Masteroppgave 2016 30 stp
Institutt for matematiske realfag og teknologi
Produksjon av Omega-3 og virkning mot hjerte- og karsykdommer
Production of Omega-3 and effect against cardiovascular diseases
Ida Kristine Nielsen
Maskin, prosess og produktutvikling
Produksjon av Omega-3 og virkning mot hjerte- og karsykdommer
Masteroppgave høsten 2016 av Ida Kristine Kirkeslett Nielsen
Sivilingeniørstudiet, retning maskin og prosess
I
Forord
Denne masteroppgaven på 30 studiepoeng er siste del av sivilingeniørstudiet i maskin og prosess på Norges Miljø og Biovitenskapelige Universitet (NMBU). Oppgaven er en del av et større prosjekt som har vært utført hos Pronova Biopharma i Sandefjord. Pronova oppkonsentrerer Omega-3 fra fiskeolje til både kosttilskudd og medisinen Omacor mot hjerte- og karsykdommer. Målet med prosjektet hos Pronova har vært å optimalisere produksjonen ved å gjenbruke et biprodukt i prosessen. Denne masteroppgaven tar for seg den innledende delen av prosjektet som var ulike laboratorieforsøk for å teste om det er mulig å gjenbruke biproduktet. For å forene interessen for prosess med min bakgrunn innen kjemi og bioteknologi samt ønske om å jobbe med legemiddelproduksjon, tar også oppgaven for seg en litteraturstudie i effekten av Omega-3 mot hjerte- og karsykdommer. Oppgaven har derfor vært en spennende og tverrfaglig studie i et stort og viktig felt.
Prosjektet har vært spesielt givende takket være min gode veileder Sverre Søndbo på process development avdelingen hos Pronova. Sverre har vært en veldig god diskusjonspartner som har lært meg masse og kommet med mange gode innspill. Prosjektet hadde heller ikke vært mulig uten Henrik Fismen, avdelingsleder på process development, som gav meg muligheten til å jobbe i prosjektet. Jeg har hatt mange fine dager sammen med Heidi Eskedal og Hege Sommerfelt på utviklingslaboratoriet og jeg er svært takknemlig for all hjelp underveis. Hele avdelingen fortjener en stor takk for at jeg ble tatt godt imot og hadde en veldig hyggelig tid hos Pronova.
Tusen takk til veilederen min Førsteamanuensis Odd-Ivar Lekang ved Universitetet for Miljø- og Biovitenskap. Jeg setter stor pris på rask respons, støtte, fleksibilitet og sterkt engasjement underveis!
Takk til Førsteamanuensis Volha Shapaval for korrekturlesning av oppgaven. Det blir vemodig å avslutte et kapittel som har vært en så stor del av hverdagen over så lang tid. Likevel ser jeg frem til å ta fatt på alle de nye mulighetene som dette prosjektet har gitt meg i legemiddelindustrien.
NMBU Ås, 12.12.2016
Ida Kristine Nielsen
II
Innhold
FORORD ... I FIGURLISTE ... V TABELLISTE ... VIII FORKORTELSER ... IX STIKKORDSREGISTER ... X SAMMENDRAG ... XIII ABSTRACT ... XV
1 INNLEDNING ... 1
2 DEL 1: LITTERATURSTUDIE, OMEGA-3 MOT HJERTE- OG KARSYKDOMMER ... 3
2.1 TEORI FOR LITTERATURSTUDIE ... 3
2.1.1 Fettsyrer ... 3
2.1.1.1 Nomenklatur for fettsyrer ... 6
2.1.2 Triglyserider ... 7
2.1.3 Transesterifisering ... 8
2.1.4 Omega-3 fettsyrene EPA og DHA ... 9
2.1.4.1 DHA ... 10
2.1.4.2 EPA ... 11
2.2 LITTERATURSTUDIE ... 12
2.2.1 Fisk som kilde for EPA og DHA ... 12
2.2.2 Etylester og andre former for EPA og DHA ... 14
2.2.3 Negative helseeffekter av ulike typer lipider ... 15
2.2.4 Positive helseeffekter av ulike typer lipider ... 17
2.2.5 Hjerte- og karsykdommer relatert til lipidinntak og Omega-3 ... 18
2.2.5.1 Oppsummerte systematiske oversikter over helserelatert forskning ... 23
2.2.6 Omacor ... 25
2.3 DISKUSJON AV LITTERATURSTUDIE ... 26
2.3.1 Fisk kontra oppkonsentrert EPA og DHA ... 26
2.3.2 Etylester kontra triglyserider ... 28
2.3.3 Planteoljer som kilde til EPA og DHA ... 29
2.3.4 Effekt av lipidinntak på friske mennesker og risikogrupper ... 29
2.3.5 Effekten av andre forbindelser enn EPA og DHA i fiskeolje ... 30
2.3.6 Balansen mellom Omega-3 og mettet- eller transfett ... 31
2.3.7 Systematiske oversikter over helserelatert forskning ... 31
III
2.3.8 Omega-3 som behandling mot andre sykdommer enn hjerte- og kar ... 33
2.4 KONKLUSJON FRA LITTERATURSTUDIE ... 34
2.5 VIDERE ARBEID FRA LITTERATURSTUDIE... 35
3 DEL 2: UREAFELLING FOR OPPKONSENTRERING AV EPA OG DHA... 36
3.1 TEORI FOR LABORATORIEFORSØK ... 36
3.1.1 Fiskeolje ... 36
3.1.2 Forbehandling av fiskeolje før ureafelling ... 38
3.1.2.1 Lutraffinering ved forsåpningsreaksjon ... 39
3.1.2.2 Stripping ... 40
3.1.2.3 Transesterifisering ... 42
3.1.2.4 Molekylær destillasjon ... 42
3.1.3 Urea ... 43
3.1.3.1 Mettede og umettede fettsyrers affinitet for ureakomplekser ... 44
3.1.4 Ureafelling ... 45
3.1.4.1 Alternative metoder til ureafelling ... 47
3.1.4.2 Fordeler og ulemper med ureafelling ... 48
3.1.5 Analyse av fettsyrer med gass kromatografi (GC) ... 48
3.2 METODE FOR LABORATORIEFORSØK ... 52
3.2.1 Utstyrsliste ... 53
3.2.1.1 Laboratorieutstyr... 53
3.2.1.2 Instrumenter ... 53
3.2.1.3 Kjemikalier ... 54
3.2.1.4 Urea, komplekser og oljer ... 54
3.2.2 Generell metode for ureafelling i laboratorieskala ... 55
3.2.2.1 Innmating av råvarer i reaktor ... 57
3.2.2.2 Filtrering av 1. ureakomplekser ... 60
3.2.2.3 Avdamping av etanol på rotavapor ... 62
3.2.2.4 Filtrering av 2. ureakomplekser ... 63
3.2.2.5 Vask av olje i skilletrakt ... 64
3.2.2.6 Tørking av olje på rotavapor ... 65
3.2.2.7 Oppløsning av ureakomplekser ... 66
3.2.2.8 Analyse av oljeprøver ved gasskromatografi (GC) ... 68
3.3 BESKRIVELSE AV LABORATORIEFORSØK ... 70
3.3.1 Vanlig ureafelling ... 72
3.3.2 Gjenbruk av ureakomplekser ... 73
3.3.3 Effekt av oppholdstid i reaktor ved gjenbruk av ureakomplekser ... 74
3.3.4 Effekt av innsatsforhold ved gjenbruk av ureakomplekser ... 75
3.4 RESULTAT FRA LABORATORIEFORSØK ... 76
3.4.1 Vanlig ureafelling ... 76
IV
3.4.2 Gjenbruk av ureakomplekser ... 77
3.4.3 Effekt av oppholdstid i reaktor ved gjenbruk av ureakomplekser ... 78
3.4.4 Effekt av innsatsforhold ved gjenbruk av ureakomplekser ... 79
3.4.5 Oljeutbytte og EPA+DHA gjenvinningsgrad ... 80
3.5 DISKUSJON AV LABORATORIEFORSØK ... 81
3.5.1 Vanlig ureafelling ... 82
3.5.2 Gjenbruk av ureakomplekser ... 82
3.5.3 Effekt av oppholdstid i reaktor ved gjenbruk av ureakomplekser ... 84
3.5.4 Effekt av innsatsforhold ved gjenbruk av ureakomplekser ... 86
3.5.5 Oljeutbytte ... 88
3.5.6 EPA+DHA gjenvinningsgrad ... 89
3.5.7 Dannelse av etylkarbamat i prosessen ... 91
3.6 KONKLUSJON FRA LABORATORIEFORSØK ... 91
3.7 VIDERE ARBEID MED LABORATORIEFORSØK... 92
4 REFERANSER ... 94
5 VEDLEGGSLISTE ... 109
V
Figurliste
Figur 2.1: Generell struktur av en mettet fettsyre. Figuren viser karboksylsyregruppen på den
ene enden av karbonkjeden og metylgruppen på den andre enden av karbonkjeden (6). ... 4
Figur 2.2: Figuren viser forskjell på strukturen i en karbonkjede med cis- og trans konfigurasjon. Cis er vist til venstre og har en bøyd struktur og trans er vist til høyre med en rettere struktur (12). ... 5
Figur 2.3: Ester er en funksjonell gruppe (15). ... 5
Figur 2.4: Struktur av linolsyre som er en 18:2 ω-6 fettsyre. Figuren illustrerer hvordan flerumettede fettsyrer navngis fra strukturen (16). ... 6
Figur 2.5: Matolje og margarin har ganske ulik form selv om begge er triglyserider. Forskjellen skyldes at fettsyrene som triglyseridene består av har ulik grad av metning (19). 7 Figur 2.6: Transesterifisering. Reaksjonen viser at triglyserid reagerer med alkohol og danner alkylester og glyserol (24). ... 8
Figur 2.7: Struktur av Docosahexaenoic acid, DHA (35). ... 10
Figur 2.8: Struktur av Eicosapentanoic acid, EPA (35). ... 11
Figur 2.9: Mange populære matvarer er kjent for høyt innhold av transfett (69). ... 16
Figur 2.10: Det finnes mange produkter av Omega-3 på markedet som lover bedre helse (76). ... 18
