TRABAJO DE FIN DE GRADO
“IMPACTO DEL BLOQUEO DEL RECICLAJE DEL PEPTIDOGLUCANO Y PRODUCCIÓN DE BETA-
LACTAMASAS ADQUIRIDAS SOBRE LA VIRULENCIA DE Pseudomonas aeruginosa”
Juan Manuel Humbert García
Grado de Bioquímica Facultad de Ciencias
Año Académico 2019-20
PEPTIDOGLUCANO Y PRODUCCIÓN DE BETA- LACTAMASAS ADQUIRIDAS SOBRE LA VIRULENCIA DE Pseudomonas aeruginosa”
Juan Manuel Humbert García
Trabajo de Fin de Grado Facultad de Ciencias
Universidad de las Illes Balears
Año Académico 2019-20
Palabras clave del trabajo:
Pseudomonas aeruginosa, antibióticos beta-lactámicos, beta-lactamasas, peptidoglucano, citotoxicidad, virulencia
Nombre Tutor/Tutora del Trabajo Carlos Juan Nicolau
Se autoriza la Universidad a incluir este trabajo en el Repositorio Institucional para su consulta en acceso abierto y difusión en línea, con fines exclusivamente académicos y de investigación
Autor Tutor Sí No Sí No
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ÍNDICE
RESUMEN --- Página 2 1. INTRODUCCIÓN --- Página 4 a. Características generales de Pseudomonas aeruginosa --- Página 4 b. Aspectos clínicos relacionados con el microorganismo. Patogenicidad e introducción a sus formas de resistencia --- Página 5 c. Resistencia a los antibióticos beta-lactámicos mediada por beta-lactamasas en Pseudomonas aeruginosa --- Página 11 d. Proceso metabólico del peptidoglucano. Estructura, proceso de reciclaje, componentes involucrados en dicho proceso y relación con AmpC --- Página 15 e. Antecedentes de nuestro marco experimental. Conexión entre la resistencia a beta-lactámicos, metabolismo del peptidoglucano y virulencia en Pseudomonas aeruginosa --- Página 19 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS --- Página 20 3. MARCO EXPERIMENTAL PROPUESTO --- Página 22 a. Proceso de transformación génica. Obtención de las cepas del microorganismo deseadas para la realización del marco experimental--- Página 22 b. Cultivos celulares. Mantenimiento y preparación para el ensayo de infección --- Página 24 c. Ensayo de infección de los cultivos celulares con cepas del microorganismo --- Página 25 d. Cuantificación de LDH en el sobrenadante de los cultivos celulares como medida de la citotoxicidad de P. aeruginosa --- Página 26 e. Proceso secundario. Comprobación de MOI mediante cultivo microbiológico en placa --- Página 27 4. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES --- Página 28 5. BIBLIOGRAFÍA --- Página 29
RESUMEN
Las infecciones nosocomiales siguen siendo, actualmente, un grave problema para la sanidad y la salud humana, problema que se ve agravado por el continuo incremento de la resistencia antibiótica.
Uno de los agentes típicos causales de infecciones en los distintos pacientes hospitalizados es Pseudomonas aeruginosa, especie perteneciente al grupo de los gram-negativos y a las proteobacterias. Asimismo, este microorganismo se caracteriza por su alto nivel de resistencia antibiótica. Una de las variantes de resistencia más importantes de P.aeruginosa es aquella contra los antibióticos beta-lactámicos, esto debido a que son el arma más habitualmente utilizada para combatir al microorganismo, aunque cada vez se están volviendo menos efectivos contra ella.
Todo esto ha obligado que en la actualidad sea necesaria la búsqueda de nuevas estrategias para hacer frente al microorganismo y, para ello, es necesario entender los puntos débiles de la biología de esta especie. En el caso del trabajo propuesto, se pretende profundizar en la interconexión entre la resistencia a los beta- lactámicos, el metabolismo del peptidoglucano y la virulencia de P. aeruginosa.
Gracias a estudios anteriores, tales como los que constituyen la tesis doctoral del Dr. Marcelo Pérez Gallego (“Conexión entre metabolismo del peptidoglicano, resistencia a beta-lactámicos y virulencia en Pseudomonas aeruginosa”), se ha podido establecer que la suma de dos factores, siendo estos el bloqueo en el proceso de reciclaje del peptidoglucano y una hiper-expresión de AmpC, conduce a un drástico descenso en la virulencia de P. aeruginosa en el modelo invertebrado Galleria mellonella.
Basándonos en estos antecedentes, la intención de este trabajo es averiguar si estos hallazgos se siguen observando en el parámetro específico de la citotoxicidad causada por P. aeruginosa sobre cultivo celular.
También se propone averiguar si el descenso de virulencia se produce de igual forma al expresar otros tipos de beta-lactamasas (en nuestro caso diferentes variantes de tipo OXA adquiridas horizontalmente) en lugar de AmpC, y en diferentes backgrounds de bloqueo del reciclaje del peptidoglucano. Con todo ello se profundizará más en las bases moleculares de la virulencia de P. aeruginosa, un paso inicial imprescindible para el futuro desarrollo de terapias contra esta especie.
Nosocomial infections pose today a serious problem for human healthcare, a situation that is exacerbated by the continued increase of antibiotic resistance.
One of the typical causes of infectious diseases in hospitalized patients is Pseudomonas aeruginosa, a species belonging to the gram-negative group and proteobacteria. This microorganism is also characterized by its high antibiotic resistance level. One of the most important resistance variants of P. aeruginosa is that against beta-lactam antibiotics, because these are the most commonly used drugs to fight this microorganism, although, they are becoming progressively ineffective against it.
This situation forces the search for new strategies to combat this microorganism at present and for this, it is essential to understand the weak points from its biology. In the case of the proposed study, it is intended to delve into the interconnection between the beta-lactam resistance, the peptidoglycan metabolism and P.
aeruginosa’s virulence.
