Challenges for conflict management

Um estudo feito em animais estimou que a meia vida do plasmídeo após injeção intravenosa era de apenas 10 minutos [38], devido à existência de várias endonucleases presentes no fluido extracelular [39]. No entanto, e ainda que o plasmídeo não se degradasse, também é conhecido o facto de os ácidos nucleicos, por si só não serem eficientes a atravessar a membrana celular e nuclear para promover a entrega do gene e conduzir à expressão da proteína [22], e mesmo o citoplasma oferece resistência ao plasmídeo livre, já que este espaço também está repleto de endonucleases [39]. Considerando que ambas as entregas do material genético pelas vias in vitro e in vivo são comprometidas pela existência de endonucleases, algumas medidas precisaram ser adotadas para contornar esta problemática no campo da terapia génica. Trata- se então do uso de métodos e sistemas de entrega dos ácidos nucleicos, que podem ser realizados com recurso a métodos físicos, partículas inorgânicas ou métodos químicos [40], conforme mostra a tabela 2.

Tabela 2: Métodos e Sistemas de entrega utilizados Categoria Método/Sistema de entrega produto terapeutico Metodologia/material Referências Mét od os f ís ico s

Microinjeção Injeção na célula [40]

Eletroporação Campo elétrico permeabiliza a membrana plasmática

[41]

Biobalística (gene gun)

Bombardeamento de partícula a alta

velocidade [40]

Entrega hidrodinâmica Pressão hidrodinâmica por injeção rápida [42] Sonoporação Ultrasson, permeabiliza a membrana

plasmática

[43,44]

Magnofecção

Material genético em partículas magnéticas, inoculados na célula alvo por campo

magnético [40] Mét od os Q uí m ico s Polímeros Quitosano [45] Dendrímeros [46] Polimetacrilatos [47] Lipídeos Cationicos Lipossomas Catiónicos [45] Emulsões Catiónicos Peptídeos Zein [48] Gelatin [49,50] Albumina+chitosan [51] Fibroina da seda [52] Na nopa rti cul as Inor ga ni ca s

Ouro Superfície flexível, auxilia funcionalização DNA

[53] Grafeno

Protege o DNA contra clivagem e permite liberação gradual do DNA funcionalizado

[53] Quantum Dots Eficiência na ligação com pDNA [54] Oxido de ferro Eficiente na transformação fibroblastos

embrionários de rato

[55] Fosfato de cálcio Biocompatibilidade, biodegradável [56]

Os métodos físicos, têm como princípio a desestabilização da membrana plasmática alterando seu estado de permeabilização para facilitar a entrega do produto terapêutico no interior celular [40]. Os sistemas baseados em nanopartículas inorgânicas, podem oferecer algumas vantagens pois não sofrem ataques microbianos, podem ser preparados facilmente, apresentam uma baixa toxicidade além de se manterem estáveis por mais tempo [57, 53]. Já as abordagens de entrega baseadas nos métodos químicos, oferecem grandes vantagens em relação aos métodos anteriormente citados pois apresentam custos relativamente reduzidos, uma biodegradabilidade desejada o que evita o acumular da partícula no interior celular, consequentemente evitando toxicidade desnecessária [58]. Por esses motivos, são os mais usados, mostrando-se eficientes na entrega de uma ampla diversidade de produtos terapêuticos, como agentes antimicrobianos [59], anticancerígenos [60], hormonas [61], proteínas [62], vacinas [63] e ácidos nucleicos [64, 65]. Relativamente a entrega do vetor plasmídico por métodos químicos, importa realçar o uso de lipossomas catiónicos, que apresentam algumas características importantes para diversas estratégias terapêuticas. Os lipossomas catiónicos são formados por uma bicamada lipídica, com um ou mais átomos de azoto carregado positivamente. A carga positiva presente na superfície do lipossomo é a responsável pela interação com os ácidos nucleicos, facilitando também a interação e passagem através da membrana celular, que é maioritariamente carregada negativamente [66]. Após a entrada no citoplasma, o transgene precisa atingir o núcleo para poder ser transcrito e expresso, sendo este processo facilitado nas células em divisão, uma vez que o DNA transferido tem uma maior probabilidade de ser incluído no envelope nuclear, após a remontagem no final do ciclo mitótico [66]. Comercialmente existem diversos produtos baseados neste tipo de sistema de entrega, nomeadamente a lipofectamina, que não apresenta uma eficiência de transfeção diminuída em células pós mitóticas [67], e é amplamente reconhecido pela segurança na entrega do material genético às células. Os complexos formados, lipofectamina + pDNA, são considerados estáveis e o transporte através da membrana plasmática ocorre por endocitose [68]. Um estudo realizado em 2016 sugeriu também que o transporte intracelular dos complexos lipofectamina+DNA é maioritariamente realizado por movimentos brownianos e por esse motivo, os complexos acabam por evitar a degradação lisossomal, resultando numa melhor taxa de entrega do DNA ao núcleo, onde o gene será expresso. Alternativamente aos movimentos aleatórios brownianos, alguns sistemas de entrega utilizam preferencialmente o transporte ativo, feito ao longo dos microtúbulos, o que conduz a alguma degradação do DNA e subsequentemente uma menor taxa de entrega do material genético ao núcleo [69].

A figura 4 representa o transporte celular do complexo formado entre pDNA e lipofectamina, onde o complexo é internalizado, através da membrana, via endocitose.

Figura 4: Representação esquemática do transporte celular do complexo lipofectamina+pDNA. Adaptado [39]

A lipofectamina, usada nesse trabalho, representa um veículo de entrega químico comercial, sendo uma alternativa ao uso dos vetores virais. Relativamente aos sistemas de entrega, o campo da terapia génica hoje conta com as metodologias acima mencionadas e muitas vezes com o uso combinado dessas estratégias, como por exemplo, em abordagens onde partículas inorgânicas são cobertas com DNA terapêutico para em seguida serem inseridos nas células por meio de biobalística, por exemplo. Nesse caso métodos químicos e físicos são associados para um melhor resultado da estratégia terapêutica [70]. Desde a primeira abordagem, no âmbito da terapia génica, ficou evidente também que os avanços dos sistemas de entrega e vetores terapeuticos são fundamentais para garantir o sucesso do tratamento, considerando também a complexidade de muitas doenças a serem abordadas, como é o caso do cancro que representa hoje 66% das pesquisas terapêuticas (http://www.abedia.com/wiley/index.html)