e macrófagos. Estes resultados sugeriram que a MMP-1 e a MMP-3 podem ser produzidas por neutrófilos, macrófagos, plasmócitos e linfócitos. A produção de MMPs foi maior nas pulpites agudas que nos grupos controle o que pode significar que elas participam na progressão da inflamação pulpar.

Franchi et al. (2002) avaliaram, em carcinomas de cabeça e pescoço, a expressão imuno-histoquímica da MMP-1, MMP-2 e MMP-9 correlacionando estes dados com o estado do gene p53, a atividade da enzima óxido nítrico sintetase e com a angiogênese. Fragmentos do front de invasão de tumores foram obtidos de 43 pacientes e usados para análise imuno-histoquímica e molecular. Os resultados mostraram que a expressão das MMPs foi variável e envolveu além das células neoplásicas as células endoteliais e inflamatórias. A expressão da MMP-1 foi evidente em 97,6% dos espécimes, com 74,5% demonstrando distribuição moderada ou difusa nas células neoplásicas. A expressão da MMP-2 foi evidente em 79% com marcação considerada moderada ou difusa em 39,5% e da MMP-9 foi evidente em 65% com 39,5% mostrando marcação moderada ou difusa. Tumores com superexpressão de MMP-9 foram associados a maior freqüência de metástases em linfonodos embora não tenha sido estatisticamente significante. A densidade vascular correlacionou-se positivamente com a presença de metástases em linfonodos, com tumores primários de maior tamanho e com superexpressão de MMP-9. Tumores com mutação de p53 apresentaram maiores densidades vasculares e maior quantidade de superexpressão para MMP-9. Os autores chamam a atenção para o fato da expressão de MMPs ter sido encontrada não só nas células tumorais, como também nas células estromais e nas células inflamatórias próximas ao tumor e consideram estas células fontes importantes destas enzimas para os tecidos tumorais concluindo então que existe uma forte

correlação entre a expressão de MMP-9, a mutação do gene p53 e a angiogênese.

O papel das MMPs na angiogênese foi discutido por Haas e Madri (1999). A angiogênese é dependente da ativação de células endoteliais dando início a proliferação celular e proteólise das membranas basais permitindo a invasão e migração das células endoteliais através da matriz extracelular para formar novos vasos. A degradação da matriz extracelular ocorre pela ação de uma série de enzimas, incluindo as MMPs. Células endoteliais já demonstraram ser produtoras de MMP-1, MMP-13, MMP-3, MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP provavelmente tendo grande importância na angiogênese.

Segundo Rundhaug (2003) as MMPs são importantes no processo de angiogênese já que o primeiro passo da angiogênese é a degradação da membrana basal de um vaso pré-existente. Mas as MMPs não contribuem com a angiogênese somente pela degradação da membrana basal e de outros componentes da matriz extracelular. Atuam também na liberação de fatores pró- angiogênicos ligados à matriz extracelular como bFGF, VEGF e TGFβ. Componentes da matriz extracelular degradados pelas MMPs tormam acessíveis sítios de ligação para determinadas integrinas como a αvβ3, que podem iniciar uma sinalização que contribui para a sobrevivência e proliferação endotelial.

Kumamoto et al. (2003) avaliaram a expressão imunohistoquímica das metaloproteinases MMP-1, -2 e -9 e dos inibidores TIMP-1 e -2 em ameloblastomas comparando-os com germes dentários no intuito de verificar o seu papel no processo de invasividade do tumor já que as ação das MMPs e TIMPs poderiam estar envolvidos no processo de degradação da membrana basal dos ameloblastomas. Espécimes removidos de 22 pacientes com ameloblastomas foram analisados imuno-histoquimicamente. Neste estudo, a reatividade das MMP-2 e -9, associadas à degradação de membrana basal, foi encontrada preferencialmente nos componentes mesenquimais que nos epiteliais e a sua expressão pode estar associada à regulação epitélio-mesenquimal em tecidos

odontogênicos tanto normais quanto neoplásicos atuando no processo de invasividade dos ameloblastomas e em processos desenvolvimentais nos germes dentários.

Ao exercerem sua atividade na degradação da matriz extracelular, as MMPs liberam fragmentos escondidos e neo-epítopos das macromoléculas. As MMP-2 e -9, por exemplo, ao degradarem a membrana basal expõem um epítopo escondido na molécula do colágeno IV capaz de promover angiogênese. A degradação da laminina-5, outro componente da membrana basal, pela MT1-MMP libera um fragmento escondido da sua cadeia γ2 que é capaz de induzir migração epitelial. Também já foi demonstrado que a MMP-9 e, em menor grau a MMP-2, ao degradarem a matriz extracelular aumentam a biodisponibilidade da VEGF, um importante fator de crescimento no processo de angiogênese, e do fator de crescimento TGF-β (MOTT; WERB, 2004).