Analysis of the first power sharing agreement

O aminoácido arginina previamente imobilizado ao suporte macroporoso foi utilizado como ligando nesta estratégia cromatográfica (figura 18).

A

B

C

Figura 18: Estrutura química da arginina-macroporosa: A) Suporte macroporoso; B) Braço espaçador; C) Estrutura química arginina

O tampão Tris-HCl 10 mM pH 8,0 e o sal cloreto de sódio (NaCl 2 M), diluído em Tris-HCl 10 mM pH 8,0, foram usados como fases móveis para promover a ligação e eluição das biomoléculas que interagem ou não com a matriz. Após o equilíbrio da matriz de arginina a uma concentração de 124 mM de NaCl, foi injetado no cromatógrafo um volume de 100 µL de lisado clarificado, previamente dessalinizado em colunas PD-10, a um caudal de 1 mL/min. Ao passar mela matriz, as moléculas com pouca afinidade, acabaram por eluír nessa primeira etapa. Posteriormente, um aumento da concentração de sal para 500 mM, promoveu a eluição da molécula alvo (sc pDNA). Finalmente, o aumento para a concentração 2 M de NaCl foi fundamental para a remoção de espécies moleculares mais fortemente aderidas a matriz. O cromatograma e o gel de agarose podem ser vistos na figura 19.

Figura 19: Pefil cromatográfico e análise em gel de agarose de amostras purificadas do lisado clarificado, através da matriz arginina-macroporosa. A) Cromatograma de purificação da amostra de lisado, mostrando o gradiente crescente de NaCl de 6,2%, 25% e 100%, com eluição da moléculas mais fortemente ligadas a matriz arginina-macroporosa (picos 1, 2 e 3). b) gel de eletroforese 0,8% mostrando o lisado clarificado (L); Banda referente ao RNA (1); Banda referente ao pDNA superenrolado (2); Banda referente a eventuais espécies ainda ligadas a matriz cromatográfica (não visíveis no gel) (3)

Diferente do comportamento de interação entre o DNA e os ligandos de histidina, onde as interações eram favorecidas por uma força iónica elevada, neste caso as biomoléculas interagem com a arginina macroporosa a uma baixa força iónica, o que justifica o fato de que o (NH4)2SO4 usado no procedimento de lise, precisar ser removido antes de se injetar a amostra

na coluna cromatográfica. Essa dessalinização feita através da coluna PD-10 foi fundamental para que as interações DNA-ligando pudessem ocorrer. A interação do DNA com os ligandos de arginina são maioritariamente eletrostáticas e exploram a natureza polianiónica do DNA contra as cargas positivas do grupo guanidino da arginina, que se encontra protonado a pH 8,0. Ao contrário do observado no comportamento de ligação à histidina, onde as espécies eluíram com

