8. Churches
8.7 Analysis of the ecclesiastical buildings
Regiões. Os padrões observados em outras análises em relação às brotações na região Noroeste foram confirmados. Realmente as plantas cítricas dessa região tendem a emitir mais brotações que as plantas do Centro ou do Sul. Considerando as características do patossistema em questão, esse deve ser o fator isolado mais importante que explica as diferenças de incidência entre regiões. A ausência de diferenças significativas entre o Centro e Sul não era esperada. A hipótese inicialmente levantada considerava que havia um gradiente decrescente Norte – Sul para todas as variáveis. O resultado entre Centro e Sul pode, no entanto, ser explicado em função das áreas experimentais estarem aproximadamente na mesma latitude (Gavião Peixoto e Santa Rita do Passa Quatro); a definição Centro e Sul é oriunda de uma separação lógica entre zonas produtoras e não entre regiões geográficas (Fundecitrus, 2001).
Como suposta conseqüência dos resultados para brotações, a Área Abaixo da Curva de Ramos Sintomáticos (AACRS) apresentou o mesmo padrão, com valores superiores para a região Noroeste e estatisticamente iguais para as outras regiões. Nesse caso, valores maiores para o Noroeste já eram esperados. A inesperada igualdade entre Centro e Sul, no entanto, pode ser explicada se levarmos em conta a hipótese das mudas infectadas para região Sul. Nessa circustância, dadas
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condições climáticas normais, plantas precocemente infectadas tenderiam a apresentar mais sintomas, se igualando ou mesmo superando outras regiões. Por outro lado, a mesma latitude das duas áreas experimentais também pode ser uma explicação válida.
A superioridade estatística da região Sul em termos de infecções assintomáticas indica que seu nível de infecção é alto. Ora, se por outro lado a expressão de sintomas é relativamente pequena (em termos de ramos sintomáticos), mas também alta no que refere a percentual de plantas afetadas, tem-se a seguinte situação: muitas plantas infectadas, muitos ramos infectados, baixa expressão dessas infecções. Esse quadro é o grande indicativo de uma origem pré-plantio de grande parte das infecções, associada a uma baixa favorabilidade ambiental para a expressão de sintomas.
A semelhança entre os valores de infecção assintomática para Noroeste e Centro deve indicar apenas que a maior parte das infecções no Noroeste revertem- se rapidamente para manifestação de sintomas (ramos sintomáticos no Noroeste são mais abundantes que no Centro). Os resultados para infecções totais, ou seja, regiões Noroeste e Sul com valores estatisticamente iguais entre si e superiores ao obtido na região Centro indicam que, caso a hipótese de mudas infectadas para o Sul esteja correta, a manifestação da CVC é comparável entre pomares localizados em regiões com altas taxas de infecção e regiões com baixas taxas, mas nas quais foram plantadas mudas infectadas.
A ausência de diferença estatística entre regiões quando comparadas com base na concentração relativa de X. fastidiosa aparentemente indica que o clima em diferentes regiões não afeta a multiplicação da bactéria na planta. Essa conclusão é corroborada pela ausência de correlaçãqo entre variáveis climáticas e concentração relativa de bactéria (ver item 5.4). No entanto, os valores tenderam a um gradiente entre a região Sul (4,96), Centro (5,38) e Noroeste (6,11), o que merece um estudo mais detalhado.
Estações do Ano. Contrariando o senso comum, que supunha maiores brotações na Primavera e no Verão, os resultados indicaram uma predominância de brotações no Inverno. No entanto, as brotações de Primavera ainda possuem uma
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posição de destaque. As estações do ano não puderam ser distinguidas com base nos sintomas. Apesar de ter sido detectada uma variação sazonal (ver itens 5.3.1 e 5.3.2), não houve diferença estatística entre as épocas do ano. Também não houve diferença para infecção total (provavelmente influenciada pelos valores de sintomas). Quanto às infecções assintomáticas, elas foram mais detectadas no Verão em comparação com a Primavera, mas todas as outras comparações foram não-significativas.
A não constatação de diferença estatística entre estações do ano para concentração relativa de X. fastidiosa, embora condizente com os dados obtidos por Pereira (2000), precisa ser melhor investigada. O padrão geral dessa variável (ver item 5.3.1) aponta para maiores concentrações de bactéria na Primavera e Verão, o que encontra paralelo no modelo proposto por Laranjeira (1997b) e também nos dados de infectividade apresentados por Pereira (2000).
6 CONCLUSÕES
• As curvas de progresso da CVC não puderam ser ajustadas a modelos conhecidos.
• O progresso da CVC apresentou diversos picos de derivada, em sua maioria coincidindo com a primavera e o verão.
• O padrão espacial das plantas doentes não apresentou diferenças significativas entre as régiões avaliadas, podendo ser caracterizado como levemente agregado.
• Número de novas brotações foi a variável que mais distinguiu entre as três regiões.
