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O transcritoma consiste no conjunto completo de transcritos de uma célula e a sua quantidade para um determinado estágio especifico do desenvolvimento ou condição fisiológica, pois avalia o conjunto dos RNAs transcritos, em uma determinada célula e situação, refletindo a atividade gênica momentânea. Compreender o transcritoma é essencial para interpretação dos elementos funcionais do genoma, para revelar constituintes moleculares de células e tecidos e

também para a compreensão de doenças e do desenvolvimento. Os principais focos da análise de transcritomas são: catalogar todos os tipos de transcrição, incluindo mRNAs, RNAs não-codificadores e miRNAs; determinar a estrutura transcricional de genes, como os seus sítios de início 5’ e fim 3’, padrões de splicing e outros modificadores pós-transcricionais; e quantificar os níveis de expressão da mudança de cada transcrição durante o desenvolvimento e sob condições diferentes (WANG; GERSTEIN; SNYDER, 2009).

A análise do transcritoma constitui uma excelente ferramenta para estudar a expressão diferencial dos genes. Geralmente essa análise é feita de forma grosseira resultando em sequências curtas que são utilizadas como marcadores ou etiquetas e demonstram a atividade transcricional daquela dada região do genoma. Essa limitação estava ligada ao método de sequenciamento de Sanger, que demandava bibliotecas de cDNA e um grande número de sequenciamentos para acumular dados representativos de EST, porém com advento de técnicas de sequenciamento de última geração como o pirosequenciamento e o PCR em ponte, criou-se um novo paradigma operacional. Com essas novas técnicas, múltiplos sequenciamentos são feitos em paralelo a um custo que representa uma fração daquele realizado com a tecnologia de Sanger (TORRES et al., 2008; WANG; GERSTEIN; SNYDER, 2009).

Para se realizar um RNA-Seq, em geral, uma população de RNA (total ou fracionada) é convertida em uma biblioteca de fragmentos de cDNA com adaptadores ligados a uma ou as duas pontas dessa pequena sequência. Cada molécula, com ou sem amplificação, é sequênciada em uma plataforma de alto rendimento para obter sequências curtas de uma extremidade (single-end sequencing) ou de ambas extremidades (pair-end sequencing). As reads são tipicamente de 30-400 pb, dependendo da plataforma de sequenciamento utilizada. Ao final do sequenciamento todas as reads são alinhadas a um genoma referência ou transcritos de referência ou montado sem um genoma de referência, podendo assim indicar tanto a estrutura transcricional, quanto o nível de expressão de cada gene (WANG; GERSTEIN; SNYDER, 2009).

Para comprovar a eficiência do método de sequenciamento de alto desempenho, um estudo que consistia em demonstrar o potencial do sequenciamento Illumina para detecção de níveis de expressão de mRNA, foi proposto, para tal, os dados foram comparados com os resultados obtidos pela

técnica de arranjo Affymetrix, utilizando uma mesma amostra de RNA de rim e de fígado. O estudo mostrou que o sequenciamento Illumina tem alta reprodutibilidade, com pouca variação técnica, além de ser possível realizar o sequenciamento de cada amostra de RNA uma única vez utilizando uma única canaleta para isso. O sequenciamento Illumina também permite análises adicionais, tais como, detecção de baixos níveis de expressão gênica, variantes de splicing alternativo e novos transcritos (MARIONI et al., 2008).

Com o aprimoramento das técnicas de sequenciamento, surgiram novos desafios para a bioinformártica, tais como, o desenvolvimento de métodos eficientes para armazenar, recuperar e processar grandes quantidades de dados, que devem ser suficientes para reduzir erros e para remover sequências de baixa qualidade. De forma geral, uma vez que reads de alta qualidade foram obtidas, a primeira tarefa é mapear as reads a partir de um genoma de referência ou montá-las em contigs alinhando a sequência genômica para revelar as estruturas de transcrição. A partir disso são utilizados softwares que permitem a visualização desse alinhamento e a confecção de gráficos gerados a partir do tipo de elemento transcricional que se deseja. Um desafio para o futuro é desenvolver métodos computacionalmente simples para identificar novos eventos de splicing que ocorrem entre duas sequências distantes ou entre éxons de dois genes (WANG; GERSTEIN; SNYDER, 2009).

Nesse contexto, análise do perfil de miRNAs nas amostras de linfócitos T, associado aos dados obtidos por transcritoma e bioinformática, objetivo e perspectiva deste trabalho, servirão para a descoberta de biomarcadores preditivos da tolerância operacional. Esse conhecimento busca contribuir para a seleção de agentes imunossupressores, ajustes de dosagens e pode ainda contribuir para a seleção de pacientes tolerantes operacionais em potencial e se beneficiarão com a possível retirada da terapia imunossupressora. Pode ainda subsidiar o desenvolvimento de novas terapias e/ou validar moléculas que provavelmente serão utilizadas como biofármacos de última geração. Haja vista que o transplante de órgãos é uma terapia que vem se difundindo com o avanço da medicina. O desenvolvimento de novas técnicas cirúrgicas associadas a drogas imunossupressoras tornou rotineiro o transplante de órgãos. No entanto, a rejeição

pós-transplantes ou falência do enxerto, devido à resposta do receptor, ainda é um fator limitante para esse tipo de intervenção.

O estudo proposto faz parte de um projeto maior intitulado: “Estudo do perfil imunológico regulador em pacientes com longo tempo de transplante de órgãos sólidos, em estado de tolerância operacional: bases para novas estratégias terapêuticas imunomoduladoras na clínica”, coordenado pela Profª. Drª. Verônica Coelho (INCOR – USP) e está contido dentro dos projetos do Instituto de Investigação Imunológica– (iii) INCT/CNPq, coordenado pelo Prof. Dr. Jorge Kalil. Além disso, esse projeto também faz parte do Núcleo de Excelência em Biofármacos e Imunogenômica, apoiado pelo Edital FAPDF 03/2009 – Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX/FAP-DF/CNPq), sob coordenação do Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido.

2. OBJETIVOS