Figur 2.11: I vestlige land spises det for lite Omega-3, noe som mistenkes å bidra til flere tilfeller av hjerte- og karsykdommer i moderne tid (82). ... 20
Figur 2.12: Inntak av marine Omega-3 fettsyrer har positiv innvirkning på hjertets helse (89). ... 22
Figur 2.13: Pyramide som illustrerer kvalitet på ulike kilder for helserelatert forskning (93). 23 Figur 2.14: Legemiddelet Omacor med høykonsentrert EPA og DHA for behandling av høye triglyseridnivåer og forebygging av nye hjerteinfarkt (102). ... 25
Figur 3.1: Ansjos er en vanlig fisk å produsere fiskeolje fra (103). ... 37
Figur 3.2: Flytskjema for forbehandling av fiskeolje hos Pronova før ureafelling. ... 39
Figur 3.3: Forsåpningsreaksjon. En fettsyre reagerer med basen natriumhydroksid og danner vann og såpe. Såpe er natriumsalt av fettsyren (108). ... 40 Figur 3.4: Prinsippskisse av stripping basert på figur i Pronova sine patenter. Figuren
illustrerer at fiskeolje blandes med løsemiddel, blandingen blir deretter varmet og trykket
VI
senkes. Olje separeres fra kolesterol, miljøgift og løsemiddel på grunn av forskjell i
kokepunkt (112) (113). ... 41
Figur 3.5: Urea brukes til mange formål i industrien og norske Yara er et eksempel på en produsent av urea (121). ... 43
Figur 3.6: Ureakompleks med gjestemolekyl i lilla farge (124). ... 44
Figur 3.7: Prinsippskisse av et GC-instrument (131). ... 49
Figur 3.8: Kromatogram fra analyse av en fiskeolje. Figuren viser at forbindelser elueres etter økende antall karbonatomer i kjeden og deretter etter økende antall dobbeltbindinger. EPA og DHA er topp 14 og 18 (20). ... 51
Figur 3.9: Flytskjema som viser rekkefølgen på prosedyren brukt i laboratorieforsøkene. Skjemaet illustrerer at det kommer ulike fraksjoner fra de ulike trinnene samt at videre behandling av ureakomplekser har variert i forsøkene. ... 56
Figur 3.10: Råvarer som innmates i reaktor. Råvarene er hentet ut fra fullskalaprosessen. .. 58
Figur 3.11: Etanol og urea/ureakomplekser er innmatet i reaktor og står med refluks og røring. ... 59
Figur 3.12: Reaktor med etanol, urea/ureakomplekser og olje. ... 60
Figur 3.13: Filtrering under vakuum av blandingen fra reaktor bestående av etanol, urea/ureakomplekser og olje. Urea/ureakomplekser blir liggende på filteret som en filterkake og etanol og olje går i filtratkolben. ... 61
Figur 3.14: Etanol i filtratet dampes av på rotavapor. ... 62
Figur 3.15: Filtrering av 2. ureakomplekser etter etanol er avdampet på rotavapor. ... 63
Figur 3.16: Vask av olje med kokende vann i skilletrakt. ... 65
Figur 3.17: Vasket olje tørkes på rotavapor. ... 66
Figur 3.18: Oppløsning av ureakomplekser. Kokende vann og ammoniumnitrat blandes med ureakomplekser og oppvarmes på kokeplate. ... 67
Figur 3.19: Eksempel på kromatogram fra analyse av forsøk 8. Kromatogrammet viser at retensjonstid i kolonnen henger sammen med størrelsen på molekylene. Denne sammenhengen benyttes til å identifisere de ulike molekylene og hvilken A% de utgjør av prøven. ... 69
Figur 3.20: Eksempel på resultattabell fra forsøk 8. Tabellen viser Areal% for de ulike forbindelsene i prøven, inkludert C23 som brukes som intern standard. ... 70
VII
Figur 3.21: Grafen illustrerer at sammenhengen mellom oljeutbytte og EPA+DHA
gjenvinningsgrad er tilnærmet lineær i forsøk med gjenbruk av ureakomplekser. ... 81
VIII
Tabelliste
Tabell 1: Oversikt over forsøk i prosjektet med tilhørende nummer. ... 71 Tabell 2: Råvarer og parametere for forsøk nummer 1, Vanlig ureafelling. ... 72 Tabell 3: Råvarer og parametere for forsøk 2, Gjenbruk av ureakomplekser. ... 73 Tabell 4: Råvarer og parametere for forsøk 3,4 og 5, Effekt av oppholdstid i reaktor ved gjenbruk av ureakomplekser. ... 74 Tabell 5: Råvarer og parametere for forsøk 6, 7 og 8, Effekt av innsatsforhold ved gjenbruk av ureakomplekser. ... 76 Tabell 6: Resultater fra forsøk 1, Vanlig ureafelling. ... 77 Tabell 7: Resultater fra forsøk 2, Gjenbruk av ureakomplekser og sammenlikning av forsøk 1 og 2. ... 77 Tabell 8: Resultater fra forsøk 3,4 og 5; Effekt av oppholdstid i reaktor ved gjenbruk av ureakomplekser. ... 78 Tabell 9: A% EPA+DHA bundet i 1. og 2. ureakomplekser i forsøk 5. ... 78 Tabell 10: Resultater fra forsøk 6, 7 og 8; Effekt av innsatsforhold ved gjenbruk av
ureakomplekser. ... 79 Tabell 11: A% EPA+DHA som var bundet i 1. og 2. ureakomplekser i forsøk 6. ... 79 Tabell 12: Masse av inngående olje, utgående olje, beregnede oljeutbytter og
gjenvinningsgrader i alle forsøk. ... 80
IX
Forkortelser
ACC Acetyl-CoA carboksylase ALA Alfa linolensyre
DHA Docosahexaenoic acid DPA Docosapentaenoic acid ECL Equivalent chain length EPA Eicosapentanoic acid
EPA Environmental protection agency FAME Fatty acid methyl ester
FDA Food and drug administration FID Flammeionisasjonsdetektor GC Gas chromatography
GISSI Gruppo italiano per lo studio della sopravvivenza nell'Infarto miocardico GMP Good manufacturing practice
HDL High density lipoprotein
IUPAC International union of pure and applied chemistry KOH Kaliumhydroksid
LA Linolsyre
LDL Low density lipoprotein NaOH Natriumhydroksid
NMBU Norges miljø og biovitenskapelige universitet
Nofima Norsk institutt for akvakultur, fiskeri og matforskning RDFF Re-destillert forfraksjon
rpm Rotasjoner per minutt
X
Stikkordsregister
Alfa Linolensyre Omega-3 fettsyre (18:3)
Arealprosent A% Enhet som angir andel av en forbindelse i en prøve analysert med GC Batchprotokoll Standard prosedyre for gjennomføring av laboratoriearbeid
Cis Dobbeltbinding der hydrogenatomene ved bindingen er på samme side av karbonkjeden
Cochraneoversikt Rapport publisert i databasen Cochrane fra omfattende gjennomgang av forskning på et tema
Cochranestudie Omfattende gjennomgang av forskning på et tema som resulterer i en Cochraneoversikt
Eicosanoider Signalmolekyler Eksoterm Avgir varme
Epanova Omega-3 legemiddel av frie fettsyrer
Etylester Kjemisk forbindelse i gruppen ester med etyl C2H6 bundet til seg Etylkarbamat Mulig kreftfremkallende kjemisk forbindelse
Fettsyre Kjemisk forbindelse med R-COOH som generell formel Fiskeolje Olje fremstilt fra presset fisk
Fiskeoljekonsentrat Fiskeolje som er behandlet for å få et høyere innhold av Omega-3 enn fiskeolje
Flerumettet Kjemisk forbindelse med kjede av karbon og dobbeltbindinger mellom flere av karbonatomene
Forsåpningsreaksjon Kjemisk reaksjon der fettsyre/ester reagerer med en base og danner såpe og vann
Fullskalaprosessen Prosessanlegget hos Pronova med kommersiell produksjon i motsetning til prosessen i laboratorieskala
Gjenvinningsgrad Hvor stor andel av noe som går inn i en produksjonsprosess som kommer ut
XI Glyserol Kjemisk forbindelse C3H5(OH)3
Heksagonal Sekskantet
Karboksylsyre Organisk forbindelse som inneholder gruppen COOH Kromatogram Grafisk fremstilling av resultater fra en GC-analyse Linolsyre Omega-6 fettsyre (18:2)
Lipid Fellesbetegnelse for upolare, organiske forbindelser, herunder fett og oljer
Lipoprotein Kompleks av lipid og protein som frakter lipider i blodet
Lutraffinering Kjemisk renseprosess ved bruk av lut som renser ut frie fettsyrer fra fiskeolje
Mettet organisk forbindelse
Kjemisk forbindelse med bare enkeltbindinger mellom karbonatomene
Metyl Kjemisk forbindelse, CH3
Mobilfase En inert gass som strømmer gjennom kolonnen i et GC-instrument Molekylær
destillasjon
Teknikk som brukes for oppkonsentrering av fettsyrer fra fiskeolje Nomenklatur Systematisk ordning av navn i fagbetegnelser
Olje Lipid som er flytende ved romtemperatur
Oljeutbytte % andel av olje som går ut av en produksjonsprosess av olje som gikk inn
Omacor Legemiddel av Omega-3 på etylesterform mot hjerte- og karsykdommer