Thanks to previous studies, such as those that constitute the doctoral thesis done by Dr. Marcelo Pérez Gallego (“Conexión entre metabolismo del peptidoglicano, resistencia a beta-lactámicos y virulencia en Pseudomonas aeruginosa”), it has been established that the addition of two factors (namely the peptidoglycan recycling process blockage and the hyperexpression of AmpC intrinsic beta-lactamase) leads to a drastic decrease of the P. aeruginosa’s virulence in the invertebrate model Galleria mellonella.
Based on this background, the intention of this study is to find out if these findings are still observed in the specific parameter of cytotoxicity caused by P. aeruginosa over cell culture. It is also proposed to find out whether the decrease in its virulence occurs in the same way when expressing other types of beta-lactamases (in our case different horizontally-acquired OXA variants) instead of AmpC and in different backgrounds with impaired peptidoglycan recycling. This will provide us more knowledge into the molecular basis of the P. aeruginosa’s virulence, an essential initial step for the future development of therapies against this species.
INTRODUCCIÓN
Características generales de Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa es un microrganismo Gram-negativo el cual se caracteriza por formar parte de la rama de las Proteobacterias y por presentar la siguiente clasificación taxonómica, expuesta esta en la tabla 1 [1].
Tabla 1 - Clasificación taxonómica de Pseudomonas aeruginosa FILO Proteobacteria CLASE Gammaproteobacteria ORDEN Pseudomonadales FAMILIA Pseudomonadaceae GÉNERO Pseudomonas ESPECIE Pseudomonas aeruginosa
Asimismo, este microorganismo se considera un bacilo no formador de esporas y móvil, siendo esto último debido gracias a la presencia de un flagelo polar. A nivel de metabolismo, este presenta una elevada versatilidad debido a que es capaz de metabolizar hasta un total de ochenta compuestos orgánicos para la obtención de energía. Se considera, además, que su metabolismo es respiratorio estricto con la particularidad de tener al oxígeno como aceptar final de electrones; aunque es sabido que en algunas condiciones extremas de anaerobiosis es capaz de recurrir a los nitratos como dichos aceptores finales. Unos últimos aspectos sobre su metabolismo es que este microorganismo se considera oxidasa positivo, catalasa positivo y no fermentador de lactosa [1].
A nivel de crecimiento, las distintas colonias formadas por este microorganismo suelen crecer a 37ºC, aunque también se ha comprobado que este también es posible a temperaturas de 42ºC e incluso a 4ºC, y estas suelen ser extensas, aplanadas, con bordes serrados y con presencia de un olor de carácter dulce. Esta suele ser la morfología más común respecto a su crecimiento, pero también se ha visto como estas pueden presentar un crecimiento típico pequeño (conocido este como SCV o small colony variants) el cual se ha asociado al desarrollo de algunas infecciones nosocomiales de carácter respiratorio [1].
Otra de las características de este microorganismo es que tiene la capacidad de poder sintetizar algunos compuestos conocidos estos como sideróforos, siendo estos compuestos hidrosolubles y por tener una funcionalidad principal relacionada con la captación de hierro para garantizar el metabolismo del microorganismo [1], [2]. Ahora bien, investigaciones a lo largo de los años han podido demostrar que estos compuestos también presentan otro tipo de funcionalidad, estando esta relacionada con la patogenicidad de los microorganismos que los sintetizan así como también con la emisión de una determinada coloración [1].
En la tabla inferior (tabla 2) se muestran algunos de los sideróforos más conocidos que son sintetizados por algunas cepas concretas de Pseudomonas y su respectiva coloración [1]. En posteriores párrafos se detallarán más aspectos sobre dichos compuestos relacionados con la patogenicidad.
Tabla 2 - Sideróforos más conocidos y la coloración que aportan a las distintas colonias de Pseudomonas SIDERÓROFO COLORACIÓN
Pioverdina Amarrillo-verdoso
Piocianina Azulado
Piorrubina Rojizo
Pioverdina Verde-azulado
Piomelanina Marrón
Por último, este microorganismo se caracteriza por poder habitar en un gran número de hábitats distintos, predominantemente en ambientes húmedos; así como también por tener la propiedad de soportar múltiples condiciones fisicoquímicas y de colonizar múltiples zonas, incluidas las incluidas dentro del ámbito hospitalario. Este hecho, sumado al aspecto sobre su elevada resistencia a agentes bactericidas (el cual será comentado con más detalle en posteriores párrafos) ha hecho que sea considerado como un potencial patógeno humano responsable de algunas infecciones nosocomiales, siendo algunas de estas de carácter grave [1].
Aspectos clínicos relacionados con el microorganismo. Patogenicidad e introducción a sus formas de resistencia
Tal como se ha comentado anteriormente, P. aeruginosa es considerado un patógeno humano el cual es capaz de provocar toda una serie de patologías, siendo algunas de ellas de carácter nosocomial cuando estas son producidas en ambientes hospitalarios. Ahora bien, hay que especificar que este microorganismo suele estar relacionado con las infecciones que son producidas en pacientes inmunodeprimidos o que están bajo los efectos de ciertos antibióticos (sobre todo los de espectro ampliado) y casi nunca suele estar relacionado con la producción de infecciones en pacientes sanos e inmunocompetentes [3], [4].
Por otro lado, es importante tener claro también que cuando se desea estudiar la patogenicidad de dicho microorganismo debemos centrarnos en varios aspectos: los factores de virulencia y los mecanismos que le confieren una resistencia a toda una serie de compuestos bactericidas y antibióticos, siendo este último el aspecto que se tratará con mayor detenimiento a lo largo de todo el trabajo, así como su conexión con el metabolismo del peptidoglucano y la virulencia de dicho microorganismo [1], [5].
