The Carebear

Tomando como fundamento a definição descrita por Slager et al em 2009 (SLAGER; KAY, 2009), os dados apresentados no heredograma da Figura 13 e os achados laboratoriais descritos na Tabela 6, podemos concluir que o diagnóstico de LLC foi devidamente confirmado nos indivíduos afetados e que este constitui um caso típico de LLC familiar com pelo menos três membros portadores da doença.

Ainda que o risco de LBM ou LLC assintomática entre os parentes de primeiro grau de pacientes com diagnóstico confirmado de LLC seja considerado elevado (até 8,5 vezes maior que o da população geral), a investigação ativa por meio de hematimetria e citometria de fluxo neste estudo não foi capaz de detectar nenhum caso novo na família em questão. Cabe ressaltar que esse modelo de investigação somente pode ser aplicado em cinco dos 23 membros considerados como não-afetados (21,7%), não sendo possível eliminar de modo convincente a probabilidade da existência de proliferação clonal linfóide entre os membros não testados.

Ao tempo da primeira avaliação clínico-laboratorial os três indivíduos afetados não apresentavam qualquer repercussão sistêmica da doença, sendo o diagnóstico estabelecido com base apenas nas alterações presentes no hemograma (linfocitose > 5000/mm3) e na caracterização imunofenotípica das células B maduras clonais (que apresentavam o perfil de expressão típico da LLC, com positividade para CD5, CD19, CD20, CD23 e restrição de cadeia leve de imunoglobulinas). Ainda ao tempo do diagnóstico, todos os afetados apresentavam estadiamento clínico de Raí e Binet de “baixo risco” (0/A – Tabela 10), com SG estimada superior a 12 anos. Contudo, após apenas 36 meses de acompanhamento é reconhecida no indivíduo C8 a presença de adenomegalias cervicais e axilares (Tabela 8), fato que eleva sua avaliação de risco para “intermediário” (Raí/Binet I/B – Tabelas 2 e 3), reduzindo a expectativa de SG para cerca de sete anos e demonstrando que este sistema foi incapaz de prever o prognóstico de maneira adequada para este paciente. Pelo contrário, nos indivíduos B2 e B6 o comportamento da LLC ao longo do tempo manteve-se coerente com o previsto pelo estadiamento clínico, indicando que outros fatores devem estar envolvidos com os mecanismos

direcionadores do comportamento da doença e com a determinação do prognóstico, e que possivelmente os modelos de Raí e Binet devem ser reestudados no contexto da LLC familiar.

Outrossim, os exames laboratoriais de interesse prognóstico apresentados na Tabela 10 pouco ajudam a explicar a diferença de evolução da LLC observada em C8, claramente acometido por uma patologia de comportamento mais agressivo (TDL = 12 meses) do que a dos indivíduos B2 e B6 (TDL > 18 e 96 meses, respectivamente). A quantificação de beta2microlgobulina sérica e o nível de expressão de ZAP-70 não diferencia C8 de seus parentes afetados. Conquanto a expressão de CD38 pelas células tumorais detectada em C8 tenha sido relacionada com o status não-mutado de

IGVH e, conseqüentemente, a um prognóstico adverso na LLC por alguns

autores (DAMLE et al., 1999; HALLEK, 2013; SHANAFELT et al., 2006), estudos mais recentes esclarecem que o real significado deste marcador ainda não está completamente elucidado, especialmente devido as diferenças no nível de expressão observado em ensaios clínicos de seguimento longitudinal (MATRAI, 2005; NIPP et al., 2013; THOMPSON; TAM, 2013), e por conseguinte ainda não sendo universalmente aceito.