Rotavapor Laboratorieinstrument som fjerner løsemiddel i en væske under vakuum
Skilletrakt Laboratorieutstyr som brukes til å skille ulike faser i en væske Stripping Destillasjonsprosess som renser ut uønskede forbindelser Tetragonal Syvkantet
XII
Trans Dobbeltbinding der hydrogenatomene ved bindingen er på hver sin side av karbonkjeden
Transesterifisering Kjemisk reaksjon mellom et triglyserid og alkohol som danner glyserol og ester ved hjelp av en katalysator
Triglyserid Kjemisk forbindelse i gruppen lipider som består av glyserol tilknyttet tre fettsyrer
Tromboksan Lipid som bidrar til økt blodtrykk Umettet organisk
forbindelse
Forbindelse med dobbeltbinding ved minst ett karbonatom Urea Kjemisk forbindelse, H2NCONH2
Ureafelling Prosess for oppkonsentrering av flerumettede fettsyrer ved bruk av urea
Ureakomplekser Urea med gjestemolekyler bundet i ureakrystallene
XIII
Sammendrag
Temaet for masteroppgaven er produksjon av Omega-3 fettsyrene EPA og DHA for behandling av hjerte- og karsykdommer. Oppgaven omhandler to deler; en litteraturstudie av de
flerumettede Omega-3 fettsyrene EPA og DHA sin effekt på hjerte- og karsykdommer og et prosjekt om oppkonsentrering av EPA og DHA ved ureafelling i samarbeid med Pronova Biopharma.
Litteraturstudien tar for seg de helsemessige effektene av ulike lipider for deretter å fokusere på effekten av EPA og DHA mot hjerte- og karsykdommer. Studien hadde som mål å avdekke hvordan EPA og DHA virker på kroppen og hvilke mekanismer som gir denne effekten. Kort oppsummert er svaret på denne problemstillingen for kompleks til å dekkes fullstendig i et masterprosjekt. Hovedgrunnen til at dette temaet er komplisert er at EPA og DHA trolig har ulik rolle og effekt i ulike celler i kroppen samt i ulike hjerte- og karsykdommer. Det er derfor vanskelig å finne et entydig svar på et detaljert nivå. En annen grunn som kompliserer slike studier er at det er vanskelig å studere effekten av EPA og DHA på kroppen isolert. Det skyldes at spor av EPA og DHA blir værende i kroppen over lang tid og at det samtidig er mange andre faktorer som påvirker kroppen.
Hovedkonklusjonen fra litteraturstudien i denne oppgaven er at effekten som oppnås fra EPA og DHA er avhengig av livsstil og generelt kosthold. Spesielt er det mye som tyder på at balansen mellom EPA og DHA og andre lipidtyper er avgjørende for effekten av EPA og DHA samt risiko for hjerte- og karsykdommer.
Den praktiske delen av oppgaven er laboratorieforsøk for optimalisering av
ureafellingsprosessen hos Pronova. Oppgaven er utført som en del av et internt prosjekt i bedriften. Prosjektets mål er å undersøke om et biprodukt fra ureafellingen kan gjenbrukes som en ressurs i prosessen.
Ureafelling utføres i flere trinn. I hvert trinn binder urea seg til mettede og monoumettede fettsyrer i fiskeolje og danner ureakomplekser. Ureakompleksene blir deretter filtrert bort og resultatet blir en olje med mindre uønskede fettsyrer og høyere konsentrasjon av EPA og DHA. I de siste trinnene i ureafellingen tapes noe EPA og DHA som blir bundet i
XIV
ureakompleksene. Tap av EPA og DHA i ureakomplekser skyldes at færre mettede og
monoumettede fettsyrer er tilgjengelig for binding på dette stadiet i prosessen. Urea vil derfor binde til seg umettede fettsyrer i de siste produksjonstrinnene i mangel på andre alternativer.
Laboratorieforsøkene skulle gi svar på om disse ureakompleksene kan gjenbrukes i prosessen for å få bedre utnyttelse av EPA og DHA samt urea. Videre var målet med forsøkene å få et inntrykk av hvilke prosessparametere som påvirker prosessen og kan optimaliseres i neste prosjektfase. Prosessparametere varieres i forsøkene og prøvene analyseres ved
gasskromatografi (GC). Arealprosent (A%) av EPA og DHA i GC kromatogrammene fra de analyserte prøvene brukes til å vurdere effekten av varierte parametere.
Laboratorieforsøkene konkluderer med at gjenbruk av ureakomplekser er effektivt
sammenliknet med vanlig ureafelling. Det beste sammenliknbare resultatet som ble oppnådd var en relativ prosent økning på 5 % A% EPA og DHA ved gjenbruk av ureakomplekser.
Oppholdstid i reaktor og forhold mellom inngående ureakomplekser og olje var parametere som indikerte påvirkning av prosessen. Optimal oppholdstid i reaktor forventes å ligge mellom 2-3 timer. Disse parameterne vil optimaliseres i videre faser av prosjektet hos Pronova.
XV
Abstract
The topic of the master thesis is production of the Omega-3 fatty acids EPA and DHA for treatment of cardiovascular disease. The thesis is organized in two parts; a literature study of the polyunsaturated Omega-3 fatty acids EPA and DHA's effect on cardiovascular disease, and an experimental part related to the optimization of the concentration process for EPA and DHA by using urea complexation. The experimental part of the thesis was performed in strong collaboration with Pronova Biopharma.
The literature study presents the evaluation of the health effect of various lipids and more specifically focuses on the effect of EPA and DHA for treatment of cardiovascular diseases. The objective of the study was to evaluate how EPA and DHA affects the body and the
mechanisms that provide this effect. In summary, the answer to this question is too complex to be completely covered in a master project. The main reason for complexity is that EPA and DHA probably have different roles and effects in various cells in the body as well as in various cardiovascular diseases. Therefore, it has been difficult to find a clear conclusion. Another reason that complicates such studies is that it is difficult to study the effects of EPA and DHA in the body isolated. This is because traces of EPA and DHA remain in the body for a long time and that simultaneously many other factors are affecting the body.
The main conclusion from the literature study in this thesis is that the effect obtained from EPA and DHA is dependent on lifestyle and overall diet. Specifically, there are indications that the balance between EPA and DHA and other fats are essential for the effect of EPA and DHA.
In addition, this balance probably affects the risk of cardiovascular disease.
The experimental part of this master thesis is laboratory experiments for optimization of the urea complexation process at Pronova. The work is performed as part of an internal project in the company. The project aims to investigate if the current urea complex waste can be reused as a resource in the process.
Urea complexation is performed in several steps. In each step urea binds to saturated and monounsaturated fatty acids in fish oil and form urea complexes. The urea complexes are then filtered out, providing an oil with less unwanted fatty acids and higher concentration of
XVI
EPA and DHA. In the final steps of the urea complexation, there is some loss of EPA and DHA that are bound in urea complexes. This loss of EPA and DHA to urea complexes is because less saturated and monounsaturated fatty acids are available for complexation at this stage.
The experimental work was focused on investigating if these EPA and DHA containing urea complexes can be reused in the urea complexing process, to obtain better utilization of EPA, DHA and urea. Another objective of the experimental work was to get an idea of which process parameters that affects the process when reusing urea complexes. These parameters will be optimized in the next project phase by Pronova. Process parameters were varied in the experiments and samples were analyzed by gas chromatography (GC). Area percent (A%) of EPA and DHA in the GC chromatograms of the analyzed samples were used to evaluate the effect of varied parameters.
