Analyse av fettsyrer med gass kromatografi (GC)

Gass kromatografi (GC) er en metode som gir et spekter av forbindelser i en prøve, kalt kromatogram, basert på molekylvekt, kjedelengde, grad av umetning, plassering og

geometrisk konfigurasjon på dobbeltbindinger (10) (128) (129). Det er en veldig nøyaktig, men ressurskrevende teknikk (20). Separasjon på GC er mulig når stoffene i prøven har forskjellig damptrykk (130). Denne teknikken brukes i stor grad i analyse av de store lipidklassene, men fettsyrer er klassen som analyseres mest på GC (129).

49

Et GC-instrument består av en injektor (der prøven appliseres gjennom en sprøyte), en

kolonne med stasjonærfase inni en ovn, en inert mobilfase og en detektor, som vist i Figur 3.7 (20) (129).

Figur 3.7: Prinsippskisse av et GC-instrument (131).

Første trinn i en typisk analysemetode for lipider er at en liten mengde lipid løses i et

løsemiddel (129). Prøven appliseres ved bruk av sprøyte i en oppvarmet injeksjonssone (200-300 °C). Den høye temperaturen gjør at mye av prøven fordamper fort. For høykonsentrerte prøver av fettsyrer og estere er det vanlig å bruke splitinjeksjon (20) (129). Splittinjeksjon betyr at kun en liten del av prøven går gjennom kolonnen (29).

Mobilfasen er en inert gass (eksempelvis helium eller nitrogen) som strømmer gjennom kolonnen (20). Kolonnen trenger regulert og kontinuerlig strøm av mobilfase, det vil si et system som fordamper og blander prøven med mobilfasen (129) (130). Etter prøven har fordampet, følger den mobilfasen gjennom kolonnen (20). Høy strømningshastighet på mobilfasen sørger for at GC-kolonnen ikke blir overbelastet dersom den er av typen kapillærkolonne (129).

50

Tidligere var pakkede kolonner mest vanlige i bruk, men nå er kapillære kolonner vanligst (10).

For analyser av lipider er det vanlig å bruke åpne, rørformede kapillærkolonner med belegg på rørveggene som stasjonærfase (20) (129). Kolonnelengde er rundt 25 meter med indre

diameter på 0,2-0,35 mm (20). Materialer i stasjonærfasen velges basert på prøven som skal analyseres. Det brukes polare stasjonærfaser for analyse av fettsyrer ettersom disse kan separere både på antall karbonatomer og grad av umetning (129). For analyse av fettsyrer er det vanlig å bruke polyetylenglykolpolymer som stasjonærfase med omtrent 0,2 mm tykkelse.

Separasjon på GC baseres på at forbindelsene har ulik affinitet for binding til stasjonærfasen på kolonneveggen. Forbindelser med høy affinitet for stasjonærfasen blir værende i kolonnen lenger, mens forbindelser med lavere affinitet elueres ut først. Denne forskjellen i affinitet resulterer i at ulike forbindelser elueres ut av kolonnen til ulike tider (20).

Temperaturprogrammering er vanlig å bruke ved GC-analyser. Programmet starter ved lav temperatur i GC-instrumentet, noe som eluerer ut de mest flyktige forbindelsene i

blandingen. Temperaturen økes deretter gradvis, for eksempel 5-10 °C/min.

Temperaturøkningen gjør at forbindelser elueres ut etter synkende flyktighet (129). På denne måten separeres forbindelsene i blandingen over et tidsintervall (20) (129). Et typisk

tidsintervall for en GC-analyse ligger mellom 20-60 minutter (129).

I enden av GC-instrumentet sitter en detektor som måler og kontrollerer tilstanden i

instrumentet samt logger og behandler data (130). Detektoren gir et signal som registreres på kromatogrammet (20) (129) (130). Et kromatogram gir oversikt over topper separert over tid.

Hver topp representerer ulike kjemiske forbindelser i prøven. Forbindelsene identifiseres fra plassering av toppen på tidslinjen. Innholdet av hver forbindelse i prøven gis fra arealet av den aktuelle toppen (20).