A nivel de patologías, en la siguiente tabla (tabla 3) se exponen algunas de las infecciones más recurrentes que pueden llegar a desarrollarse en los seres humanos (especialmente en los hospitalizados). Dichas patologías no se desarrollan con la misma frecuencia ni representan el mismo porcentaje dentro del grupo de enfermedades ocasionadas por el microorganismo, sino que están se desarrollarán en función del estado previo del paciente [1].
Tabla 3 - Principales infecciones y patologías en los seres humanos desarrolladas por Pseudomonas aeruginosa
ÓRGANO O
SISTEMA AFECTADO INFECCIÓN / PATOLOGÍA
Oído Otitis externa
Otitis externa maligna
Sistema esquelético Osteomielitis, habitualmente derivada de una otitis externa maligna
Piel
Foliculitis
Infección en grandes quemaduras*
Infección de heridas quirúrgicas, úlceras por presión o derivadas de inmovilidad*
Ojo Queratitis, habitualmente ligada al uso de lentillas Endoftalmitis
Aparato respiratorio
Neumonía adquirida en la comunidad Neumonía asociada a ventilación mecánica Infección respiratoria crónica en pacientes de fibrosis quística o enfermedad pulmonar obstructiva crónica Sistema digestivo Peritonitis, habitualmente ligada a cirugías*
Corazón Endocarditis, habitualmente ligada a cirugías*
Sistema circulatorio Bacteriemia, habitualmente derivada del uso de catéteres o de la diseminación de otras infecciones localizadas*
Sistema urinario Infección urinaria, usualmente ligada al uso de sondas*
Se señalan en asterisco las distintas patologías clasificadas como infecciones nosocomiales
Pasando ahora a los distintos factores de virulencia presentes en este microorganismo, cabe decir que este presenta un gran número de ellos (estando estos citados en la tabla 4) los cuales tienen como función el de poder desencadenar todas las vías moleculares necesarias con el fin de provocar la infección y, en consecuencia, la patología y consecuencias clínicas en los sujetos infectados. [1]. Asimismo, sobre estos mismos factores es importante especificar que cada uno de estos se caracteriza por estar implicado en un tipo concreto de patología o efecto patológico inducido, esto a partir de sus distintos y respectivos mecanismos de acción [6].
Tabla 4 – Clasificación de los factores de virulencia presentes en Pseudomonas aeruginosa así como sus respectivos mecanismos de virulencia
FACTOR DE VIRULENCIA MECANISMO DE VIRULENCIA
Adhesinas
Tipo pili Permite la adhesión del microorganismo a las distintas células epiteliales y contribuye a su movilidad
Tipo no pili (LPS)
Permite la adhesión a secreciones mucosas. Puede contribuir a conmociones y shock séptico
Flagelo Contribuye a la motilidad del microorganismo y su adhesión a tejidos Lectina soluble Se relaciona con el desarrollo de patologías respiratorias, sobre todo con las
de carácter crónico
Toxinas
Exotoxina U
Contribuye a la actividad de la fosfolipasa, enzima destructora de las membranas de macrófagos; así como también a la lesión de células epiteliales, bacteriemia y shock séptico
Exotoxina T Bloquea la reorganización del citoesqueleto en fagocitos. La exotoxina S también se caracteriza por contribuir a la necrosis tisular, daño al glucopéptido, vimentina y a otros elementos inmunológicos
Exotoxina S
Exotoxina Y Aumenta [AMPc] en las células del huésped
Exotoxina A Inhibe la síntesis proteica y reduce la actividad fagocitaria, así como también contribuye a la muerte celular y a la necrosis tisular
EstA Esterasa que promueve la síntesis de ramnolípido y a la formación de biofilms por parte de las colonias del microorganismo
LepA Exoproteasa inductora de la activación del factor inductor de la vía de inflamación (NF-kB)
Hcp1 Formador de pequeños conductos en la superficie del microorganismo para la liberación de nuevas toxinas
Proteasas
LasA Inactiva factores inmunológicos solubles, como los del complemento, anticuerpos o péptidos antimicrobianos; sobre todo en el contexto de infecciones pulmonares
LasB Proteasa
alcalina Contribuye a las infecciones corneales
Hemolisinas
Rammolípido Relacionados sobre todo con la patocronia de la fibrosis quística, permiten la hidrólisis del surfactante pulmonar y contribuyen al colapso de los alvéolos La fosfolipasa C también se caracteriza por estar relacionada con patologías pulmonares, especialmente atelectasia pulmonar; así como también juega un papel importante en las infecciones tanto agudas como crónicas
Fosfolipasa C
Sideróforos
Pioverdina Permite el establecimiento de biofilms
Pioquelina Contribuye al daño oxidativo y a la inflamación de los tejidos
Piocianina Compuesto de naturaleza citotóxica
Alginato
Inhibe la acción de los neutrófilos así como también bloquea las vías del complemento. También contribuye al establecimiento de biofilms, sobre todo en patologías respiratorias crónicas, que protegen a la bacteria al dificultar la difusión de componentes inmunitarios y antibióticos.
Volviendo otra vez a los sideróforos, tal como se especificó en párrafos anteriores, es interesante especificar que gracias a investigaciones recientes se ha podido comprobar como estos compuestos permiten una activación dependiente de hipoxia del factor HIF-1alfa en células epiteliales y endoteliales; así como también permite la activación masiva de otros factores, tales como CXCL1 y CXCL2 (quimioatrayentes de neutrófilos) y IL-6 (interleuquina-6), implicados en las vías de señalización típicas del proceso de inflamación. [2] Este hecho, el que podría parecer beneficioso puesto que un estado de inflamación agudo podría frenar la infección, puede llegar a ser perjudicial sí se llega a cronificar y/o dar lugar al reclutamiento excesivo de células inmunes. Gracias a esta inflamación excesiva también puede aparecer daño tisular y coagulación sanguínea diseminada, debido a la concentración masiva de recursos antimicrobianos que pueden llegar a ser lesivos para las células del hospedador, y a la interacción entre ciertos componentes bacterianos y el sistema de coagulación. Todo ello, en conjunto, puede iniciar en los pacientes un caso grave de sepsis y fallo multiorgánico (conocido también como shock séptico), patologías de gran riesgo para la vida de estos pacientes [4].
