O sucesso da terapia génica está dependente da obtenção de elevadas concentrações do plasmídeo terapêutico, já que frequentemente a expressão do gene exógeno nas células transfetadas é transiente. Considerando esta necessidade, é essencial realizar uma etapa de produção que permita a obtenção de múltiplas cópias do plasmídeo alvo, podendo igualmente ser desenvolvido um processo mais rápido e economicamente mais vantajoso. A biossíntese do plasmídeo ocorre no interior de células hospedeiras, geralmente em Escherichia coli, que quando colocadas em meio de cultura adequado, se multiplicam, replicando também o plasmídeo no citoplasma, que posteriormente é extraído da célula. Neste trabalho, e para a produção do pDNA, além da utilização de E. coli como bactéria hospedeira, um estudo preliminar em outra espécie bacteriana, nomeadamente Rhodovulum sulfidophilum, também foi executado conforme detalhado a seguir.
4.1.1 Rhodovulum sulfidophilum-Estudos preliminares
A característica intríseca desta bactéria em secretar ácidos nucleicos para o meio extracelular motivou a realização de várias tentativas para promover a sua transformação com o p53-pDNA, uma vez que isso poderia possibilitar a exclusão de uma etapa de lise alcalina, reduzindo tempo de trabalho, custos, e evitando o uso dos agentes alcalinos na extração, o que facilitaria a recuperação da molécula de uma forma mais intacta e estável para posterior aplicação. Na tentativa de obter clones recombinantes de R. sulfidophilum, foi inicialmente avaliada a possibilidade de usar concentrações elevadas de ampicilina, já que uma análise in silico mostrou que R. sulfidophilum possui um gene que codifica para a enzima β-Lactamase (NHU_03651), que degrada antibióticos da classe dos β-lactâmicos como ampicilina, conferindo resistência à célula hospedeira. Também em paralelo foi estudada a utilização dos antibióticos canamicina e neomicina, na tentativa de selecionar um antibiótico para o qual o hospedeiro não apresentasse resistência natural. Esta seleção pareceu razoável, uma vez que o pDNA-p53 também confere resistência a estes antibióticos. Diferentemente da ampicilina, a canamicina e neomicina pertencem à classe dos antibióticos aminoglicosídeos, e nesse caso, não seriam degradados pela β-Lactamase. Assim, após o procedimento de transformação da R. sulfidophilum DSM 1374, as células cresceram em meio sólido, mostrando-se resistentes aos três antibióticos testados (amp.; neo.; can.), não sendo sensíveis a nenhuma das concentrações às quais foram expostas. Este resultado seria esperado, já que as células poderiam ter sido modificadas com o pDNA-p53. No entanto, verificou-se que o crescimento também ocorreu para as bactérias não transformadas (grupo controlo), e neste caso a resistência não seria expectável, pelo facto de as células não terem incorporado o pDNA, a não ser que as próprias células apresentassem uma resistência natural aos antibióticos em estudo. Após esse crescimento, as células ainda foram transferidas para meio líquido também contendo os antibióticos (amp.; neo.; can.) para realização de mini prep, na tentativa de extrair e identificar a presença do plasmídeo de interesse. A figura 12
Figura 12: A) Placa com colónias de Rhodovulum sulfidophilum após 5 dias de incubação em meio sólido com ampicilina (250 µg/mL). B) Crescimento em meio líquido contendo ampicilina (250 µg/mL), após a recuperação da massa celular por centrifugação.
Após o crescimento em meio líquido foi recuperado o sobrenadante e as células, para avaliar a possível acumulação do plasmídeo intra ou extracelularmente, considerando as características da bactéria. Assim, as células foram submetidas ao procedimento de lise alcalina, e o sobrenadante foi sujeito a precipitação. Após a precipitação do meio extracelular, foram visualizadas algumas bandas na eletroforese em gel de agarose 0,8% (Figura 13A), que não foram identificados imediatamente. Para tentar identificar as biomoléculas presentes na electroforese, foram realizados vários testes, já que a banda poderia corresponder a alguma topologia do plasmideo. Assim, foi realizado um ensaio decisivo com uma enzima de restrição, a APAI, que cliva o plasmideo p53 em regiões específicas (5´…GGGCCˇC…3´) (figura 13 B).