Como vimos, citogenética clássica e FISH são reconhecidas na literatura como as técnicas padrão para a detecção de alterações cromossômicas na LLC, não obstante esses métodos também apresentem importantes limitações. A imprescindível presença de células em metáfase, o tempo consumido com a cultura celular (24 à 72 horas) e a baixa resolutividade estão entre os principais obstáculos enfrentados pelo bandeamento cromossômico (BRADY; VERMEESCH, 2012). Na Tabela 9 encontramos um claro exemplo da baixa resolutividade da citogenética convencional, uma vez que essa metodologia não foi capaz de identificar a presença da del(13q14) no indivíduo B6 (posteriormente comprovada por CMA – Figura 18), o que pode ser justificado pela reduzida freqüência com que as mitoses são observadas entre as células clonais da LLC e pelo fato de que esta mutação compreende apenas 965 kb, tamanho inferior ao limite de detecção descrito para esse método (≥ 3 Mb) (BISHOP, 2010).

As vantagens da técnica de FISH sobre a citogenética convencional são bem conhecidas: maior resolutividade, menor tempo gasto no processamento e

análise do material (4 à 24 horas) e a possibilidade de detecção de alterações cromossômicas (deleções, translocações, inversões e amplificações gênicas) mesmo em células que não estão em divisão (ampliando o leque de investigação inclusive para amostras de tecido preservadas) (BISHOP, 2010). Todavia, a aplicação de FISH está restrita às alterações cromossômicas previamente conhecidas, dado ser imprescindível o desenvolvimento de sondas de hibridização específicas para as regiões que se pretende estudar, limitando consideravelmente sua utilidade como teste de triagem (BISHOP, 2010; SPEICHER; CARTER, 2005). Além disso, com algumas exceções, outra desvantagem dos ensaios de FISH é a incapacidade de detectar dissomia uniparental e perda de heterozigose (BISHOP, 2010). Especificamente sobre este último aspecto, as pesquisas de alterações citogenéticas realizadas nas células mononucleares do indivíduo C8 servem como uma ilustração. Na Tabela 9 podemos apreciar que a FISH identificou apenas a presença de del(13q14), ao passo que a CMA foi também capaz de demonstrar que essa deleção ocorreu em homozigose (deleção bialélica), com conseqüente perda de heterozigose do cromossoma envolvido (Figura 19).

A técnica de CMA, também referida como citogenética molecular ou submicroscópica (BRADY; VERMEESCH, 2012; MILLER et al., 2010), é reconhecida por alguns autores como um dos avanços tecnológicos mais significativos na nova era da genética molecular (SCHAAF; WISZNIEWSKA; BEAUDET, 2011; SHAO et al., 2010). Resumidamente, a CMA consiste em medir e comparar a intensidade de sinal fluorescente emitida após a hibridização de fragmentos do DNA teste contra o DNA de referência, permitindo assim a identificação de CNVs (perdas e ganhos) em centenas de diferentes loci simultaneamente, cuja capacidade de resolução está tão somente limitada pelo espaçamento e a pela densidade das sondas utilizadas (BISHOP, 2010; BRADY; VERMEESCH, 2012; SCHAAF; WISZNIEWSKA; BEAUDET, 2011; SHAO et al., 2010). A disponibilidade de oligonucleotídios sintéticos de segmento curto (25 a 70 bases) possibilitou a ampliação da cobertura do genoma das atuais plataformas de CMA e melhorou ainda mais a resolutividade do método. Algumas empresas oferecem kits compostos por mais de 4 milhões de sondas capazes de distinguir CNVs menores que 1 Mb (BRADY; VERMEESCH, 2012; SCHAAF; WISZNIEWSKA; BEAUDET, 2011;

VAN DER VEKEN; BUIJS, 2011) e de revelar a existência de dissomia uniparental e perda de heterozigose, a exemplo da del(13q14) diferencialmente expressa nos indivíduos B6 e C8 (Tabela 13, Figuras 18 e 19). Além das vantagens já mencionadas, vale ressaltar que a CMA não requer o conhecimento prévio dos desequilíbrios presentes no genoma a ser estudado, constituindo-se assim como uma excelente ferramenta para a investigação de mutações cromossômicas em diversas situações clínicas, particularmente no câncer (BISHOP, 2010; SPEICHER; CARTER, 2005).