oc sc RNA B) _{L 1 2 3} A) 1 2 3 % Na Cl A bs rela ti va 2 60 nm

devido ao aumento da força iónica. A carga positiva da arginina, atrai as cargas negativas dos grupos fosfatos da cadeia dos ácidos nucleicos. Com o aumento da concentração de NaCl, aumenta-se também a competição de iões positivos e negativos no interior da coluna que acabam por promover primeiro a eluição de espécies com menor densidade de carga, como é o caso do RNA,que possui apenas uma cadeia simples, pico 1, fig 19 A. Posteriormente, aumentando ainda mais a concentração do sal, é possível eluir moléculas de dupla cadeia, como no caso o pDNA (pico 2, fig. 19 A), assim a ordem de eluição é essencialmente dependente da carga liquida negativa da molécula e da densidade de carga por unidade de superfície [109]. O terceiro pico, pode ser devido a eluição de proteínas que não são detetadas em gel de eletroforese, ou mesmo pequenas quantidades de pDNA circular aberto juntamente com algum RNA. Considerando que a fração de RNA inclui moléculas de tamanho e estrutura muito heterogéneo, podemos considerar que RNAs de tamanhos reduzidos que entraram nos poros do suporte, tenham eluido nessa etapa. De facto, as dimensões dos poros podem influenciar também os comportamentos de ligação, considerando o tamanho das moléculas do lisado. O perfil cromatográfico aqui observado, difere por exemplo, do observado no perfil cromatográfico da purificação do plasmideo pVAX1-LacZ de 6.05-kbp, a partir de lisado clarificado, utilizando a matriz arginina-sepharose. Os autores mostraram uma ordem de eluição onde a isoforma circular aberta elui primeiro, seguido do RNA a uma concentração de 240mM de NaCl e a isoforma superenrolada sai no terceiro pico, a uma concentração de 300 mM [111]. Em outro trabalho, a diferença no perfil cromatográfico foi ainda mais evidente, onde Soares e colaboradores (2013) trabalhando na purificação da isoforma superenrolada do plasmideo HPV-16 E6/E7, a partir do lisado clarificado, utilizando arginina-monolito, mostraram que nos dois primeiros picos, foram eluídas moléculas de RNA a uma concentração de 600 e 740 mM de NaCl respetivamente e a eluição da isoforma superenrolada do plasmideo se deu no terceiro pico, a 795 mM de NaCl e um quarto passo onde os autores usaram 1 M de NaCl para eluir outras espécies de RNA [146] que poderiam estar fortemente aderidas a matriz, por exibirem uma estrutura secundária [147]. As diferenças no padrão de eluição das moléculas, podem ser devidas não somente aos diferentes plasmídeos, mas parecem ser mais associadas ao tipo de suporte onde a arginina está imobilizada. Se considerarmos o factor tempo dos ensaios, o monolito representa uma vantagem pois a purificação em arginina-monolito foi feita em 25 minutos, aproximadamente, enquanto que arginina-macroporosa o tempo de ensaio se deu em 55 minutos e arginina-sepharose em aproximadamente 120 minutos.

A pureza e recuperação do sc pDNA foram avaliadas através da utilização de um método cromatográfico analítico. O cromatograma gerado pela análise quantitativa da amostra de sc pDNA, está representado na figura 20 A e B, que mostram a análise do lisado clarificado (fig. 20 A) e a análise da amostra purificada da isoforma sc (fig. 20 B). A partir dessa análise foi possível definir o grau de pureza da isoforma sc pDNA e a percentagem de recuperação da amostra, em relação à amostra do lisado inicial. Esses dados são apresentados na tabela 9, bem

como os valores analisados das impurezas, com os respetivos valores limites, estabelecidos pelas agências reguladoras.

Tabela 9: Quantificação das impurezas associadas ao sc pDNA purificado por arginina macroporosa, comparados aos limites estabelecidos pelas agências reguladoras

Conteúdo analisado Valores encontrados Valores limites

Proteinas (μg/mL) Não detectada Não detectável

RNA Não detectado Não detectável

Endotoxinas (EU/μg pDNA) 0,014 < 0,1 EU/ μg pDNA

gDNA (μg/ μg pDNA) 0,0063 < 0,01 μg/ μg pDNA

Pureza 92 % >90%

Recuperação 43 % ----

Apesar do grau de pureza do plasmídeo superenrolado, encontrado neste trabalho ser de 92%, o que está acima dos limites estabelecidos pela FDA, este valor é inferior ao grau de pureza da mesma isoforma encontrada por Sousa e colaboradores (2008), para o plasmideo (pVAX1-LacZ), onde os autores reportaram um grau de pureza de 100% com um rendimento de recuperação da isoforma sc pDNA de 79% [111]. Soares e colaboradores (2013), também reportaram maior grau de pureza para a sc pDNA recuperado pela arginina-monolito, >99% e um rendimento de recuperação dessa isoforma de aproximadamente 39% [146], pouco abaixo do valor encontrado para p53-pDNA (43 %). Analisando as quantificações das impurezas, indicadas na tabela 9, fica evidente a eficiência da arginina-macroporosa na purificação do pDNA, uma vez que os valores obedecem a todos os requisitos recomendados pela FDA. Esses valores também estão em

Figura 20: Cromatograma referente a análise quantitativa: (A) Quantificação do pDNA presente no lisado clarificado; (B) Quantificação do sc pDNA purificado através da coluna arginina-macroporosa.

A) _Impurezas sc _pDNA B) sc _pDNA

% Na Cl % Na Cl A bs rela ti va 2 60 nm A bs rela ti va 2 60 nm

4 2 4