Flammeionisasjonsdetektor (FID) er den mest brukte detektoren for lipider. I denne detektoren forbrennes komponentene som elueres fra GC-kolonnen i en hydrogen/luft flamme for å danne ioner (20) (129) (130). Ionene går deretter mot en oppsamlingsplate og blir detektert (20).

Fettsyrer og etylestere elueres ut etter stigende antall karbonatomer i forbindelsen.

Forbindelser med samme antall karbonatomer elueres ut etter økende antall

51

dobbeltbindinger, som illustrert i Figur 3.8. Figuren viser at fettsyrer elueres ut etter økende antall karbonatomer i kjeden og økende antall dobbeltbindinger (129).

Figur 3.8: Kromatogram fra analyse av en fiskeolje. Figuren viser at forbindelser elueres etter økende antall karbonatomer i kjeden og deretter etter økende antall dobbeltbindinger. EPA og DHA er topp 14 og 18 (20).

En kjent fettsyre kan vanligvis identifiseres ved sammenlikning med en kjent prøve (intern standard) av denne fettsyren. Sammenlikning gjøres basert på retensjonstid, det vil si tiden forbindelsen bruker gjennom kolonnen. Et alternativ er å identifisere fettsyren basert på ekvivalent kjedelengde (ECL). En slik sammenlikning vil si at dersom en tenkt fettsyre har en ECL verdi på 19, vil den eluere mellom C18 og C20 fettsyrer og på samme tid som en annen fettsyre med 19 karbonatomer. Prinsippet for GC-analyse bygger på at sammenhengen mellom retensjonstiden og antall karbonatomer er lineær (10) (129).

Konsentrasjonen av EPA og DHA kan fremstilles i arealprosent (A%) eller vekt (mg/g eller vekt%). Når konsentrasjonen fremstilles i A% er det basert på det totale arealet av alle

detekterte fettsyretopper (20). Metoden som Pronova benytter for analyse av prøvene på GC bygger på den offisielle pharmacope metoden Ph. Eur. 2.4.29 (132).

52

Hjertet av prosessen hos Pronova er oppkonsentrering av EPA og DHA fra fiskeolje. Ureafelling er en av teknikkene som benyttes for oppkonsentrering. I denne delen av oppgaven

presenteres metoden som er brukt i laboratorieforsøk for å optimalisere ureafelling. Metoden er en intern batchprotokoll hos Pronova som har blitt fulgt i hvert forsøk. Parametere som ble undersøkt i forsøkene har blitt endret fra standard prosedyre.

I prosessen hos Pronova utnyttes det at flere fellingstrinn med urea gir ulike konsentrasjoner av EPA og DHA. Mot slutten av ureaprosessen oppnås høy EPA og DHA konsentrasjon.

Konsekvensen av høy konsentrasjon er tap av EPA og DHA til ureakomplekser i de siste

fellingstrinnene. Tapet skyldes at de fleste uønskede etylesterne (mettede og monoumettede) allerede har felt ut med urea i tidligere fellingstrinn. Ubundet urea i slutten av prosessen binder derfor til seg EPA og DHA i mangel på mettede og monoumettede etylestere.

Målet til Pronova er å endre prosessen slik at EPA og DHA som er bundet i ureakompleksene kan utnyttes. Den aktuelle endringen er å tilbakeføre disse høyverdige ureakompleksene til tidligere trinn i oppkonsentreringen som erstatning for ren urea. I tidligere trinn i

oppkonsentreringen vil det fortsatt være mye mettede og monoumettede etylestere. På denne måten kan EPA og DHA som har blitt bundet i ureakomplekser frigjøres og gjenvinnes.

Hypotesen for prosjektet er at også urea som har frigitt EPA og DHA vil danne nye komplekser med mettede og monoumettede etylestere. Et gjenbruk på denne måten har ikke vært

dokumentert tidligere.

Laboratorieforsøkene var den innledende delen av prosjektet for å se om direkte gjenbruk av ureakomplekser er mulig. Om forsøkene lykkes kan EPA og DHA utnyttes bedre og forbruket av ny urea vil reduseres som følge av gjenbruk. Totalt er det estimert at denne

prosessoptimaliseringen vil gi stor økonomisk gevinst.