No obstante, si tenemos que caracterizar a dichos compuestos hidrosolubles por algo verdaderamente importante es por su capacidad de secuestrar el hierro para que este sea accesible al microorganismo.
Obviamente ello se puede considerar como otro factor de virulencia puesto que dicha capacidad es vital para que P. aeruginosa pueda sobrevivir y poder desencadenar las distintas infecciones [7].
Como parte fundamental de su potencial como patógeno e importancia clínica, cabe ahora detallar los diferentes mecanismos de resistencia antibiótica de P. aeruginosa [1], [5]:
• Resistencia intrínseca → Mecanismos de resistencia propios de la expresión constitutiva de toda una serie de genes relacionados con los procesos que le permiten disminuir la eficacia de ciertos antibióticos específicos a través de sus características estructurales y/o funcionales [1], [5]. Se trata, por tanto, del tipo de resistencia ancestral por excelencia de este microorganismo.
Dentro de este grupo podemos encontrar, tal como viene representado en la figura 1, mecanismos clave tales como la reducción de la concentración intracelular del antibiótico en cuestión así como la inactivación directa del mismo.
Respecto a la reducción de la concentración intracelular del antibiótico, este proceso se basa en varios mecanismos concretos tales como la
bombas de eflujo o expulsión de sustancias tóxicas. Dichas bombas se caracterizan por aprovechar varias fuentes energéticas para poder llevar a cabo la expulsión de los compuestos deseados; así como también por estar agrupadas en 5 superfamílias distintas (esto en función de su similtud en la secuencia aminoacídica, la fuente energética requerida y la especificidad hacia los sustratos), siendo estas: ABC (ATP-binding cassette), MATE (multiple antibiotic and toxin extrusion), MFS (major facilitator superfamily), RND (resistance-nodulation-cell-divsion) y SMR (small multidrug resistance) [1].
En su conjunto, estos sistemas de expulsión se caracterizan por afectar, en mayor o menor medida, a la práctica totalidadd de famílias de antibióticos usados en clínicas: asi como también por permitir la eliminación de otros compuestos derivados del metabolismo, caracterizados estos por poder llegar a ser de carácter tóxico.
Figura 1 - Mecanismos de resistencia a agentes antibactericidas pertenecientes al grupo de la resistencia intrínseca de Pseudomonas aeruginosa
Pasando al proceso de inactivación directa de antibióticos, podemos mencionar la síntesis de la cefalosporinasa cromosómica inducible AmpC (intrínseca de P. aeruginosa), no inhibible por los llamados inhibidores de beta-lactamasas clásicos. Se sabe que en condiciones normales esta enzima es expresada a bajos niveles, aunque dicha expresión, a su vez, puede ser inducida de manera reversible ante la presencia de varios compuestos beta-lactámicos, haciendo que el microorganismo confiera una cierta resistencia a dichos compuestos, como por ejemploampicilina, amoxicilina y las cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación (excepto la ceftazidima) [1].
Asimismo, esta enzima volverá a ser comentada más adelante puesto que mantiene una estrecha relación con el proceso de reciclaje del peptidoglucano y la virulencia; siendo esta interconexiónla cuestión central de este trabajo.
• Resistencia adquirida → Mecanismos propios derivados a partir de las mutaciones en genes cromosómicos y la adquisición de otros factores de resistencia a través de procesos típicos conocidos por pertenecer al grupo de la transferencia horizontal [1], [5].
Respecto al primer punto, se conoce que la generación de mutaciones que sean responsables de la adquisición de un mayor grado de resistencia suele darse con bastante frecuencia a lo largo de todo el trascurso de división celular (cada 10^7-10^9 células). La selección positiva o no de las citadas mutaciones dependerá de la presión selectiva ejercida por el potencial antibiótico presente en el medio, pudiendo decir que, en caso de estar presente este, se seleccionará positivamente a la célula que ha acumulado la mutación de resistencia, permitiendo su multiplicación y el consiguiente fracaso terapéutico del tratamiento.
Las distintas mutaciones causantes de dicha resistencia se clasifican en distintos grupos, siendo estos [1]:
1. Mutaciones en la diana del antibiótico: El caso más típico en P. aeruginosa es el de las mutaciones que involucran a los genes codificantes de las enzimas conocidas como topoisomerasas, siendo estas la diana natural de los antibióticos de la familia de las quinolonas. Se sabe que estas mutaciones provocan la alteración de dicha diana y, por consiguiente, los antibióticos no se unen a esta y dejan de ser efectivos
2. Mutaciones en el sistema de regulación de AmpC: Mutaciones que pueden ocurrir en diferentes genes de proteínas participantes en la regulación de esta beta-lactamasa y que desembocan en su hiperexpresión estable, todo ello con el consiguiente incremento en la capacidad de hidrólisis de beta-lactámicos y en su resistencia derivada. Los distintos detalles del sistema de regulación de esta cefalosporina serán abordados más adelante.
3. Mutaciones causantes de la hiperexpresión de bombas de expulsión activa: Mutaciones que tienen lugar en algunos genes reguladores, siendo estas responsables del aumento constitutivo del nivel de expresión de las ya comentadas bombas de eflujo. Como es de suponer, dicho aumento de expresión acaba dando lugar a una mayor expulsión de antibiótico y, por consiguiente, a un aumento en la resistencia derivada del microorganismo. En conjunto, este mecanismo afecta a prácticamente todas las familias de antibióticos anteriormente útiles ante P. aeruginosa, como las quinolonas, beta- lactámicos o aminoglucósidos.
