Dos 29 tumores submetidos a estudo, 12 (41%) possuíam status HER-2 positivo, tendo apenas 7 destes apresentado marcação positiva para vWF. Avaliando a relação entre a marcação para vWF e o status HER-2 positivo ou negativo (figura 13), não foi possível evidenciar qualquer correlação estatisticamente significativa.
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Figura 13 – Relação entre a expressão de DMV e o status HER-2
3.4 Discussão
A imunodeteção das proteínas MMP-2, VEGF e vWF foi alcançada com sucesso neste estudo, possuindo cada um deles um padrão de marcação particular, tendo-se assim cumprido um dos objetivos a que este estudo se propôs inicialmente.
No que respeita à imunomarcação para MMP-2, os padrões de marcação obtidos foram sempre citoplasmáticos, tendo, em alguns casos, ocorrido também marcação membranar. Atualmente a localização das MMPs nas células ainda não está completamente definida nos TMFs (Akkoc et al., 2012). Akkoc et al., num trabalho de 2012, referem que as células neoplásicas apresentam normalmente um padrão de marcação citoplasmático e difuso, podendo também apresentar uma marcação semelhante as células tumorais no interior dos vasos linfáticos, fibroblastos do estroma, células inflamatórias e células endoteliais dos vasos sanguíneos da área envolvente do tumor.
Neste estudo não foi encontrada qualquer correlação estatisticamente significativa entre a expressão de MMP-2 e os vários parâmetros clinicopatológicos e imunohistoquímicos avaliados. Apenas se pode referir que o valor obtido na análise estatística para avaliação de correlação entre as expressões de MMP-2 e de HER-2 foi próximo do valor de cut-off de p < 0,05 (p = 0,063 e &2 = 7,305), pelo que talvez a utilização de uma amostra maior tivesse permitido esclarecer este assunto (anexo 4).
Sabe-se que as MMPs são responsáveis pela degradação das proteínas da MEC e desta forma importantes no processo de metastização tumoral (Figueira et al., 2009). Apesar disto, subsiste alguma controvérsia no que respeita aos níveis de expressão das MMPs nos tumores mamários da mulher, assim como da cadela e da gata (Akkoc et al., 2012). Existem estudos que descrevem uma correlação positiva entre a expressão de MMPs e a malignidade (Kawai et al., 2006; Figueira et al., 2009), enquanto outros autores não encontraram qualquer associação entre a expressão de MMPs, o prognóstico e classificação histológica dos tumores mamários (Papparella et al., 2002; Köhrmann et al., 2009). No estudo desenvolvido por Akkoc et al., em 2012, o primeiro trabalho em carcinoma túbulo-papilífero felino e MMP-2, é descrita uma relação estreita entre MMP-2 e os TMFs, com a indicação de que a quantificação das MMPs por zimografia pode fornecer informação valiosa para o prognóstico de TMFs, afirmando que elevadas atividades de MMPs estão fortemente relacionadas com a metastização (Akkoc et al., 2012). Contudo, a amostra estudada por Akkoc et al. era constituída por apenas 18 casos. Também está descrita a associação entre níveis altos de expressão de MMP-2 e a positividade para HER-2 nas células de estroma de tumores mamários (Tetu, Brisson, Lapointe & Bernard, 1998). O’charoenrat et al., em 1999, sugeriram
que a sobrexpressão de HER-2 pode ser responsável pela expressão ou ativação de MMPs numa fase inicial do tumor mamário, facilitando assim a progressão da doença e a metastização. Pensa-se que os níveis aumentados de MMPs se devam ao estímulo aumentado mediado pelo indutor extracelular das MMPs, que é sobre-regulado pelo HER-2 (Menashi et al., 2003).
Relativamente à marcação para VEGF, as células marcadas apresentaram um padrão citoplasmático granular, tendo uma porção significativa dos tumores alvo de estudo exibido marcação em mais de 75% das células. Millanta et al., em 2002, referiram que a deteção de expressão de VEGF é pouco clara em tecido mamário normal. No tecido tumoral, o VEGF é normalmente expresso no citoplasma das células neoplásicas, ocasionalmente no estroma, e de forma pouco marcada nas células endoteliais. Algumas células tumorais apresentam um padrão de marcação granular (Millanta et al., 2002).
No presente estudo foi encontrada uma correlação estatisticamente significativa entre uma maior intensidade de marcação para o VEGF e um menor período de sobrevivência (p = 0,039 e &2 = 8,372 - anexo 5) e entre uma menor expressão de VEGF e a classificação histológica de carcinoma tubular (p = 0,031 e &2 = 13,914 – anexo 6). Vários estudos retrospetivos em tumores mamários humanos indicam que a sobrexpressão de VEGF está inversamente relacionada com o tempo livre de doença, sobrevivência, ou ambos, e que níveis altos de VEGF podem permitir identificar subgrupos de pacientes com pior prognóstico (Gasparini, 2000). Por outro lado, a DMV também está descrita como fator de prognóstico no tumor mamário humano (Gasparini et al., 1993; Obermair et al., 1995). No trabalho realizado por Millanta et al., em 2002, é descrita a relação inversa entre a expressão de VEGF e tempo de sobrevivência em TMFs. Este estudo demonstrou ainda a existência de uma correlação positiva entre a expressão de VEGF, a classificação histológica e o estadiamento tumoral, não tendo evidenciado qualquer relação estatisticamente significativa entre a expressão de VEGF e o status de HER-2. No entanto, está descrito que em fibroblastos NIH 3T3 transfectados para sobrexpressar HER-2, a produção de VEGF encontra-se aumentada e é bloqueada com a utilização de um anticorpo monoclonal anti-HER-2 (Petit et al., 1997). Este aumento de VEGF associado à sobrexpressão de HER-2 pode conduzir a uma angiogénese aumentada e diminuir a hipóxia tumoral (Linderholm et al., 2000). Contrariamente, um estudo realizado por Blackwell et al., em 2004, revelou que tumores com sobrexpressão de HER-2 apresentavam baixa expressão de VEGF. Este facto pode ser explicado pela elevada angiogénese presente nos tumores com sobrexpressão de HER-2, que leva a menor hipóxia e consequentemente menor produção de VEGF (Blackwell et al., 2004).