Após a clivagem, o plasmideo deveria ser linearizado, mas o que foi observado foi a ausência de qualquer banda, o que poderia ser devido à digestão ou degradação completa da espécie em causa. Este resultado também demostrou que a banda não correspondia à molécula alvo, sendo que os ensaios de digestão enzimática foram então decisivos para demonstrar que o plasmídeo não foi replicado na bactéria como seria desejável. Para compreender este fenómeno, foi realizada alguma pesquisa bibliográfica que revelou que alguns membros das alphaproteobactérias, incluindo R. sulfidophilum, são capazes de produzir partículas que têm função na transferência horizontal de genes, nomeadamente Gene transfer agents (GTAs) [136, 137], sendo uma possível explicação para a espécie encontrada no meio de cultura precipitado. A literatura também reporta que esta bactéria possui uma composição genética muito complexa que se constitui, além do cromossoma, por outros dois plasmídeos residentes [138] que podem eliminar por competição, um terceiro plasmídeo exógeno. No que se refere à instabilidade plasmidial, verifica-se que a carga metabólica provocada na célula hospedeira, pode ocorrer tanto pela replicação como pela expressão de genes do plasmídeo no interior da célula, e em ambos os casos podem conduzir à eliminação da molécula pela célula [139]. Relativamente à resistência aos antibióticos que foi verificada, concluiu-se que não estava relacionada com a transformação com o plasmídeo de interesse, já que as células não transformadas também adquiriram resistência. Os três antibióticos usados, poderão ter sido de alguma forma inativados pela bactéria e independente de genes que confiram a resistência, a literatura tem reportado outros mecanismos de defesa aos aminoglicosídeos, garantindo a resistência das células. Dentre
Figura 13: Gel de eletroforese 0,8% de agarose, mostrando possíveis bandas de pDNA extraídas de R.
sulfidophilum. A) extração do pDNA, por miniprep e do meio extracelular, precipitado com isopropanol
e pDNA-p53 extraído de E. coli, como referência. B) clivagem por enzima APAI da banda precipitada do meio liquido de R. sulfidophilum
eDNA Miniprep eDNA pDNA-p53
esses mecanismos de resistência, bombas de efluxo, bem como outros mecanismos que modificam a droga inativando-a, são os mais frequentes [140]. Também, a capacidade da R. sulfidophilum em formar biofilmes, explica o crescimento das células em culturas com antibiótico [141].
Devido as complexas características dessa bactéria citadas acima e as dificuldades em transformá-la com o plasmídeo de interesse, foi tomada a decisão de avançar com este projeto utilizando uma bactéria também prevista para uso nesse trabalho, a Escherichia coli.
4.1.2 Escherichia coli
A utilização de uma bactéria de simples e rápido crescimento e com necessidades nutricionais e metabolismo bem conhecidos, como a Escherichia coli, representa uma ferramenta muito útil em processos biotecnológicos. Assim sendo, estas células transformadas com o plasmídeo de interesse foram usadas para a biossíntese do plasmídeo, através de fermentação. As células cresceram em meio de cultura adequado até atingir a densidade ótica (a 600 nm) necessária, aproximadamente 9, garantindo assim quantidades adequadas de plasmídeos que foram extraídos por lise alcalina modificada, figura 14.
Figura 14: Esquema que representa o processo desde a biossintese, recuperação celular, lise alcalina e o gel de agarose 0,8%, mostrando o pDNA extraído
pDNA- p53 RNA Meio líquido TB Massa celular Gel eletroforese 0,8% Lise alcalina
As etapas vistas até aqui marcam então o ciclo upstream e como detalhado a seguir, inicia-se o ciclo downstream, representados pelas etapas de purificação cromatográfica.