Based on the obtained results from the experimental work, the conclusion was that reuse of urea complexes are effective compared with conventional urea complexation. The best comparable result obtained was 5% relative percent increase of A% EPA and DHA by reusing urea complexes. The reactor time and ratio of incoming urea complexes and oil were
parameters that influenced the process. Optimal reactor time is expected to be between 2-3 hours. These parameters will be optimized in further phases of the project by Pronova.
1
1 Innledning
Viktigheten av marine oljer i menneskers kosthold for forebygging av sykdom ble vitenskapelig anerkjent for omtrent 40 år siden. Da foreslo danskene Dyerberg og Bang en teori om at den lave forekomsten av hjertesykdom blant eskimoene på Grønland var relatert til det særegne kostholdet. Det som kjennetegner eskimoenes kosthold er marine lipider, også kjent som fiskeolje, med rikelig innhold av flerumettede fettsyrer. Når det er snakk om flerumettede fettsyrer med marint opphav menes spesielt Omega-3 fettsyrene EPA og DHA. Den danske oppdagelsen har ført til stor interesse for sammenhengen mellom Omega-3 og hjerte- og karsykdommer.
Utbredelsen av hjerte- og karsykdommer i verden har gitt et stort marked for kosttilskudd, medisin og andre matvarer med høyt innhold av Omega-3 fettsyrene EPA og DHA. EPA og DHA i fiskeoljer kan oppkonsentreres ved å fjerne mettede- og monoumettede fettsyrer i oljen. En slik behandling gir fiskeoljekonsentrat med høyere konsentrasjon av de flerumettede
fettsyrene EPA og DHA. Pronova Biopharma i Sandefjord har spesialisert seg på oppkonsentrering av flerumettede fettsyrer fra fiskeoljer som brukes i kosttilskudd og
legemiddelet Omacor. En del av deres prosess for oppkonsentrering er ureafelling. Ureafelling benytter egenskaper til det naturlige stoffet urea. Når urea blandes med en fiskeolje, vil urea selektivt binde seg til mettede og monoumettede fettsyrer i oljen. Ved en slik binding blir de aktuelle fettsyrene kapslet inn i en «tunnel» bestående av ureamolekyler. Urea med fettsyre bundet inni tunnelen kalles et ureakompleks. Ureakomplekser kan skilles fra resten av fiskeoljekonsentratet ved filtrering eller sentrifugering. En slik separasjon resulterer i et fiskeoljekonsentrat med lavere innhold av mettede og monoumettede fettsyrer, noe som følgelig gir en høyere konsentrasjon av de umettede fettsyrene EPA og DHA.
Ureafelling kan gjentas i mange trinn. I neste trinn vil oljen som akkurat har blitt separert fra ureakompleksene tilsettes ny urea. Da dannes nye ureakomplekser som igjen separeres fra oljen. For hvert trinn vil stadig flere av de mettede og monoumettede fettsyrene separeres bort og det oppnås en høy konsentrasjon av EPA og DHA. I mangel på mettede og
monoumettede fettsyrer vil urea danne ureakomplekser med EPA og DHA i de siste trinnene i oppkonsentreringen. Konsekvensen blir at det tapes EPA og DHA fra oljen til ureakomplekser mot slutten av ureafellingen.
2
Del 2 av denne oppgaven er et optimaliseringsprosjekt hos Pronova der det ble undersøkt om EPA og DHA kan gjenvinnes fra ureakomplekser. Delen av prosjektet som omtales i denne oppgaven er den innledende fasen av laboratorieforsøkene. Laboratorieforsøkene hadde som mål å undersøke om gjenbruk av ureakomplekser er mulig samt å grovt skissere hvilke
parametere som bør optimaliseres i videre detaljfase. Forsøkenes oppsett, gjennomføring og parametere var bestemt av prosjektmedlemmer hos Pronova i forkant. Den praktiske delen av denne oppgaven bestod av å utføre forsøkene på prosesslaboratoriet hos Pronova etter interne standard batchprotokoller for ureafelling.
GC-analyse av ferdige prøver av fiskeoljekonsentrat utføres av et analyselaboratorie hos Pronova etter standard metode. Analysene har derfor ikke vært en del av det praktiske arbeidet for denne oppgaven. Det er likevel inkludert teori og metode for analysen for å gi oppgaven helhet.
Det finnes ulike metoder for oppkonsentrering av EPA og DHA fra fiskeolje foruten ureafelling.
Vurdering av andre metoder er ikke tillagt særlig vekt i denne oppgaven. Ureafelling kan utføres med litt ulike metoder som er tilpasset den enkelte prosess og applikasjon. Av denne grunnen er det valgt å fokusere på det som er relevant for prosessen hos Pronova og det som prosjektet omhandler. Det vil derfor finnes artikler og andre kilder om ureafelling som ikke er direkte relevante. For å gi leseren en rød tråd fra fisk til fiskeoljekonsentrat av EPA og DHA ved ureafelling, er det inkludert en liten innføring i produksjon av fiskeoljer samt forbehandling av denne før ureafelling hos Pronova. Disse delene av prosessen har ikke vært en del av
prosjektet og er kun ment som enkel tilleggsinformasjon. Oppgaven omhandler ikke videre behandling av fiskeoljekonsentrater etter ureafelling.
For å sette oppkonsentrering av EPA og DHA ved ureafelling inn i et større bilde er det gjort en litteraturstudie i effekten av EPA og DHA på hjerte- og karsykdommer i del 1 av oppgaven.
Oppgaven kan derfor anses som todelt med en teoretisk del og en praktisk del med laboratorieforsøk. Målet med denne tverrfaglige bredden er å dekke både interessen for prosessteknikk og biokjemi i legemidler og øke forståelsen av produksjon i
legemiddelbransjen.
3
2 Del 1: Litteraturstudie, Omega-3 mot hjerte- og karsykdommer
De neste underkapitlene har som mål å gi leseren innføring i de grunnleggende kjemiske begrepene som brukes videre gjennom oppgaven. Det første underkapittelet om fettsyrer forklarer hva fettsyrer og estere er, deres struktur og ulike undergrupper. Videre gis det en orientering i hvordan fettsyrer navngis.
Det neste underkapittelet forklarer hva triglyserider er og hvordan deres struktur påvirker hvilken form de har i romtemperatur. Underkapittelet tar også for seg hvordan et triglyserid omdannes til en ester gjennom transesterifisering.
Deretter er det et underkapittel om Omega-3 fettsyrene EPA og DHA som er sentrale i denne oppgaven. Kapittelet gir en oversikt over deres struktur og rolle.
All informasjon som er gitt i disse underkapitlene er hentet fra kilder, ikke kun konkrete
påstander. Derfor tilhører all informasjon som står i forkant av en kildehenvisning den aktuelle kilden som det henvises til.
2.1.1 Fettsyrer
Fettsyrer består av en kjede av karbonatomer med en metylgruppe på den ene enden og en karboksylsyregruppe på den andre enden, slik Figur 2.1 illustrerer (1) (2) (3). En generell formel for fettsyrer er R-COOH der R er karbonkjeden med metylgruppen og COOH
representerer karboksylsyredelen (1). Karbonatomene er bundet sammen av enten enkelt- eller dobbeltbindinger som vil si at de er henholdsvis mettet eller umettet (3) (4) (5).
Umettede fettsyrer kan være enten monoumettede, som vil si at de kun har en
dobbeltbinding eller flerumettede som vil si at de har to eller flere dobbeltbindinger (1) (3) (5). Karbonkjeden kan ha ulik lengde (1). Kjedelengden kan variere fra C2 til C80, men C4-C24 er mest vanlig (1) (5).
4
Figur 2.1: Generell struktur av en mettet fettsyre. Figuren viser karboksylsyregruppen på den ene enden av karbonkjeden og metylgruppen på den andre enden av karbonkjeden (6).
De fleste fettsyrer har rett karbonkjede og partalls antall karbonatomer (1) (2) (4) (5).
Fettsyrer med oddetalls antall karbonatomer eller som har forgreininger eller syklisk struktur finnes, men er ikke vanlige (1) (5).
De fleste naturlige, umettede fettsyrene har cis konfigurasjon ved dobbeltbindingene (1) (2) (3) (7) (8). Cis betyr at karbonkjedene på hver side av dobbeltbindingene er bøyd mot
hverandre og hydrogenatomene ved dobbeltbindingene er på samme side av karbonkjeden, slik Figur 2.2 illustrerer (1) (2) (3) (9). Hvis ingen annen tilleggsinformasjon er gitt, kan det antas at en umettet fettsyre har cis konfigurasjon (5) (10) (11).
Trans fettsyrer er umettede fettsyrer med minst en dobbeltbinding som har trans
konfigurasjon i karbonkjeden (3) (8) (9). Trans konfigurasjon vil si at hydrogenatomene er på motsatt side av karbonkjeden slik Figur 2.2 viser (3) (9). Dobbeltbindinger med trans
konfigurasjon gir en rettere og mer stabil karbonkjede enn cis konfigurasjon (9).
5
Figur 2.2: Figuren viser forskjell på strukturen i en karbonkjede med cis- og trans konfigurasjon. Cis er vist til venstre og har en bøyd struktur og trans er vist til høyre med en rettere struktur (12).