4. Mutaciones reductoras de la permeabilidad de la membrana externa por disminución o ausencia de porinas: Uno de los casos más notorios en este microorganismo es el de las mutaciones que afectan al mecanismo de acción o a la expresión a la porina conocida como OprD, siendo esta porina responsable de la entrada de los antibióticos carbapenémicos (como, por ejemplo, imipinem
y meropenem, caracterizados por ser activos contra este microorganismo al ser estables frente a la hidrólisis producida por AmpC).
Esta pérdida en la expresión y acción de dicha porina da lugar, como es de suponer, un incremento en la resistencia a los carbapenémicos, los cuales al no penetrar en la célula con la misma eficacia ya no pueden llevar a cabo su acción bactericida (que como la de todos los beta-lactámicos, se basa en la inhibición de síntesis y consiguiente destrucción del peptidoglucano).
Por otro lado, la transferencia horizontal se puede definir como el proceso en el cual los microorganismos incorporan fragmentos de ADN exógenos a través de diferentes vectores o mecanismos. Actualmente se conocen hasta 3 formas de integración de fragmentos de ADN exógenos, siendo estos: proceso de conjugación, transducción y transformación (procesos representados en la figura 2).
Para el caso de P. aeruginosa, se sabe que hay dos tipos mayoritarios de enzimas que están relacionadas con la transferencia horizontal, siendo estas las beta-lactamasas y las enzimas modificadoras de aminoglucósidos. En el caso de este trabajo nos centraremos especialmente en las beta- lactamasas, esto debido a que en el marco experimental propuesto se establece el estudio de varias de estas enzimas, caracterizadas por poder ser definidas como enzimas con la capacidad de llevar a cabo la hidrólisis del enlace amida del anillo beta-lactámico para así provocar que los distintos antibióticos pierdan su actividad [3].
Otro aspecto importante a considerar es que, independientemente del mecanismo comentado anteriormente sobre la transferencia horizontal, los distintos genes adquiridos por este microorganismo suelen estar codificados en integrones, siendo estos plataformas de incorporación de genes mediante la acción de las proteínas conocidas como integrasas, caracterizadas estas últimas a su vez por el hecho de que su codificación tiene lugar en el seno del propio integrón. A su vez, los integrones suelen estar formando parte de estructuras genéticas móviles de mayor tamaño, como los transposones y los plásmidos.
El integrón funciona como un elemento de captura de genes de resistencia, pudiendo incorporar multitud de genes uno a continuación del otro. Posteriormente, gracias a la codificación del integrón en estas estructuras móviles, son diseminados horizontalmente. En determinadas ocasiones, los genes de resistencia transferidos horizontalmente acaban por integrarse de forma definitiva en el cromosoma bacteriano, es decir, se transfieren desde un elemento móvil, recombinándose en el genoma de la bacteria, lo cual estabiliza su presencia en la cepa en cuestión, si bien resta posibilidades de diseminación horizontal. Los genes que más habitualmente se codifican en integrones, y que confieren resistencia a P. aeruginosa y otras especies son los de enzimas modificantes de aminoglucósidos (que naturalmente confieren resistencia a esta familia de antibióticos), y las beta-lactamasas, enzimas que hidrolizan a los beta-lactámicos, inactivándolos [1]. Se han descrito multitud de beta-lactamasas diferentes adquiridas horizontalmente en P. aeruginosa, tema que será abordado en el siguiente apartado de esta introducción
Figura 2 - Ejemplos de mecanismos que permiten la transferencia horizontal genética en microorganismos. El proceso de conjugación permite el paso del genoma de un organismo a otro mediante la presencia del llamado pili sexual (A). El proceso de transducción permite la transferencia de ADN exógeno mediante la acción de los virus conocidos como bacteriófagos (B). El proceso de transformación permite la entrada de ADN exógeno, procedente del medio extracelular, en un microorganismo (c)
Por último, aclarar que P. aeruginosa también se caracteriza por presentar un tercer tipo de resistencia conocido como resistencia adaptativa, que es de base metabólica (no genética) y transitoria [1], pero que no será abordada aquí al no presentar una relación directa con el contexto expuesto en este trabajo.
Resistencia a los antibióticos beta-lactámicos mediada por beta-lactamasas en Pseudomonas aeruginosa
Este tipo de resistencia, tal como se ha mencionado en anteriores párrafos, será considerada como la principal a analizar debido a la relación con el marco experimental propuesto. En primer lugar, a modo de introducción, especificar que los antibióticos beta-lactámicos son considerados como los compuestos más usados a la hora de hacer frente al proceso de infección de P. aeruginosa [1]. Asimismo, se caracterizan por ser considerados como el primer grupo de compuestos antimicrobianos descubiertos así como también por tener una doble funcionalidad, esto según la concentración en la que se encuentren: agentes bactericidas de amplio espectro, para dosis suficientes; o agentes bacteriostáticos, en bajas concentraciones [1].
A nivel de funcionalidad principal, este tipo de compuestos se comprometen con la inhibición de la síntesis de la pared celular bacteriana mediante el bloqueo de la última etapa de la síntesis del peptidoglucano; así como también por inducir el proceso autolítico en las células bacterianas [1]. En la actualidad, se conocen hasta un total de 5 grupos distintos de este tipo de antibióticos (penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos, monobactámicos e inhibidores de beta-lactamasas) los cuales se pueden clasificar también según el espectro de microorganismos que abarquen a la hora de llevar a cabo su actividad [1].
Pasando ahora a las beta-lactamasas, estas se consideran (tal como se ha comentado anteriormente) enzimas con la capacidad de hidrolizar el enlace amida del anillo beta-lactámico dando lugar a la generación de compuestos sin actividad antibacteriana [1]. Asi mismo, son proteínas consideradas como un claro ejemplo de adaptación bacteriana y, además, se sabe que los microorganismos tienen la capacidad de regular su expresión para así adaptarse a la presencia o no de los antibióticos anteriormente explicados, dando esto como resultado la aparición de promotores más eficaces así como un gran número de copias del gen codificante de estas enzimas como estrategias, por parte de estos, para aumentar su resistencia a estos antibióticos [1].
