Årsaker til vedvarende plager og smerter

3.9.1 Colheita de amostras para biópsia muscular

A biópsia muscular é utilizada para diagnóstico parasitológico na identificação de larvas de

T. spiralis (Dupouy-Camet et al., 2002).

Os procedimentos associados à colheita e processamento laboratorial da biópsia muscular são de grande importância e podem ter muita influência nos resultados finaisn (Anderson, 1997).

Imediatamente após o sacrifício dos ratos em estudo, foram realizadas 5 biópsias musculares (da língua, masseter, diafragma, membros superiores e membros inferiores), com aproximadamente 4 mm de largura e 10mm de comprimento. Os fragmentos foram manipulados com muito cuidado de forma a evitar o seu traumatismo. Seguidamente procedeu-se à orientação dos fragmentos para congelação.

3.9.2 Orientação da biópsia muscular para congelação

Para a orientação dos fragmentos, identificaram-se 5 discos de cortiça (com o nome dos órgãos das biópsias musculares). Preparou-se uma solução de goma adragante a 10% (Sigma) com 5 gotas de formol (para evitar contaminações por microrganismos), e colocou-se cerca de 2 gramas em cada disco de cortiça. Em seguida posicionaram-se as biópsias perpendicularmente à superfície da cortiça (Figura 29).

81 Figura 29. Orientação das biópsias musculares em disco de cortiça para congelação.

(original de C. Freitas).

3.9.3 Congelação das biópsias

O método de congelação escolhido teve em conta o facto da biópsia muscular ser extremamente propensa à formação de artefactos provocados pela congelação. Os artefactos podem mascarar ou impedir a interpretação morfológica do músculo, pelo que a congelação correcta é crucial para estudos histológicos (Dubowitz & Sewry, 2007).

A imersão das biópsias musculares directamente em azoto líquido induz a formação de artefactos (Anderson, 1997; Dubowitz & Sewry, 2007) . O principal motivo pelo qual os artefactos de congelação ocorrem deve-se ao efeito Leidenfrost (Faupel & Seitz, 1972). Este fenómeno ocorre quando um líquido entra em contacto com uma massa, com uma temperatura significativamente superior ao seu ponto de ebulição, produzindo um gás que isola a massa do líquido (Curzon, 1978). Deste modo, a imersão directa da biópsia muscular em azoto líquido impede a sua congelação imediata já que origina algum gás de nitrogénio à volta da biópsia, abrandando o processo de arrefecimento (Dubowitz & Sewry, 2007).

82 Uma técnica viável que minimiza o efeito Leidenfrost, consiste em congelar a biópsia muscular, quase instantaneamente, em isopentano previamente arrefecido em Azoto líquido (Manz, 1980; Anderson, 1997; Bancroft & Gamble, 2002; Dubowitz & Sewry, 2007).

Para a congelação das biópsias musculares deste estudo, realizou-se a metodologia em vigor no Laboratório de Neuropatologia do Centro Hospitalar Lisboa Norte, EPE- Hospital de Santa Maria mediante o esquema descrito na Figura 30.

Transferiu-se azoto líquido para um termo com capacidade de 500 mL. Em seguida colocou-se 100 mL de isopentano -2-Methyl Butane - (BDH GPRTM)num copo de precipitação de polietileno de três bicos, com capacidade 500mL, que seimergiuno azoto líquido (Figura 31).

Figura 30. Congelação de biópsia muscular em isopentano arrefecido com azoto líquido.

(original de C. Freitas)

Realizou-se um controlo visual da temperatura. Considerou-se que o isopentano estava arrefecido quando se observou a formação de uma névoa branca no topo do copo de precipitação, e a presença de cristais brancos no fundo do mesmo (Anderson, 1997). Voltou-se a encher o termo com azoto líquido e a controlar visualmente a formação da névoa no copo de precipitação.

Copo de precipitação Azoto líquido no interior do termo Pinça Disco de cortiça Isopentano Goma adragante Biopsia muscular Termo

83 Fixou-se o disco de cortiça a uma pinça, com a biópsia muscular orientada. Procedeu-se à imersão das biópsias (uma a uma) na solução de isopentano, realizando movimentos circulares à volta do copo de precipitação, continuamente, durante 60 segundos (Figura 32).

Figura 31. Material de congelação das biópsias.

(original de C.Freitas).

Figura 32. Congelação das biópsias musculares.

(original de C. Freitas).

Imediatamente após a congelação, as biópsias musculares foram transferidas para tubos de plástico identificados e previamente colocados a -80ºC.

O procedimento de congelação foi efectuado na UHMM de forma a garantir que as biópsias musculares eram congeladas o mais rapidamente possível (imediatamente a seguir ao abate). As amostras foram conservadas a -80ºC (Cryocell) e depois transportadas em gelo seco, para o Laboratório de Neuropatologia do Centro Hospitalar Lisboa Norte, EPE- Hospital de Santa Maria. A escolha do Laboratório de Neuropatologia para a realização do processamento em congelação e técnicas imunohistoquímicas, prendeu-se com a vasta experiência do mesmo no trabalho desenvolvido com biópsias musculares. Os protocolos descritos estão de acordo com os utilizados neste laboratório.

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3.9.4 Corte histológico em crióstato

No Laboratório de Neuropatologia, as amostras foram conservadas a -80ºC (arca Thermo Electron Corporation - 994).

Apesar de inicialmente se terem colhido e congelado 50 fragmentos de músculo (de 10 ratos), o corte histológico em crióstato foi realizado em 20 amostras (língua e masseter). Esta amostragem teve em conta os critérios de inclusão e exclusão utilizados para o material fixado em formol e impregnado em parafina, e a verificação da qualidade morfológica das amostras congeladas mediante coloração de Hematoxilina - Eosina extemporânea, realizada nos primeiros cortes de congelação efectuados.

Para a realização de cortes de congelação, retiraram-se as amostras da arca a -80ºC e transferiram-se para o interior do crióstato (Microm HM550), com uma temperatura de -24ºC.

Fixou-se o disco de cortiça com a biópsia muscular a um molde metálico, apropriado para o crióstato, utilizando-se para o efeito Tissue – Tek® O.C.T. compound (Sakura) (resina solúvel em água que forma um polímero sólido quando congelado).

O molde metálico foi colocado no porta bloco do crióstato e realizaram-se cortes de congelação (Figura 33) para os músculos de língua e masseter: um corte a 10 micra (para coloração de Hematoxilina - Eosina extemporânea), e quatro cortes a 6 micra (dois para técnicas imunofluorescentes e dois para eventuais repetições).

Para os cortes de congelação, utilizaram-se lâminas carregadas electroestaticamente Menzel®-Glaser®,Superfrost®Plus.

Após o corte, as lâminas secaram ao ar, à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida envolveram-se em papel de alumínio e congelaram-se a -80ºC (arca Thermo Electron Corporation).

85 Figura 33. Corte das biópsias musculares em crióstato.

(original de C. Freitas)