Ester er en funksjonell gruppe, i likhet med karboksylsyre, og er vist i Figur 2.3.
Hovedforskjellen mellom en karboksylsyre og en ester er at hydrogenet i karboksylsyren erstattes med en ny komponent «R» som kan variere (13). Dersom «R» i strukturen er etyl (C2H6) er forbindelsen etylester (14). Begrepet fettsyre brukes også om estere i fagmiljøer ettersom de er så nært beslektet (13). Fettsyre som navn vil derfor noen ganger også brukes om oljer som teknisk sett kan være estere i denne oppgaven.
Figur 2.3: Ester er en funksjonell gruppe (15).
6 2.1.1.1 Nomenklatur for fettsyrer
IUPAC-systemet for nomenklatur (et internasjonalt system for navngivning av kjemiske forbindelser), navngir fettsyrer ved å starte på karbonatomet for karboksylgruppen som nummer en, og fortsette videre mot metylgruppen på enden (1). Ofte brukes et enklere system som tar utgangspunkt i antall karbonatomer og grad av umetning i karbonkjeden. For eksempel vil 18:2 bety 18 karbonatomer og 2 dobbeltbindinger i det forenklede systemet (1) (10) (11).
Det er et eget navnesystem for flerumettede fettsyrer som hører til under Omega (ω)
fettsyrene (1). Omega fettsyrene har minst to dobbeltbindinger i karbonkjeden og navngis ved antall karbonatomer fra nærmeste dobbeltbinding og enden som har metylgruppen (1) (2) (5) (7) (9). Eksempler på Omega fettsyrer er ω-3 og ω-6. Linolsyre som er vist i Figur 2.4 kan skrives som 18:2 ω-6. 18:2 ω-6 indikerer at den nærmeste dobbeltbindingen fra enden med metylgruppe er på karbonatom nummer 6 (11).
Figur 2.4: Struktur av linolsyre som er en 18:2 ω-6 fettsyre. Figuren illustrerer hvordan flerumettede fettsyrer navngis fra strukturen (16).
I mange tilfeller skrives n istedenfor ω ved navngivning av Omegafettsyrene, men betydningen er den samme (5). Flerumettede fettsyrer har vanligvis dobbeltbindinger i kjeden som er adskilt med en CH2 gruppe mellom, som vist i Figur 2.4 (10).
7 2.1.2 Triglyserider
Fett og oljer hører inn under gruppen lipider (17). Lipider er naturlige molekyler som ikke er vannløselige (2) (18). Selv om fett er fast stoff og olje er flytende har de den samme
grunnleggende organiske strukturen og kalles triglyserider (17) (18). Triglyserider består av en gruppe med glyserol tilknyttet tre fettsyrer (1) (2) (4) (18). Fettsyrene i vanlige triglyserider er lange og rette med omtrent 12-20 karbonatomer i kjeden (4).
I fettreserver i kroppen foreligger vanligvis lipidene som triglyserider. Triglyserider er vanligvis satt sammen av ulike fettsyrer (2) (4) (5) (18). De fysiske egenskapene til triglyserider
avhenger av fettsyrene de inneholder, som illustrert i Figur 2.5 (2) (5).
Hvis fettsyrene har høy grad av metning vil triglyseridet pakkes sammen og være i fast form i romtemperatur, dette gjelder for eksempel margarin. Ved høy grad av umetning i fettsyrene (som vanligvis har cis konfigurasjon) kan ikke lenger molekylene pakkes like tett sammen.
Resultatet blir en løsere struktur og lavere smeltepunkt. Er det høy grad av umetning vil triglyseridet være i flytende form i romtemperatur, som i oljer (2) (4) (5) (17) (18).
Figur 2.5: Matolje og margarin har ganske ulik form selv om begge er triglyserider. Forskjellen skyldes at fettsyrene som triglyseridene består av har ulik grad av metning (19).
8 2.1.3 Transesterifisering
Transesterifisering er en reaksjon mellom et triglyserid og alkohol som danner glyserol og ester ved hjelp av en katalysator, som vist i Figur 2.6 (4) (20) (21) (22). Det er vanligst å bruke metanol eller etanol som alkohol i denne reaksjonen (22). Dersom metanol brukes blir produktet metylestere (Fatty acid methyl ester, forkortet FAME) av de tre individuelle
fettsyrene i triglyseridet, som noen vil kalle biodiesel (4). Det er mulig å katalysere reaksjonen med syre eller enzymer, men base er mest effektivt. NaOH og Kaliumhydroksid (KOH) er vanlige basekatalysatorer å bruke i stor skala ettersom de er billige (23). Alkyl er en vanlig samlebetegnelse innen organisk kjemi der grunnleggende forbindelser av hydrokarboner med ulikt antall karbonatomer inngår, eksempelvis metyl og etyl.
Figur 2.6: Transesterifisering. Reaksjonen viser at triglyserid reagerer med alkohol og danner alkylester og glyserol (24).
En nylig publisert artikkel viser til at transesterifisering også kan gjøres ved å bruke enzymer (25). Teknikken med enzymer er ikke studert i prosjektet.
9 2.1.4 Omega-3 fettsyrene EPA og DHA
Omega-3 betyr fettsyre med første dobbeltbinding etter tredje karbonatom, som tidligere forklart (2) (7). Kjedelengden til Omega-3 fettsyrer består av 18-22 karbonatomer (7). Pattedyr mangler enzymet som lager dobbeltbindinger før niende karbonatom (2) (26). Fettsyrer med dobbeltbinding før niende karbonatom (ω-3 og ω-6), og som er essensielle for kroppen, må av denne grunnen tilføres gjennom kosten (2) (8). Eicosapentanoic acid (EPA) og
Docosahexaenoic acid (DHA) er eksempler på essensielle fettsyrer (27). Andre Omegafettsyrer som eksempelvis Omega-9 kan kroppen lage selv og disse fettsyrene er derfor ikke essensielle (28) (29). De ikke-essensielle Omegafettsyrene har ikke blitt vurdert i denne oppgaven.
Produkter fra havet er de eneste som inneholder både EPA og DHA i store mengder (9) (27).
Det skyldes at EPA og DHA lages av alger som videre er næring for fisk (8) (30) (31) (32).
Algene lager også små mengder av docosapentaenoic acid (DPA) som er en annen Omega-3 fettsyre (22:5ω-3) (33).
Alfa linolensyre (ALA) 18:3 ω-3, som finnes i valnøtter, soyabønner, raps og linfrøolje, kan omdannes til små mengder EPA og DHA i metabolismen (8) (9) (10). I friske individer
omdannes henholdsvis 5-10 % og 2-5 % av ALA til EPA og DHA (9). Til mennesker brukes EPA og DHA både i mat, kosttilskudd og legemidler (27).
10 2.1.4.1 DHA
DHA er en Omega-3 flerumettet fettsyre med 22 karbonatomer og seks dobbeltbindinger med strukturformel CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2COOH, vist i Figur 2.7 (5) (34).
Figur 2.7: Struktur av Docosahexaenoic acid, DHA (35).
DHA har spesielt innvirkning på nervesystemet og er nødvendig for optimalt syn og kognitiv utvikling. Fettsyren kan omdannes fra ALA ved hjelp av to enzymer og to steg med
kjedeforlengelse eller den kan tas opp i kroppen direkte som DHA. I menneskekroppen er det målt spesielt stor konsentrasjon av DHA i netthinnen i øyet som tyder på at DHA har en sentral rolle i synet (36). I hjernen er det mye høyere konsentrasjon av flerumettede fettsyrer enn i de fleste andre vev i kroppen og dette er spesielt DHA (37).
11 2.1.4.2 EPA
EPA er en Omega-3 flerumettet fettsyre med 20 karbonatomer og fem dobbeltbindinger med strukturformel CH3CH2(CH=CHCH2)5(CH2)2COOH (5) (10) (34). Dobbeltbindingene sitter ved karbonatom 5, 8, 11, 14 og 17, som vist i Figur 2.8 (10).
Figur 2.8: Struktur av Eicosapentanoic acid, EPA (35).
EPA bidrar til å redusere risiko for enkelte former for hjertesykdommer (2). Fettsyrens
viktigste rolle er å være utgangsmateriale for produksjon av hormoner, kalt eicosanoider (31).
Eicosanoider forklares i kapittel 2.2.4.
12
Litteraturstudien av Omega-3 mot hjerte- og karsykdommer har som mål å belyse behovet for Omega-3 industrien, øke forståelsen av Omega-3 produktene som produseres og få et svar på hvorfor Omega-3 har effekt mot hjerte- og karsykdommer.
Det første underkapittelet trekker frem noen sider av å betrakte kun ren fisk som kilde for Omega-3 istedenfor å ta Omega-3 tilskudd.
Det neste underkapittelet belyser etylester og andre former for EPA og DHA. Her utdypes forskjellene mellom etylester og andre former med hovedfokus på effekt i kroppen. Omega-3 i form av fosfolipider (krillolje) vurderes ikke i denne oppgaven.