A nivel de clasificación (registrada esta en la tabla 5), cabe especificar que actualmente existen ciertos problemas a la hora de realizarla, esto debido al continuo descubrimiento de nuevas enzimas, y esto ha generado que se propongan varias clasificaciones, siendo las más importantes las siguientes expuestas en la tabla inferior (tabla 5) [1], [8]–[10]:
Tabla 5 – Clasificaciones generales más importantes sobre las distintas beta-lactamasas de P. aeruginosa, especificándose los distintos grupos existentes y las características más importantes
CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE
AMBLER
Clasificación que se fundamenta en los mecanismos de interacción enzima- sustrato y la secuencia aminoacídica de dichas enzimas.
En la actualidad, esta clasificación establece la existencia de hasta un total de 4 grupos distintos
A Caracterizadas por tener en su centro activo una serina,
B
Conocidas bajo el nombre de metaloproteasas, necesitan un átomo de zinc en su centro activo C
Enzimas consideradas como cefalosporinasas y por tener una serina en su centro activo
D
Enzimas consideradas como hidrolizantes de oxacilina, necesitan una serina en su centro activo
CLASIFICACIÓN FUNCIONAL
Clasificación enfocada hacia las características como el perfil de sustrato, sensibilidad a inhibidores de beta- lactamasas, la localización precisa cromosómica/plasmídica de los genes codificantes de estas, entre otras.
En la actualidad, esta clasificación establece la presencia de 3 grupos distintos principales, estando estos a su vez divididos en varios subgrupos
1
Enzimas caracterizadas como cefalosporinasas, pertenecientes estas a la clase C, se conoce que son resistentes a la inhibición por el ácido clavulánico así como por tener una elevada afinidad por el aztreonam
Se sabe también que en grandes cantidades pueden dar lugar a resistencia hacia los antibióticos carbapenémicos
2 Enzimas pertenecientes a las clases A y D.
3
Enzimas pertenecientes a la clase B, se caracterizan por poder ser inhibidas por EDTA pero no por ácido clavulánico
Respecto a los distintos antibióticos capaces de hidrolizar cada una de las beta-lactamasas nombradas en la tabla anterior, en la siguiente tabla (tabla 6) se detallan algunos de estos [1].
Tabla 6 – Sustratos diana de la acción de las beta-lactamasas, divididas estas en sus correspondientes grupos, asi como características definitorias a considerar
GRUPOS ANTIBIÓTICOS DIANA
INHIBICIÓN
CARACTERÍSTICAS TZB* EDTA
1
C Cefalosporinas NO
Hidrolizan cefalosporinas y cefamicinas
1e Hidrólisis incrementada de ceftazidima y
oximino-beta-lactámicos 2a
A
Penicilinas
SI NO
Hidrólisis mayor de bencilpenicilinas 2b
Peniclinas y cefalosporinas de primera generación
Hidrólisis similar de bencilpenicilinas y cefalosporinas
2be
Cefalosporinas de espectro extendido y
monobactámicos
Hidrólisis incrementadas de oximino-beta- lactámicos
2br Penicilinas NO Resistencia al ácido clavulánico, sulbactam y TZB
2ber
Cefalosporinas de espectro extendido y
monobactámicos
NO Hidrólisis incrementada de carbenicilina
2c Carbenicilina
SI NO
Hidrólisis incrementada de carbenicilina, cefepima y cefpiroma
2ce Carbenicilina
y cefepima
Hidrólisis incrementada de cloxacilina y oxacilina
2d D
Cloxacilina
Variable NO Hidrolizan cloxacilina, oxicilina y oximino- beta-lactámicos
2de Cefalosporinas de espectro extendido
2df Carbapenémicos
2e A
Cefalosporinas de
espectro extendido SI NO
Hidrolizan cefalosporinas y son inhibidas por ácido clavulánico, pero no por aztreonam
2f Carbapenémicos Variable NO Hidrólisis incrementada de carbapenémicos, oximino-beta-lactámicos y cefamicinas 3a B1
Carbapenémicos NO SI
Hidrólisis de amplio espectro, incluyendo carbapenémicos pero no monobactámicos B3
3b B2 Hidrólisis preferencial de carbapenémicos
*TZB: Tazobactam
Para finalizar el apartado, a continuación se exponen algunas de las beta-lactamasas más conocidas así como sus principales características [1].
Tabla 7 – Ejemplos de beta-lactamasas más conocidas en P. aeruginosa
BETA-LACTAMASA CARACTERÍSTICAS
PSE (Pseudomonas- specific enzyme)
Se caracterizan por hidrolizar preferentemente penicilinas, teniendo con esto un impacto clínico limitado. Se sabe que PSE-1 y PSE-4 son las enzimas de carácter adquirido más comunes en aislados clínicos de cepas de P. aeruginosa resistentes a beta-lactámicos
OXA
Son las que más importancia tienen en el marco del trabajo presentado, puesto que estas son (tal como se comentará más adelante) las propuestas para el estudio y el marco experimental. Son enzimas presentes en una gran multitud de microorganismos y se caracterizan por presentar una inhibición variable ante los compuestos clásicos inhibidores de beta-lactamasas, aunque si pueden ser inhibidas por el cloruro sódico.
Podemos encontrar diversos tipos de estas enzimas, tales como las OXA de espectro extendido como las OXA con actividad carbapenemasa. Respecto a las primeras, estas presentan mínimos cambios en sus secuencias aminoacídicas las cuales les permiten tener un mayor espectro de hidrólisis dando lugar a resistencia frente a las cefalosporinas de tercera y cuarta generación, monobactámicos y penicilinas antipsudomónicas, aunque no a los carbapenémicos. Por otro lado, el segundo tipo se caracteriza por tener una actividad modesta frente a los carbapenémicos.