A principal limitação da CMA é a incapacidade em detectar anormalidades cromossômicas que não envolvam mudanças no número de cópias, tal como ocorre nas inversões e translocações balanceadas (BISHOP, 2010; BRADY; VERMEESCH, 2012; SPEICHER; CARTER, 2005). Porém, os estudos de Gregori et al em 2007 e Schluth-Bolard et al em 2009 constataram que, quando estudadas por meio de CMA, pelo menos 40% das translocações aparentemente equilibradas nos exames de cariótipo na verdade possuem ganhos ou perdas como resultado da perturbação dos genes nos pontos de quebra ou da afecção de um cromossomo inicialmente não envolvido no processo (BRADY; VERMEESCH, 2012; DE GREGORI et al., 2007; SCHLUTH-BOLARD et al., 2009). Especificamente no âmbito da LLC, como pode ser verificado no Item 1.2.5 da Introdução (Alterações citogenéticas), Haferlach et al e Wang et al em 2007, assim como Kiefer et al em 2012, relataram que essa onco-hematopatia comporta-se de modo singular, sendo excepcional o relato de translocações entre as aberrações cromossômicas já descritas (HAFERLACH et al., 2007; KIEFER et al., 2012; SCHWAENEN et al., 2004; WANG, S. S. et al., 2007).

Ainda no contexto da LLC, ademais de todos os achados identificáveis por citogenética convencional e FISH, a CMA demonstrou ser capaz de assinalar mutações cromossômicas adicionais em até 76% dos pacientes estudados (SCHULTZ et al., 2011; SCHWAENEN et al., 2004; SHAO et al., 2010), a exemplo do exposto nas Tabelas 13 e 14, aonde pode ser visto que, além da +(12) e das del(13q14) presentes nos indivíduos B2, B6 e C8 (respectivamente), foram também reveladas adicionalmente 16 alterações cromossômicas em B2 (11 regiões de perda e 5 de ganho), 11 alterações cromossômicas em B6 (7 regiões de perda e 4 de ganho) e 12 alterações

cromossômicas em C8 (6 regiões de perda e 6 de ganho). Como antecipado por Shao et al em 2010, de uma ou outra forma esse conjunto de achados complementares (CNVs e perda de heterozigose) deve contribuir para a evolução proporcionalmente desfavorável da LLC observada no indivíduo C8 (SCHULTZ et al., 2011; SCHWAENEN et al., 2004; SHAO et al., 2010).

Com base em todas essas considerações, é lícito inferir que a CMA pode ser considerada como o método de escolha para investigação das alterações citogenéticas na LLC, pelo menos em projetos de pesquisa, tendo em vista sua peculiar habilidade em cobrir de maneira ampla o genoma a ser estudado, em busca das mutações que podem estar associadas aos mecanismos fisiopatogênicos, de herança e de progressão da doença (SHAO et al., 2010).

No que diz respeito a interpretação dos achados de mutações citogenéticas nos estudos com CMA, de modo geral considera-se que as duplicações são geralmente melhor toleradas do que as deleções, assim como reputasse maior significância as anormalidades de maior tamanho do que às menores, atribuindo-se sempre maior valor àquelas alterações que envolvem regiões ricas em genes. Do mesmo modo, a CNV é considerada possivelmente patogênica se corresponder a uma deleção (especialmente quando em homozigose) ou se representar uma amplificação com mais do que um ganho de cópia, ao passo que as perdas de regiões desprovidas de elementos reguladores e as duplicações de genes sem efeito de carga são mais provavelmente benignas (BAPTISTA et al., 2008; PYATT; ASTBURY, 2011; SCHAAF; WISZNIEWSKA; BEAUDET, 2011). Em relação ao achados do presente estudo, como mencionado previamente na descrição das alterações cromossômicas submicroscópicas (Item 5.7, Tabelas 13 e 14, Figuras 16 à 22), apenas a +(12) no indivíduo B2 e a del(13q14) nos indivíduos B6 e C8 são classificadas como de grande relevância, uma vez que reconhecidamente estão entre as mais freqüentemente descritas na LLC e podem ser associadas aos mecanismos geradores de doença e ao perfil prognóstico citogenético/molecular previamente relatados para essa patologia (ROSSI et al., 2013; WANG, C.; WANG, 2013). As 20 CNVs restantes (representando 87% do total e correspondendo a 14 regiões de perdas e 7 de ganhos) foram comparadas com as informações disponíveis nos bancos de dados UCSC –