I videre underkapitler presenteres negative helseeffekter ved enkelte lipidtyper, generelle positive effekter av noen typer lipider og de konkrete effektene på hjerte- og karsykdommer fra ulike typer lipid og Omega-3. Litteraturstudien avsluttes med et eget underkapittel om Omacor, Pronova sitt legemiddel mot hjerte og karsykdommer basert på høykonsentrert EPA og DHA.
2.2.1 Fisk som kilde for EPA og DHA
Ulike fagpersoner har uttalt i medier de siste årene at fiskemiddag dekker behovet for EPA og DHA og at kosttilskudd med Omega-3 derfor kan være overflødig (38) (39). Norge ligger ganske høyt opp på verdensstatistikken når det gjelder konsumert fisk, 51 kg i gjennomsnitt per person årlig (40). Av fisk man kan spise direkte er det tunfisk, laks, ørret, sardin og sverdfisk som har høyest innhold av EPA og DHA (33).
Innholdet av lipider i vanlige fiskearter varierer veldig, eksempelvis geografi og årstid spiller en viktig rolle (40) (41). En studie påpeker at innhold av lipider i den spiselige delen av fisken kan variere mellom 1% - 20%. I atlantisk sild kan lipidinnholdet være 20 % i desember og 3,2 % i april. I sild fra Stillehavet kan lipidinnholdet være 2 % etter gyting og 35 % andre deler av året
13
(40). En artikkel viser til at innholdet av EPA og DHA i fisk som spises ikke er like høyt etter varmebehandling som i rå fisk (42).
Mye av fisken som selges i matbutikker er oppdrettsfisk og det har vært medieoppslag de siste årene om at fagfolk strides om hvor sunn oppdrettsfisken er (43) (44) (45). Rapporter fra Norsk institutt for akvakultur, fiskeri og matforskning (Nofima AS) slår fast at produksjonen av oppdrettsfisk er så stor nå at fisken ikke lenger bare får næring med marint opphav, men også vegetabilsk fôr. Vegetabilsk fôr er billigere og lettere tilgjengelig enn marine næringskilder.
Konsekvensen av kostholdsendringen hos fisken har resultert i at innholdet av EPA og DHA i oppdrettslaks er redusert de siste årene (46) (47). En studie, illustrert i Figure 1, sammenliknet innhold av EPA og DHA i laks med ulikt opphav og fant store forskjeller (42).
Figure 1: Diagrammet gir en oversikt over hvor mye innholdet av EPA og DHA varierte i en studie der spiselig del av laks med ulikt opphav ble sammenliknet (42).
Innhold av miljøgifter i fisken er sterkt avhengig av hvor fisken er fanget. I Stillehavet og sør i Atlanterhavet er det lavere grad av forurensning enn for eksempel i Mexicogolfen, nord i Atlanterhavet eller Det indiske hav. Da forurensningen i stor grad er fettløselig tas den opp i
0 500 1000 1500 2000 2500
Atlanterhavet Chinook, Nord- Amerika
Oppdrett
m g EP A+DHA /1 00 g
Opprinnelse
Innhold av EPA og DHA i Laks i en studie
14
fettvevet hos fisk. Store og eldre fisk har tilbrakt mer tid i vannet og er derfor mer forurenset enn små og unge fisk (48).
Forurensning i havet gjør det utfordrende å få i seg nok EPA og DHA ved å spise fisk uten å skade helsen. U.S Food and drug administration (FDA) og Environmental protection agency (EPA) har advart om risiko for å få i seg for mye miljøgifter av typen toksiner ved å spise for mye fisk. En studie trekker frem en sammenlikning av klor- og kvikksølvinnhold i fisk og fiskeoljekonsentrater og konkluderer at fiskeoljekonsentrater gir tilskudd av EPA og DHA uten samme risiko for miljøgifter som ved å spise fisk. Lavere innhold av miljøgifter i
fiskeoljekonsentrater enn i fisk skyldes at konsentratene gjennomgår en renseprosess som reduserer miljøgifter (49).
2.2.2 Etylester og andre former for EPA og DHA
Det første lanserte legemiddelet basert på Omega-3 (Omacor, beskrives i kapittel 2.2.6), produseres av Pronova og består av EPA og DHA på etylesterform. Etter dette legemiddelet har det kommet flere alternative former for Omega-3 og aktører på markedet (14). Epanova er et eksempel på et annet Omega-3 legemiddel som er i form av frie fettsyrer (50). Som forklart tidligere består vanligvis triglyserider av ulike fettsyrer. For å kunne oppkonsentrere EPA og DHA ved å fjerne andre fettsyrer må derfor alle fettsyrer frigjøres fra
triglyseridstrukturen (51) (52). En måte å separere fettsyrene for å lage høykonsentrert EPA og DHA er å omdanne triglyseridene i fiskeoljen til etylestere gjennom transesterifisering som er beskrevet tidligere (48). Etter oppkonsentrering av EPA og DHA kan oljen omdannes tilbake til triglyserider eller beholdes i etylesterform (53).
To leverandører som selger EPA og DHA i form av triglyserider hevder at denne formen er bedre enn etylester. Forskjellen i kvalitet begrunnes med at triglyserider er den naturlige formen for lipid og derfor tas den bedre opp i kroppen, i motsetning til etylester som er kunstig fremstilt. Leverandørene hevder at mye Omega-3 på markedet er i form av etylester fordi det er mer kostbart å omdanne etylesteren til triglyserider i etterkant av
oppkonsentreringen av EPA og DHA fremfor å beholde oljen på etylesterform (49) (54). Den ene leverandøren sier at frie fettsyrer er mer effektive i å redusere triglyseridnivåer i blodet
15
enn etylester fordi kroppen må omdanne etylesteren tilbake til et triglyserid for å kunne utnytte den (49).
Fem studier viser at EPA og DHA i form av triglyserider eller frie fettsyrer har bedre effekt på kroppen i forhold til etylester (14) (55) (56) (57) (58). Den ene studien viser til at kroppen må omdanne etylesteren til triglyserid og at en slik omdanning er 10-50 ganger mindre effektivt enn å innta triglyserid i ren form i utgangspunktet. Studien viser til at lavere effektivitet med etylester skyldes at enzymene i bukspyttkjertelen som fordøyer lipider ikke klarer å behandle etylester like bra og effektivt som triglyserider (55). Et av de andre studiene påpeker at et viktig poeng er at pasienter med hjerteproblemer anbefales å redusere inntak av lipider.
Studien viser at ved lavere inntak av lipider reduseres enzymene i bukspyttkjertelen, noe som igjen fører til enda dårligere utnyttelse av etylester (14).
Studien som ligger til grunn for lanseringen av Omacor (Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto miocardico, kjent som GISSI trial) beviste at DHA og EPA i form av etylester virker til sin hensikt (59). Det er tre andre studier som viser ingen forskjell mellom hvor godt etylester og triglyserider tas opp i kroppen (60) (61) (62).
2.2.3 Negative helseeffekter av ulike typer lipider
Lipider er en viktig kilde for energi og er viktig for vekst, utvikling og god helse (1) (63). Likevel er det et kjent faktum at fedme kan føre til ulike helseplager. Overflødig fett på kroppen er som kjent lagret energi, men i tillegg er det aktivt vev som produserer og skiller ut stoffer i kroppen (64). I blodet er det ulike typer lipider; triglyserider, kolesterol med lav-tetthet- lipoprotein (Low density lipoprotein, LDL) og kolesterol med høy-tetthet-lipoprotein (High density lipoprotein, HDL) (65). Lipoproteiner frakter lipider i blodet når de skal til celler og vev som energikilde eller byggestein (66).
En studie oppsummerer at feil mengde eller kvalitet på lipider i mat påvirker utvikling av hjerte- og karsykdommer, åreforkalkning, blodtrykk, hjerteforstyrrelser, kreft, diabetes, hudsykdommer og immunforsvar (10). Mengde og type lipid er avgjørende for utvikling av hjertesykdommer (63).
16
Overdrevet inntak av lipider, spesielt av LDL kolesterol, kan gi alvorlige helseplager (1) (10).
Denne typen kolesterol er derfor kjent som det negative kolesterolet (65).
Høyt inntak av transfett kan føre til utvikling av flere ulike sykdommer, blant annet
åreforkalkning, kreft, høyere blodtrykk, hjertesykdommer og type 2 diabetes. To studier viser til at transfett er spesielt negativt for risiko for hjerte- og karsykdommer (67) (68). En annen studie viser at trans fettsyrer ikke har noen viktig funksjon i kroppen, men mennesker kan bruke dem som energikilde, illustrert i Figur 2.9 (8). En tredje studie anbefaler at transfett bør utgjøre mindre enn 1 % av energiinntaket på grunn av den negative effekten (63).
Figur 2.9: Mange populære matvarer er kjent for høyt innhold av transfett (69).
For å forebygge sykdom er det et generelt råd fra myndigheter og eksperter at lipider ikke utgjør mer enn 30 % av dagens totale kaloriinntak (1). Av lipidinntaket bør mettede lipider reduseres fra rundt 20 % til maksimalt 10 % og inntaket av essensielle fettsyrer bør være minimum 2 % av kaloriinntaket (10).