• As variáveis relacionadas à doença (infecções assintomáticas, infecções totais, sintomas e concentração bacteriana) apresentaram padrões sazonais, mas não foi observada diferença estatística entre as estações do ano.
• O pomar da região Noroeste apresentou maior quantidade de brotações novas e maior quantidade de sintomas.
• O pomar da região Sul apresentou maior quantidade de infecção assintomática.
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A1 – Procedimentos adotados para execução dos testes DIBA e ELISA Procedimento para o teste DIBA
1. Retirar a nervura de uma folha assintomática com o auxílio do bisturi. Picar a nervura em fatias finas, homogeneizar a amostra, pesar 100mg e acondicionar em tubo de Eppendorf de 1,5mL.
2. Adicionar o tampão carbonato na proporção 1/10 (peso da amostra/volume do tampão). Deixar em repouso por uma noite para assentar e rehidratar o material. 3. Colocar o tubo em água fervente por 10 minutos (banho-maria).
4. Colocar 70 microlitros da amostra em membrana de difluoreto de polivinilideno e deixar secar por uma hora em estufa à 37ºC ou no ambiente até que se perceba a absorção total da gota na membrana.
5. Lavar em água destilada para retirar o excesso do tampão. 6. Colocar a membrana em TTBS em fervura por 2 minutos.
7. Bloquear a membrana por no mínimo 1 hora em leite em pó desnatado 5% diluído em TTBS.
8. Lavar a membrana três vezes em água destilada e em TTBS.
9. Colocar a membrana em antissoro primário por uma noite em temperatura ambiente (antissoro UF-26 diluído 1:100.000 em TTBS).
10. Lavar como no item 8
11. Colocar a membrana em antissoro conjugado com fosfatase alcalina (Sigma A3937, diluído 1:30.000 em TTBS), por 2 horas em estufa a 37 ºC.
12. Lavar como no item 8.
13. Dissolver (no escuro) a pastilha de revelação BCIP/NBT (Sigma B5655) em 10 ml de água destilada e colocar sobre a membrana até o aparecimento da cor.
14. Parar a reação com água destilada quando os controles positivos desenvolverem coloração roxa. Secar a membrana, fazer a leitura e proteger da luz.
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Procedimento para o teste ELISA
1. Colocar 100 microlitros de amostra (processadas como no procedimento para Dot-
Blot) em cada poço da placa.
2. Incubar a 37 ºC por 1 hora. 3. Lavar três vezes em PBST.
4. Bloquear a placa com leite em pó desnatado 5% diluído em PBS, 200 microlitros para cada poço. Incubar em estufa a 37 ºC por 1 hora.
5. Lavar como no item 3.
6. Colocar 100 microlitros de antissoro primário (antissoro UF-26 diluído 1:100.000 em PBST) em cada poço. Incubar por 1 hora a 37 ºC.
7. Lave como no item 3.
8. Colocar 100 microlitros do antissoro conjugado com fosfatase alcalina (antissoro Sigma A3937 diluído 1:30.000 em PBST) em cada poço. Incubar por 1 hora a 37ºC. 9. Lave como no item 3.
10. Colocar 100 microlitros do Tampão de Revelação para o teste Elisa em cada poço. Incubar no escuro até desenvolver coloração amarela.
11. Fazer leitura no leitor de ELISA, a 405nm.
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A2 - Composição dos tampões utilizados nos testes serológicos
TTBS
• 12,2 g de Tris • 23,4 g de NaCl • 1,0 mL de Tween 20 • Água destilada q.s.p. 2,0 L
• pH corrigido para 7,5 com HCl 10M
PBS • 8 g de NaCl • 0,2 g de KH2HPO4 • 1,15 g de Na2HPO4 • 0,2 g de KCl • Água destilada q.s.p. 1,0 L
• pH corrigido para 7,5 com HCl 10M
• Para fazer o PBST basta acrescentar 0,5mL de Tween 20 por litro de tampão.
Tampão Carbonato • 1,59 g de Na2CO3 • 2,93 g de NaHCO3
• Água destilada q.s.p. 1,0 L
• pH corrigido para 9,6 com HCl 10 M
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Tampão de revelação para teste DIBA • 12 g de Tris
• 5,8 g de NaCl • 1 g de MgCl 2
• Água destilada q.s.p. 1,0 L
• pH corrigido para 9,5 com HCl 10M
• Na hora do uso, para cada 10 mL de tampão, acrescenta-se uma pastilha de BCIP/NBT Sigma Fast
Tampão de revelação para teste ELISA • 97,0 mL de Dietanolamina
• 100 mg de MgCl2
• Água destilada q.s.p. 1,0 L
• pH corrigido para 9,8 com HCl 10M
• Na hora do uso, para cada 20 mL de tampão, dissolve-se 20mg de NitroFenilFosfato (NPP).
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