Genomes Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu), KEGG – Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (http://www.genome.jp/kegg) e OMIM – Online Mendelian Inheritance in Man (http://www.omim.org) e nenhuma

correspondência pode ser estabelecida entre esse conjunto de deleções e os mecanismos fisiopatogênicos já estabelecidos para LLC, assim como nenhuma dessas regiões de ganho envolvia genes susceptíveis ao efeito de carga. Como mencionado anteriormente, nenhuma das CNVs identificadas nesse estudo estava presente de maneira simultânea e exclusiva em todos os indivíduos afetados (Figuras 17, 18 e 19), e não houve diferença significativa da representação das CNVs identificadas nos mononucleares de sangue periférico com aquelas das células da saliva dos indivíduos afetados (Figuras 20, 21 e 22). Isto posto, apesar da técnica de CMA ter permitido o reconhecimento de 20 CNVs que de outro modo não seriam identificadas por citogenética convencional ou por FISH, não foi possível apontar qualquer relação entre esse grupo de alterações e os mecanismos de herança ou geradores de doença já estabelecidos para LLC nesta família.

Cabe ainda ressaltar que a existência de genes de susceptibilidade para LLC familiar ainda é motivo de discussão. A maior parte dos estudos disponíveis na literatura sobre esse tema empregou a técnica de Genome-Wide

Association e análises de ligação todavia, a despeito de arrolar um número

expressivo de casos, os resultados divulgados não nos permite estabelecer uma relação de consenso (CROWTHER-SWANEPOEL; HOULSTON, 2009; FULLER et al., 2008; SELLICK et al., 2007; SLAGER et al., 2011). Das publicações de Sellick et al em 2007 e Slager et al em 2011, que incluíram respectivamente 206 e 102 famílias acometidas por LLC (material proveniente de diferentes consórcios), podemos destacar as regiões 2q21, 6p21.3, 6p22, 6p25, 16q24.1 e 18q21 como as “candidatas” mais provavelmente relacionadas a susceptibilidade. Maior ênfase foi dada pelos autores às regiões 6p25 e 16q24.1 por corresponderem, nessa ordem, aos genes IRF4 e IRF8, os quais estão envolvidos com o metabolismo do Interferon (fator implicado com os processos de maturação e diferenciação de linfócitos B). Por sua vez, ao avaliar uma família com 144 membros, dos quais 11 eram afetados por LLC, Fuller et al em 2008 descreveram outras regiões cromossômicas (2q37, 4q35, 11p15 e 14q24) como associadas ao fenótipo, destacando a possibilidade de

que “alelos exógenos” (incluídos pelo cruzamento não-cosanguíneo) também influenciem a manifestação da doença nos descendentes.

Como demonstrado, nenhuma das regiões cromossômicas mencionadas acima foi detectada pela CMA nos sujeitos da pesquisa do presente estudo e a elucidação dos mecanismos subjacentes a predisposição genética da LLC mostrou ser um problema de solução complexa. Estima-se que os dados disponíveis até o momento sejam suficientes para explicar apenas 16% do risco de susceptibilidade relativo a LLC familiar e espera-se que o emprego das tecnologias de seqüenciamento de última geração, aplicadas em ensaios abrangendo linhagens germinativas de LLC familiar e esporádica, possa contribuir para o melhor entendimento dos fenômenos responsáveis pelo desenvolvimento dessa doença na população (BROWN, 2013).