17 2.2.4 Positive helseeffekter av ulike typer lipider
For lavt inntak av lipider er ikke positivt for kroppen. Er lipidinntaket for lavt kan det utvikles et syndrom kalt essensiell fettsyremangel (1). Syndromet skyldes at flerumettede fettsyrer, eksempelvis EPA og DHA, er essensielle for menneskers helse. Disse fettsyrene har viktige roller i flere biologiske funksjoner og i forebygging samt behandling av sykdommer (34) (70).
De essensielle fettsyrene er helt nødvendige forløpere i kroppen for signalmolekylene eicosanioder (1) (26). Eicosanoider har viktige roller i immunsystem, blodkoagulering og muskulatur (31). Denne gruppen omfatter prostaglandiner, prostasykliner, tromboksaner og leukotriener som alle har ulike oppgaver i kroppen (26). Prostaglandiner har for eksempel ulike roller i vev (1).
Linolsyre (LA, 18:2 ω-6) er den vanligste flerumettede fettsyren i kostholdet. Den finnes blant annet i korn, soyabønner og solsikke. LA omdannes til Arakidonsyre (AA, 20:4 ω-6) som, i likhet med andre flerumettede fettsyrer, kan være forløper for eicosanoider. LA og ALA kan ikke lages av kroppen og er av den grunn kjent som essensielle fettsyrer (9).
En studie viser at flerumettede fettsyrer ikke bare er en energikilde eller strukturell komponent i celler, men også har en sentral rolle i uttrykning av ulike gener. Rollen til de flerumettede fettsyrene er å påvirke aktiviteten til komponenter som leser og uttrykker gener (71). En annen mer konkret studie av gener har vist at flerumettede fettsyrer motvirker at genet ACC (Acetyl-CoA carboksylase) blir aktivert. Genet er involvert i både overvekt og noen typer kreft. I en studie med mus der ACC genet ble skrudd av var det mer fett enn normalt som ble nedbrutt og musene hadde mindre fett på kroppen enn normalt. Musene som hadde fått dette genet skrudd av kunne spise 20 % mer mat enn vanlige mus og likevel ha 50 % mindre fettvev i kroppen (11). En annen studie med rotter viste at de som gikk på en diett med mye fiskeolje hadde 20-30 % mindre innvollsfett enn rotter på andre dietter (72).
To studier viser at mangel på Omega-3 påvirker huden negativt (1) (26). En annen studie viser at Omega-3 er viktig for normal vekst og utvikling og antyder at fettsyren kan ha en viktig rolle i forebygging av diabetes og kreft (73). To andre studier viser at Omega-3, spesielt EPA og DHA, har positiv effekt på betennelser, sentralnervesystemet, oppførsel og autonome
sykdommer (67) (68). Omega-3 har i tillegg vist å ha positiv innvirkning på psyken. Fire studier viser til Omega-3 sin effekt på ADHD, depresjon, demens, humør, aggresjon og nevrologisk
18
utvikling hos spedbarn (30) (34) (74) (75). De positive effektene har ført til et stort marked for salg av Omega-3 basert kosttilskudd, illustrert i Figur 2.10.
Figur 2.10: Det finnes mange produkter av Omega-3 på markedet som lover bedre helse (76).
Det er komplisert å studere hvordan Omega-3 virker i kroppen. En studie påpeker at mekanismene er forskjellige i forskjellige typer celler og med forskjellige typer fettsyrer. I tillegg viser studien at etter inntak av Omega-3 blir effekten værende i kroppen lenge, til og med etter 6 måneder. Studien konkluderer med at denne observasjonen gjør det utfordrende å studere effekten av Omega-3 i kroppen isolert (77).
Selv om Omega-3 er kjent for positive helseeffekter er det spesielt de marine fettsyrene EPA og DHA som har vist i studier å redusere risiko for hjertesykdommer (34) (73) (74) (75).
2.2.5 Hjerte- og karsykdommer relatert til lipidinntak og Omega-3
Danskene Dyerberg og Bang var de første som påpekte sammenhengen mellom kostholdet til eskimoene på Grønland og lav dødelighet av hjertesykdommer (32) (67). Det spesielle med eskimoenes kosthold var at det var veldig rikt på marine oljer (7) (32) (67) (78) (79).
Observasjonen banet vei for konklusjon om at inntak av EPA og DHA har sammenheng med
19
redusert risiko for hjerte- og karsykdommer (7) (9) (33) (68) (80). Hjerte- og karsykdommer er også sjeldent i andre folkegrupper som spiser mye fisk som for eksempel øyboere sør i
Stillehavet, japanere og urfolk i Alaska. Dette har bidratt ytterligere til å bevise effekten av EPA og DHA på hjerte- og karsykdommer (9) (80). Fisk har også små mengder av Omega-3 fettsyren DPA (22:5ω-3). Det er mindre kunnskap om denne fettsyrens helseeffekter, men en studie viser til at også den kan ha fordeler for mental helse og hjerte- og karsykdommer (33).
Hjerte- og karsykdommer omfatter hjertesykdom, hjerneslag og åreforkalkning (67). Dette er den største dødsårsaken i de fleste vestlige land. Røyking, fedme, stress, genetikk,
betennelser, fysisk aktivitet og diabetes bidrar til risiko for hjerte- og karsykdommer (9) (67).
Det er samtidig et faktum at ikke bare dårlig kosthold og livsstil fører til hjerte- og
karsykdommer. En studie viser at folk som overproduserer lipoproteiner er mer disponert for å utvikle hjerte- og karsykdommer (32).
En studie påpeker at det lave inntaket av Omega-3 i vestlige land i dag mistenkes å være skyld i den store utbredelsen av hjerte- og karsykdommer (81). En annen studie påpeker at det er stor endring i inntaket av typer lipid i dagens vestlige befolkning sammenliknet med
urmennesket. Det vises til et gjennomsnittlig inntak i vesten på 0,1-0,3 g EPA og DHA daglig.
Studien viser til at endringen i stor grad skyldes industrialisering og herunder økt tilgang på prosessert mat (8). Til sammenlikning viser to studier til en mengde for friske mennesker på 0,5 g EPA og DHA daglig, illustrert i Figur 2.11 (8) (33). De neste avsnittene har som mål å gi en oversikt over forskning som er gjort på mekanismer som påvirker hjerte- og karsykdommer sett i sammenheng med Omega-3 inntak.
20
Figur 2.11: I vestlige land spises det for lite Omega-3, noe som mistenkes å bidra til flere tilfeller av hjerte- og karsykdommer i moderne tid (82).
En studie viser til at høyt inntak av lipid påvirker risiko for åreforkalkning. Studien viser også at type lipid er viktigere enn mengde når det gjelder risiko (9). En studie som gjennomgikk
publisert forskning på dette temaet i 2006 konkluderte med å finne mange bevis på at EPA og DHA etylestere har positiv innvirkning på åreforkalkning (83). En annen studie viser for
eksempel en sammenheng mellom høyt inntak av mettet fett relativt til inntaket av umettet fett og forekomst av åreforkalkning og hjertesykdom (74). Resultater tyder på at et inntak på over 15 % av daglig energi i mettede fettsyrer er direkte relatert til økning av LDL kolesterol og påfølgende risiko for åreforkalkning (9). LDL Kolesterol hoper seg opp i blodårene slik at blodet hindres i å strømme gjennom (1) (65). En slik opphopning kan føre til et høyere
blodtrykk, åreforkalkning og skade på organer som får for lite blodtilførsel (1) (84). To studier viser til at risiko for hjertesykdom er proporsjonal med LDL kolesterolnivå (65) (74).
Noen typer kolesterol er viktige for kroppens funksjoner (1). HDL kolesterol er en type positiv kolesterol som antas å motvirke effekten ev LDL (2) (84). Inntak av Omega-3 har vist i en studie å øke HDL i kroppen (80). Flerumettede fettsyrer har også vist evne gjennom flere studier til å senke LDL kolesterolnivåene i kroppen og bidra til at disse skilles ut raskere (11) (32) (74) (78) (85).
21
Forskningsresultater viser til at Omega-3 senker triglyseridnivået hos pasienter med høyt nivå (11) (32) (74) (80) (85) (86). En studie viser at Omega-6 ikke har den samme effekten som Omega-3 på kolesterol- triglyseridnivåer. Pasienter med hjerte- og karsykdommer fikk Omega- 3 inntaket i kosten erstattet med Omega-6 fra planteolje, noe som førte til økt nivå av
triglyserider og kolesterol etter kort tid. Tilsvarende effekt ble observert hos friske individer (32). En gjennomgang av mange studier som ble utført i 2006 konkluderte med at det er liten tvil om at EPA og DHA senker triglyseridnivåene hos mennesker (83).
En studie foreslår at effekten av Omega-3 på hjerte- og karsykdommer kan skyldes redusert fettsyresyntese i kroppen, økt nedbryting av fettsyrer i leveren, nedregulering av
triglyseridsyntese enzymer, eller at triglyserider splittes fra LDL (85).