I forsøkene med ureafelling er det brukt fiskeoljer i etylesterform med ulike konsentrasjoner av total EPA+DHA. Sammensetningen av oljene varierer med hvilket trinn i prosessen de er hentet fra. Det er gitt en oversikt over komposisjonen til oljene og ureakompleksene i et eget underkapittel. I de påfølgende kapitlene presenteres utstyr og den generelle metoden for ureafelling i laboratorieskala.

53 3.2.1 Utstyrsliste

3.2.1.1 Laboratorieutstyr

Utstyr Spesifikasjon Leverandør

Begerglass 150, 600, 1000, 800, 250, og 2000 mL

VWR

Reaktor Glass, 3 L med

strømningsbryter

Lenz

Kondensator 250 mm lengde Lenz

Trakt - VWR

Sinterfilter 13 cm og 20 cm diameter, Porestørrelse 2

Robu Glas og Schott Duran

Filterpapir 90 og 185 mm diameter,

blått

Whatman

Filtratkolbe 2000 og 5000 mL Pyrex

Rundkolbe 2000 og 500 mL Schott Duran

Skilletrakt 500 mL Schott Duran

Prøveglass 4 mL VWR

Pyrexglass 250 mL Pyrex

3.2.1.2 Instrumenter

Instrument Type Leverandør

Vekt XS32001L Delta Range Mettler Toledo

Røreverk 50-2000 rpm IKE-WERKE Eurostar

Vannbad med temperaturmåler F32-ME Julabo

Vakuumpumpe for kjølefelle RZ6 Vacuubrand

Kjølefelle CentriVap Cold Trap Labconco

Trykkmåler CVC 3000 Vacuubrand

Rotavapor Laborota 4000 Heidolph

Vakuumpumpe for rotavapor MZ 2C NT Vacuubrand

54 3.2.1.3 Kjemikalier

Kjemikalium Leverandør

Ammoniumnitrat, pro analyse Merck

Absolutt etanol, 1000 mL Kemetyl

Urea, industriell kvalitet Konfidensielt

Ureakomplekser Fra produksjon

Oljer Fra produksjon

Etanol (93-96 %) Fra produksjon

3.2.1.4 Urea, komplekser og oljer

Dette kapittelet gir en oversikt over de ulike råvarene som brukes i forsøkene. Råvarene inngår i den daglige, kommersielle produksjonen. Pronova har analysert innholdet av total EPA+DHA i disse produktene i forkant av forsøkene.

Urea kjøpes fra leverandør i form av pellets. I laboratorieforsøkene brukes det hvitt, ferdig oppmalt pulver som leveres fra produksjonen. I nåværende prosess er det kun denne typen urea som brukes. I prosjektet brukes ren urea i ett referanseforsøk.

Ureakomplekser 62 % er en sidefraksjon fra legemiddelproduksjonen. Oljen som er bundet i disse ureakompleksene inneholder rundt 62 % EPA+DHA. Denne fraksjonen er derfor en verdifull kilde for gjenbruk av ureakomplekser.

Ureakomplekser 70 % er en fraksjon fra legemiddelproduksjonen som inneholder olje med rundt 70 % EPA+DHA.

I alle ureakomplekser regner Pronova at 22% består av olje og 69 % består av urea.

55

45 % EE er et mellomprodukt av olje med reell verdi som brukes i produksjon av ulike

produkter. Denne fraksjonen brukes i forsøkene fordi det er mye av den i produksjonen. 45 % EE har rundt 45 % EPA+DHA.

RDFF er en forkortelse for re-destillert forfraksjon. Det er en fraksjon av olje fra molekylær destillasjon som har blitt destillert i så mange trinn at EPA og DHA nesten er destillert helt bort. RDFF inneholder omtrent 6 % EPA+DHA. Denne fraksjonen har minimal kommersiell verdi.

In document Produksjon av Omega-3 og virkning mot hjerte- og karsykdommer (sider 67-74)