Outro ponto que merece destaque é fenômeno da AG, definida pela observação de que uma doença de transmissão hereditária demonstra idade de início mais precoce ou maior gravidade clínica nas novas gerações. Descrita inicialmente nas miopatias e doenças neurodegenerativas de comportamento mendeliano (distrofia miotônica de Steinter, doença de Huntington, ataxia espinocerebelar), a AG foi primeiramente associada as onco-hematopatias por Horwitz et al em 1996 em um estudo onde os autores descrevem nove famílias afetadas por leucemia mielóide aguda com padrão de herança autossômico dominante (HORWITZ; GOODE; JARVIK, 1996). A primeira investigação sistemática sobre AG em LLC familiar foi publicada por Yuille et al em 1998, e posteriormente confirmada por outros autores, com a descrição de uma redução de cerca de 20 anos (estatisticamente significativa) na média de idade dos descendentes em comparação a dos pais no momento do diagnóstico, e referindo também que a doença se comportava de modo mais agressivo na população mais jovem (GOLDIN; CAPORASO, 2007; GOLDIN et al., 2010; WIERNIK et al., 2001; YUILLE; HOULSTON; CATOVSKY, 1998; YUILLE et al., 2000). Por outro lado, em uma investigação realizada à partir dos dados disponíveis nos Registros de Câncer da Noruega e Dinamarca, os autores não encontraram significância na diferença de idade entre pais e descendentes afetados por LLC na população escandinava argumentando que, pelo menos em parte, a AG pode ser explicada pelo fato de que nos dias atuais a população têm maior acesso a realização de exames laboratoriais rotineiros,

permitindo assim o diagnóstico mais precoce de patologias como a LLC (conforme mencionado no Item 1.2.2 da Introdução) (AWAN et al., 2010). Diferentemente das miopatias e doenças neurodegenerativas mendelianas (onde a antecipação decorre da expansão de trinucleotídeos repetidos) (HORWITZ; GOODE; JARVIK, 1996), assim como os mecanismos de susceptibilidade, as vias genético-moleculares responsáveis pela AG na LLC familiar ainda não são conhecidas.

Os dados representados nas Tabelas 8, 9 e 11 sugerem de modo contundente a ocorrência de AG da LLC familiar na população alvo desse estudo. Mesmo que a precocidade de acesso aos programas de promoção à saúde (com a realização rotineira de exames laboratoriais de triagem promovida no ambiente de trabalho) pudesse justificar a antecedência de três décadas no diagnóstico da LLC do indivíduo C8 em relação ao indivíduo B6, resta ainda o fato já comentado que em C8 a doença se comporta de forma muito mais agressiva: progressão da avaliação de risco para “intermediário” devido ao surgimento de adenomegalias (Raí/Binet I/B – Tabelas 2 e 3) e TDL oito vezes menor do que o observado em B6. Portanto, a AG do caso aqui reportado contempla ambas as prerrogativas postuladas por Horwitz et al em 1996, quais sejam o início antecipado e o fenótipo mais grave da doença em gerações sucessivas.

Como mencionado anteriormente, a análise dos resultados obtidos pela CMA no presente estudo indicou que a única diferença relevante do ponto de vista citogenético molecular entre indivíduos C8 e B6 reside no fato de que no primeiro a del(13q14) foi identificada em homozigose e no segundo em heterozigose (Tabelas 13 e 14, Figuras 18 e 19). Neste ponto vale a pena lembrar que as deleções em homozigose são reconhecidas como as CNVs que mais provavelmente guardam relação com os mecanismos moleculares de origem e progressão de doença (BAPTISTA et al., 2008; PYATT; ASTBURY, 2011; SCHAAF; WISZNIEWSKA; BEAUDET, 2011). De acordo com as informações da Tabela 5 e da Figura 10 (Item 1.1.8 – Avaliação laboratorial do prognóstico) o sistema de estadiamento citogenético/molecular reconhece que a expectativa de SG dos pacientes com del(13q14) não difere significativamente da população normal pareada pela idade (ROSSI et al., 2013). É notável que no indivíduo B6 a LLC mantém um comportamento