Flere studier viser til at Omega-3 fettsyrer har en viktig rolle i regulering av høyt blodtrykk ved å redusere dannelse av blodplater (11) (26) (67) (73) (80). En studie påpeker at Omega-3 reduserer produksjon av tromboksan, et lipid som bidrar til økt blodtrykk. I pasienter med åreforkalkning er det målt for høy produksjon av tromboksan (87). I dyreforsøk er det vist at inntak av Omega-3 motvirker mettet fett sin evne til å danne blodpropp (86). Også Norge har bidratt til Omega-3 forskningen med spennende resultater. En forskningsgruppe i Tromsø viste at folk som spiser lite fisk fikk lavere blodtrykk ved å spise 5 g Omega-3 daglig. Personer som spiste mye fisk fra før fikk ikke lavere blodtrykk av det samme Omega-3 tilskuddet.
Resultatene indikerer at det er en grense for hvor mye blodtrykket kan senkes ved økt inntak av Omega-3 (87).
Obduksjonsstudier tyder på at folk med høyt innhold av DHA i kroppen hadde lite
åreforkalkning ved hjertet. I motsatt tilfelle ble det også funnet at folk som døde brått av hjertesykdom hadde lavere mengde Omega-3 i kroppen sammenliknet med folk som døde av andre årsaker (80). Forskning viser at inntak av Omega-3 etter et tilfelle av hjerteinfarkt minsker risiko for et nytt infarkt samt å dø av et nytt anfall (8) (88). I en studie på en stor gruppe med menn som nylig hadde hatt hjerteinfarkt gikk tilfeller av død fra hjerte- og karsykdommer ned med 29 % i løpet av 2 år etter de begynte å ta 1 g/dag av Omega-3 (80).
GISSI Trial resultatene viste at tilskudd av EPA og DHA etter hjerteinfarkt reduserte død og slag (59).
22
To studier indikerer at effekten av Omega-3 på hjerte- og karsykdommer kan skyldes at fettsyrene endrer koagulering av blod, forbedrer cellevegger, påvirker platedannelse i blodet eller senker viskositet i blodet (80) (86). Fire andre studier viser til at EPA og DHA motvirker uregelmessig hjerterytme (34) (73) (74) (75). Høy hjerterytme gir høyere risiko for å dø
umiddelbart av infarkt. To kilder viser til at Omega-3 sin egenskap til å motvirke infarkt derfor kan skyldes stabilisering av hjerterytmen, som illustrert i Figur 2.12 (8) (80).
Figur 2.12: Inntak av marine Omega-3 fettsyrer har positiv innvirkning på hjertets helse (89).
I likhet med GISSI Trial resultatene er det over tid observert at folk som spiser EPA og DHA har lavere risiko for hjerneslag. Trenden kan skyldes at Omega-3 har positiv effekt på utvikling av betennelser som igjen reduserer risiko for slag. Det finnes også resultater som tyder på at folk som selv velger å spise mye fisk har lavere risiko for slag. Studien påpeker at dette kan skyldes at fisk velges fremfor eksempelvis rødt kjøtt (67).
Det er anbefalt at pasienter med hjerte- og karsykdommer inntar minst 0,5 g/dag til over 1 g/dag EPA og DHA (8) (42). Pasienter med høye triglyseridnivåer i blodet er anbefalt 2-4 g/dag (42). Minst 1 g/dag Omega-3 anbefales for pasienter med åreforkalkning. Ingen funn til nå tyder på at det er negativt for helsen å spise mange gram Omega-3 om dagen (8).
23
2.2.5.1 Oppsummerte systematiske oversikter over helserelatert forskning
Kunnskapssenteret for helsetjenesten i Folkehelseinstituttet har blant annet ansvar for å oppsummere forskning, fremme pasientsikkerhet og fremme bruk av forskningsresultater (90). Senteret bidrar til studier som publiseres i oppsummerte systematiske oversikter til bruk for nasjonale beslutninger og i klinisk praksis. For å bygge den globale basen av
forskingsoversikter, publiserer Kunnskapssenteret systematiske oversikter til databasen Cochrane(91). Systematiske oversikter blir benyttet når Kunnskapssenteret vurderer helserelatert forskning. Slike oversikter er et resultat av grundige studier på innsamlet, oppsummert forskning som er kritisk vurdert (92).
Kunnskapssenteret viser til en pyramide av ulike kilder for forskning som er publisert på nettsidene til nasjonal kompetansetjeneste for læring og mestring innen helse. Pyramiden illustrerer ulike nivåer av kvalitet på ulike kilder for forskningsresultater. Som pyramiden i Figur 2.13 viser, er oppsummerte systematiske oversikter høyt oppe, sammenliknet med enkeltstudier som ligger nederst. Oppsummert forskning, som blant annet ligger til grunn for utarbeidelse av nasjonale retningslinjer for helseråd til befolkningen, er altså en sikrere kilde til informasjon enn enkeltstudier (artikler utgitt i ulike tidsskrift). Det er derfor anbefalt å starte så høyt opp i pyramiden som mulig for å finne svar på et forskningsspørsmål (93).
Figur 2.13: Pyramide som illustrerer kvalitet på ulike kilder for helserelatert forskning (93).
24
I 20 år har Cochrane produsert systematiske oversikter over primærforskning innen helse og er internasjonalt anerkjent som den høyeste standarden av bevisbaserte ressurser. I slike oversikter inngår all eksisterende forskning på et emne som oppfyller strenge kriterier. Målet med oversiktene er å gi svar på om en bestemt helsebehandling har effekt. Cochrane er et samarbeid med bidragsytere fra hele verden som produserer relevante og pålitelige forskningsbevis, i form av Cochraneoversiktene. Oversiktene er publisert online i Cochrane Library (94).
En Cochraneoversikt omhandler effekten av Omega-3 i forebygging og behandling av hjerte- og karsykdommer. Cochraneoversikten viser at Omega-3 tilskudd reduserer triglyseridnivåer og LDL kolesterol, men har ingen signifikant effekt på vekt, total kolesterol, HDL-kolesterol og blodtrykk. I oversikten er det konkludert med ingen synlige effekter i risikoreduksjon for dødelighet eller tilfeller av hjerte- og karsykdommer ved inntak av Omega-3. Konklusjonen inkluderer både folk i risikogruppen for hjerte- og karsykdommer og i befolkningen generelt.
Internasjonale retningslinjer oppfordrer folk som har hatt hjerteinfarkt til å ta mer Omega-3 og kliniske studier med personer som har hatt hjerteinfarkt (For eksempel GISSI Trial) støtter dette. Cochrane forfatterne anbefaler at dette rådet opprettholdes, men ytterligere
høykvalitets studier er nødvendig for å bekrefte en beskyttende effekt av Omega-3 mot hjerte- og karsykdommer (95).
En annen Cochraneoversikt omhandler effekten av redusert og endret lipid i kostholdet på risiko for hjerte- og karsykdommer. I denne oversikten er Omega-3 ekskludert ettersom Cochraneoversikten beskrevet i forrige avsnitt tar for seg dette. Oversikten viser at reduksjon av mettet lipid og tilsvarende økning av umettet lipid ser ut til å redusere tilfeller av hjerte- og karsykdommer med 14 %. Det påpekes at dette gjelder endring av lipidtypebalansen, ikke reduksjon i totalt lipid. Endring av transfett i kosten gav ingen tydelig konklusjon på helseeffekt (96).
En tredje Cochraneoversikt omhandler effekten av Omega-6 på forebygging av hjerte- og karsykdommer. I oversikten konkluderes det med utilstrekkelige bevis for effekt av økt eller redusert Omega-6 inntak på risikofaktorer for hjerte- og karsykdommer som kolesterol og blodtrykk. Denne konklusjonen forankres i at det er få studier tilgjengelig om dette temaet og det er behov for et større statistisk grunnlag (97).
25 2.2.6 Omacor
Som illustrert i tidligere kapitler er det flere studier som viser til at Omega-3 har positiv effekt på hjerte- og karsykdommer. Slike studier la grunnlag for å bruke EPA og DHA med høy konsentrasjon som medisin i behandling av hjerte- og karsykdommer (34). I forskriften om legemiddelklassifisering i Norge regnes Omega-3 fettsyrer som medisin og ikke kosttilskudd ved døgndoser av Omega-3 over 3 g (98).
Omacor er et legemiddel som inneholder EPA og DHA i form av oppkonsentrerte Omega-3 etylestere, illustrert i Figur 2.14 (99). Det er det første patenterte Omega-3 legemiddelet og er ment som et supplement til kosthold for pasienter som har hatt hjerteinfarkt (100). Omacor er testet i over 60 kliniske studier (31). Fem studier har vist effekt av Omacor i behandling av høyt triglyseridnivå i blodet (85). I følge felleskatalogen for legemidler i Norge kan Omacor foreskrives på blå resept ved veldig høyt triglyseridnivå i blodet eller etter hjerteinfarkt og anbefalt dose er 2-5 kapsler daglig (101).
Figur 2.14: Legemiddelet Omacor med høykonsentrert EPA og DHA for behandling av høye triglyseridnivåer og forebygging av nye hjerteinfarkt (102).