PER-1
Beta-lactamasa de clase A caracterizada por conferir resistencia hacia el antibiótico ceftazidima, aunque también puede actuar (en menor medida) sobre penicilinas, aztreonam y cefotaxima. Se sabe también que es sensible hacia el ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam
GES (Guiana extended- spectrum)
Beta-lactamasas caracterizadas por diferir en un solo aminoácido, presentan una elevada actividad frente a penicilinas y cefalosporinas de amplio espectro; aunque no son efectivas frente a cefamicinas y carbapenémicos. Se sabe también que pueden ser inhibidas por ácido clavulánico, tazobactam e imipenem
IBC (integron-borne cephalosporinase)
VEB (vietnamese extended-spectrum beta-
lactamases)
Beta-lactamasas de clase A ampliamente conocidas por su actividad frente a los antibióticos ceftazidima, cefotaxima, aztreonam y, en menor grado, penicilinas;
aunque son inhibibles por avibacatam.
BEL
Beta-lactamasas de clase A, tiene la capacidad de hidrolizar la gran mayoría de las cefalosporinas de espectro extendido y aztreonam; aunque puede ser inhibida por ácido clavulánico, cefoxitina, imipinem, tazobactam y moxalactam
PME (Pseudomonas aeruginosa ESBL)
Beta-lactamasa de clase A con la capacidad de hidrolizar los antibióticos ceftazidima, cefotaxima y aztreonam; aunque puede ser inhibida por ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam
Proceso metabólico del peptidoglucano. Estructura, proceso de reciclaje, genes involucrados en dicho proceso y relación con AmpC
Pseudomonas aeruginosa presenta una pared celular compuesta por una membrana externa (a la que se ancla el LPS), una membrana interna (citoplasmática), y entre ellas, el peptidoglucano, estructura esencial para la viabilidad, pues la inhibición de su síntesis o su destrucción conllevan la lisis celular [3].
A nivel de estructura (representada esta en la figura 3), el peptidoglucano es una especie de red semirrígida compuesta por la unión de múltiples cadenas glucídicas lineales formadas a partir de la repetición constitutiva de un monómero, integrado por la unión de los residuos N-acetilglucosamina (NAG) y N-acetilmurámico (NAM) los cuales están unidos por un enlace beta 1-4 [3]. A su vez, dichos monómeros (en concreto el NAM) se encuentran unidos a una cadena lateral formada inicialmente por 5 aminoácidos (L-Ala-D-Glu-DAP-D- Ala-D-Ala).Este pentapéptido se caracteriza por ser sujeto de un proceso denominado transpeptidación [llevado a cabo por las denominadas Penicillin Binding Proteins (PBP)] que permite la unión entre dos cadenas peptídicas, lo que a su vez permite [3].
Volviendo de nuevo a su funcionalidad, se ha visto que esta estructura tiene las siguientes funciones esenciales para la viabilidad bacteriana: [11]
• Mantener la integridad y la estructura de la pared celular, pues la membrana externa se ancla al peptidoglucano mediante ciertas lipoproteínas.
• Definir la forma celular y permitir la resistencia por parte del microorganismo a los cambios de presión osmótica del medio natural, así como también dar lugar a un aumento de la resistencia a la permeabilidad de ciertas moléculas.
• Permitir el anclaje de componentes celulares como flagelo y sistemas de secreción de toxinas
• Participación en los procesos de crecimiento de tamaño y división celular
Figura 3 – Componentes moleculares que dan lugar a la formación del peptidoglucano. Se observa en el recinto amarillo el monómero, unido este a la cadena lateral tetrapeptídica; y, en color rojo, el enlace formado tras el proceso de transpeptidación.
Pasando ahora a los procesos de síntesis y reciclaje del peptidoglucano, cabe comentar que son altamente complejos y que se dan de manera continua durante la vida de la bacteria. Es decir, el peptidoglucano no es una estructura estática, sino altamente dinámica, que necesita remodelarse, es decir, degradarse de forma controlada para permitir el crecimiento celular, división, anclaje de estructuras, etc. y posteriormente ir sintetizándose de novo, y gracias al reciclaje de algunos productos de la mencionada degradación [3], [4].
Así pues, en pocas palabras, el reciclaje del peptidoglucano consiste en reutilizar los muropéptidos (segmentos del peptidoglucano que se forman a partir de su degradación) gracias a su entrada en el citoplasma y a la participación de diversos enzimas que permitirán reincorporar estos fragmentos a las rutas de síntesis del peptidoglucano. Estas enzimas serán comentadas de nuevo en el marco experimental debido a están directamente relacionadas con las cepas a analizar en este estudio [3].
En la nueva tabla inferior (tabla 8) se especifican las enzimas encargadas de la autolisis y el reciclaje de dicha estructura molecular presente en P. aeruginosa; mientras que en figura 4 se muestra, en la estructura del peptidoglucano, las dianas concretas donde tienen lugar la acción de las distintas enzimas especificadas en dicha tabla. [3], [11].
Tabla 8 – Elementos participantes de la degradación y posterior reciclaje del peptidoglucano en Pseudomonas aeruginosa
ENZIMAS ENCARGADAS DE LA DEGRADACIÓN
Glucosaminidasas Contribuyen a la rotura del enlace entre los dos residuos del monómero constitutivo
Amidasas periplasmáticas (AmpDh2 y AmpDh3)
Producen la rotura del enlace entre el residuo NAM y la cadena peptídica
Endopeptidasas Rotura de los enlaces que permiten la unión de las cadenas laterales a través de los péptidos
Transglicosilasas Llevan a cabo la rotura entre los residuos NAM de un monómero y los residuos NAG del siguiente
COMPONENTES ENCARGADOS DEL RECICLAJE
Permeasa AmpG
Permeasa situada en la membrana interna y que permite la entrada de los muropéptidos hacia el citoplasma
Enzima NagZ
Enzima caracterizada por tener una actividad N- acetilglucosaminidasa, lleva a cabo la rotura del residuo NAG para dar lugar con la formación de los compuestos 1,6-anhidroNAM-péptidos
Amidasa AmpD
Encargada de producir la formación de los péptidos libres y del residuo NAM, siendo estos finalmente conducidos hacia la síntesis de nuevo del peptidoglucano
Figura 4 - Dianas del peptidoglucano de las distintas enzimas encargadas de producir su degradación
Figura 5 – Representación global en donde de muestra la relación existente entre el proceso de síntesis.