extremamente indolente, ou seja, sem qualquer repercussão sistêmica e com TDL ainda não atingido mesmo após 96 meses de seguimento (Tabelas 8 e 9), exatamente como previsto pelo conjunto dos fatores prognósticos. No entanto, como previamente aludido, essa não é a realidade dos fatos para o indivíduo C8 que padece de uma patologia de agressividade previamente insuspeita, a qual cursa com TDL de 12 meses (Tabela 9) e que em apenas 36 meses teve sua avaliação de risco elevada para “intermediário” pelo sistema de estadiamento de Raí/Binet (devido ao aparecimento de adenomegalias – Tabela 8), reduzindo assim sua expectativa de SG para cerca de sete anos (Tabelas 2 e 3). É importante registrar que no estudo que culminou com a publicação do sistema de estadiamento citogenético/molecular da LLC, a metodologia de FISH foi a selecionada pelos autores para a investigação das alterações cromossômicas nas 1274 amostras analisadas, e que por conseguinte não foram considerados os eventuais efeitos das deleções em homozigose ou da perda de heterozigose (ROSSI et al., 2013).

Ao examinar o circuito de interação “TP53-microRNA” proposto inicialmente por Fabbri et al em 2011 e posteriormente por Wang e Wang em 2013 (FABBRI et al., 2011; WANG, C.; WANG, 2013) descrito no Item 1.1.9 da Introdução (Fisiopatologia, Figura 12), podemos conceber que a del(13q14) em homozigose identificada no indivíduo C8 pode exercer influência na carga de expressão de miR-15-a e miR-16-1 e resultar em um efeito ainda maior sobre a regulação de BLC-2 e TP53 do que o esperado quando esta mutação ocorre em heterozigose, como observado no indivíduo B6. Em um estudo envolvendo 16 casos de LLC esporádica, Sellmann et al em 2010 empregaram as técnicas de CMA, perfil de expressão gênica e real time RT-PCR e demonstraram que nos indivíduos com del(13q14) em homozigose (deleção bialélica) o nível de expressão de miR-15-a e miR-16-1 estava significativamente reduzido, ao passo que naqueles com deleção em heterozigose (monoalélica) a expressão desses microRNAs era semelhante a dos casos controle (SELLMANN et al., 2010). Dessa forma, entre outros fatores, com a deleção bialélica resultante da perda de heterozigose do cromossoma 13, a carga de miR-15-a e miR-16-1 diferencialmente expressa em C8 pode estar relacionada ao fenômeno de AG e ao comportamento mais agressivo da LLC neste indivíduo, mesmo quando o estadiamento clínico e

citogenético/molecular indicavam uma patologia de “risco baixo” ou “muito baixo”, respectivamente (Tabela 10).

De modo geral, a maioria dos autores reconhece que do ponto de vista clínico a LLC familiar comporta-se de modo semelhante a forma esporádica da doença, sobretudo no tange as características de apresentação e de evolução (progressão), mas também no tocante a expressão imunofenotípica e ao perfil de alterações citogenético-moleculares (AWAN et al., 2010; GOLDIN; CAPORASO, 2007; GOLDIN et al., 2010; GOLDIN; SLAGER, 2007; ISHIBE et al., 2001; SLAGER; KAY, 2009; WIERNIK et al., 2001; YUILLE et al., 2000). Entretanto, Setlur et al em 2010 empregaram a técnica de CMA e conduziram um estudo comparando 37 casos de LLC esporádica com 38 casos de LLC familiar e demonstraram importantes diferenças. A presença de del(11q), relacionada com a perda do gene ATM e a um prognóstico adverso, foi mais prevalente na forma esporádica da doença, ao mesmo tempo que na forma familiar houve predomínio da associação de ganhos na região 14q, del(13q14) em homozigose e status mutado do IGVH, o que conferiu uma vantagem em termos de “tempo para início do primeiro tratamento” (SETLUR et al., 2010).

Considerando todas essas informações, é razoável conjecturar que serão necessários novos estudos, contemplando o número adequado de casos, para que o sistema de estadiamento citogenético/molecular possa incluir a avalanche de informações geradas pela CMA e ser validado no ambiente da LLC familiar. Neste contexto, o fenômeno de AG deve ser somado aos demais fatores para que seu valor possa ser testado em um novo modelo de avaliação do prognóstico.