Quanto à marcação para vWF e posterior avaliação da DMV, as células endoteliais vasculares apresentaram um padrão citoplasmático, permitindo assim a visualização dos microvasos. Foram 15 os tumores que apresentaram média superior a 2,2 microvasos por hot spot, tendo o caso de maior DMV correspondido a uma média de 15 microvasos por hot spot. A marcação dos microvasos com anticorpo anti-vWF é normalmente intensa em tecidos normais e neoplásicos, podendo também verificar-se em algumas células inflamatórias e no tecido conjuntivo, tornando a avaliação da DMV difícil (Millanta et al., 2002).
No estudo aqui apresentado foi possível encontrar uma correlação direta entre a DMV e o período de sobrevivência (p = 0,000 e &2 = 55,339 - anexo 7). Esta relação direta é o oposto do que seria de esperar, pois a extensão da formação de novos vasos está correlacionada com a ocorrência de metástases no tumor mamário humano (Weidner, Semple, Welch & Folkman, 1991). No estudo realizado por Millanta et al. em 2002, não foi encontrada qualquer correlação entre os parâmetros DMV e o prognóstico. As diferenças entre estudos podem resultar de vários fatores, como demonstrado pela ausência de um valor preditivo limite de hot spots vasculares em alguns estudos com tumores humanos (Fox et al., 1995). A hipótese sugerida para justificar a ausência de correlação entre DMV e prognóstico inclui a variabilidade intra ou inter observador, a seleção de áreas com maior intensidade de neovascularização e a heterogeneidade da distribuição vascular no tecido neoplásico, que pode exigir um número elevado de campos examinados para obter real poder estatístico (Fox et al., 1995; Weidner, 1998).
Jong et al. em 1998, tentam justificar a ausência de correlação entre DMV e a expressão de VEGF, sugerindo que vários agonistas adicionais, recetores e inibidores que não o VEGF podem estar envolvidos na formação de novos vasos. Em especial, o papel dos recetores do VEGF (VEGFR-1 e VEGFR-2) tem sido investigado (Jong et al., 1998). A inexistência de uma correlação entre a DMV e expressão de VEGF sugere que o VEGF possa atuar como fator de crescimento autócrino direto para as células tumorais, via VEGFR-1, e que a angiogénese pode ser promovida por via parácrina, pelo qual o VEGF é produzido por fibroblastos e células tumorais que, de seguida, se liga às células endoteliais por via induzida pelos VEGFRs (Decaussin et al., 1999).
Neste estudo não foi encontrada qualquer correlação estatisticamente significativa entre a DMV e o status de HER-2. Apesar disto, Blackwell et al., num estudo de 2004, referem uma correlação estatisticamente significativa positiva entre a amplificação do gene de HER-2 e a DMV. Esta angiogénese aumentada observada em tumores mamários com amplificação de HER-2 pode explicar, em parte, o porquê deste ser um fator prognóstico tão importante nos tumores mamários (Blackwell et al., 2004). Petit et al., em 1997, sugerem mesmo que nos
tumores mamários humanos, a expressão de HER-2 pode ser um importante indicador da velocidade de angiogénese.
3.5 Conclusão
É de extrema importância clarificar o papel de MMP-2, VEGF e DMV como indicadores de prognóstico e alvos de terapêutica dirigida em TMFs, tendo em conta o mau prognóstico que geralmente lhes está associado.
O estudo aqui apresentado sugere que o marcador VEGF não só influencia negativamente o tempo de sobrevivência do paciente, como também se encontra relacionado com o tipo histológico do TMF. Os resultados obtidos relativos à DMV e a forma como este marcador afeta o tempo de sobrevivência são controversos. Desta forma, para a dissipar as dúvidas quanto às possíveis interpretações deste resultado será necessário aumentar a amostra, permitindo a obtenção resultados inequívocos. Tanto nestes como nos restantes marcadores e nos parâmetros clinicopatológicos e imunohistoquímicos avaliados, em que não foram estabelecidas correlações estatisticamente significativas, é essencial estabelecer o seu valor prognóstico, de maneira a que futuros pacientes possam beneficiar de estimativas mais fiáveis quanto à sua sobrevivência e, eventualmente, de uma terapêutica dirigida.
Apesar dos resultados obtidos terem sido positivos, é importante que se continue a testar diferentes protocolos de IHQ, com os mesmos ou diferentes anticorpos, de forma a otimizar a técnica e possibilitar a reprodutibilidade de resultados, validando os critérios de avaliação.
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