degradación y reciclaje del peptidoglucano. Se puede observar, en primer lugar, los distintos compuestos participantes en cada uno de los procesos así como el respectivo lugar en donde estos sufren las distintas modificaciones; así como también se muestran las distintas enzimas que participan en los procesos para asegurar que el peptidoglucano siga manteniéndose en un buen estado (Imagen modificada para la adición de nuevos elementos)
Ya para concluir con este apartado, pasar a la relación entre el proceso de reciclaje de esta estructura molecular y la beta-lactamasa cromosómica AmpC, todo ello relacionado a su vez con la virulencia de P.
aeruginosa. En primer lugar, aclarar que los 3 elementos nombrados en la tabla 6 (AmpG, AmpD, y NagZ), son clave en el reciclaje, pero también en la regulación de la expresión de la enzima AmpC, codificada esta por el gen ampC [3]. Dicho gen se encuentra condicionado a la actividad del regulador transcripcional AmpR, siendo este conocido por poder adoptar una conformación activadora o inhibidora en función de la cantidad y naturaleza de muropéptidos libres presentes una vez se ha llevado a cabo el proceso de degradación del peptidoglucano [3].
Así pues, se observa cómo hay dos compuestos concretos (relacionados con los procesos de degradación, reciclaje y síntesis del peptidoglucano) los cuales influyen en la expresión de la beta-lactamasa AmpC, siendo estos el UDP-NAM-pentapéptido y el 1,6-anhdroNAM-péptido [3]. En el caso del primer compuesto, que procede de la síntesis de novo, y está ya preparado para su reincorporación al peptidoglucano, se caracteriza por interaccionar con el regulador transcripcional AmpR e inducir, de esta forma, la inhibición de la expresión del gen ampC; Por otro lado, el 1,6-anhdroNAM-péptido, que es el muropéptido procedente de la remodelación del peptidoglucano por excelencia se caracteriza por ser capaz de unirse también a dicho regulador pero, con una diferencia, y es que da lugar a la inducción de la expresión del gen ampC [3].
Se sabe que en condiciones normales (es decir, en ausencia de antibiótico) la actividad de la amidasa AmpD permite que la concentración de 1,6-anhdroNAM-péptido, precursor de los compuestos que serán utilizados para la nueva síntesis del peptidoglucano sea escasa, hecho que ocasiona que el regulador transcripcional AmpR se una al UDP-NAM-pentapéptido y esto da lugar, en consecuencia, a que el gen ampC sea expresado a nivel muy bajo [3]. La actividad de AmpD, además de actuar como un represor indirecto de ampC, es además esencial para habilitar los pasos siguientes que darán lugar a la síntesis de nuevo peptidoglucano. Es decir, si AmpD queda inactivado, el reciclaje y por tanto la síntesis de novo se ve perjudicada. Ahora bien, cuando la bacteria se encuentra con un antibiótico beta-lactámico el peptidoglucano experimenta serias modificaciones (por inhibición de su síntesis), dando lugar a un aumento masivo de la concentración de 1,6- anhidroNAM-péptido,que no puede ser revertida por la actividad enzimática de AmpD (que queda saturada).
Esto da lugar, finalmente, a que el los 1,6-anhidroNAM-péptidos desplacen a los UDP-NAM-pentapéptidos de la unión con AmpR, adquiriendo este regulador transcripcional una conformación activadora de la expresión de ampC . Ello da lugar, obviamente, a un incremento en la producción de la cefalosporinasa AmpC, degradación del beta-lactámico, y consiguiente incremento en la resistencia de la bacteria[3].
Dicha situación es de carácter transitorio (es decir, al desaparecer el antibiótico beta-lactámico, se volvería a una situación basal), y se da gracias a ciertos tipos de beta-lactámicos, denominados inductores, como por ejemplo la cefoxitina o el imipenem. No obstante, en algunas ocasiones se puede dar lugar a una inactivación mutacional de la amidasa AmpD (hecho que da lugar a un aumento constante del 1,6-anhidroNAM-péptido) que conduce a una hiper-expresión constitutiva de AmpC y consiguiente resistencia a los beta-lactámicos.
Esto se observa, en la mayoría de los casos, en cepas clínicas de P. aeruginosa , en las que la presión selectiva ejercida por los tratamientos antibióticos ha seleccionado positivamente las mencionadas mutaciones inactivantes de AmpD [3].
Ahora bien, aparte de AmpD, en este microorganismo se encuentran también otras dos amidasas conocidas como AmpDh3 y AmpDh2 de ubicación periplásmica, Estas enzimas participan de la degradación del peptidoglucano en el periplasma (efectúan la misma reacción que AmpD en el citosol), y por tanto, suministran péptidos para el reciclaje. Además, también son represores indirectos (al igual que AmpD) de la producción de AmpC, lo cual implica que una triple inactivación de estas amidasas da lugar a una todavía mayor acumulación de 1,6-anhidroNAM-péptidos, y a una todavía mayor producción de AmpC, hasta más de 1000 veces superior a la producción basal, y una consiguiente resistencia de altísimo nivel a los beta- lactámicos[3].
Por último, especificar qué proteínas AmpG y NagZ también juegan un papel importante en la regulación de AmpC: AmpG es la permeasa responsable de la entrada de los distintos muropéptidos al citoplasma y NagZ es responsable de la degradación de los NAG-1,6-anhdroNAM-péptidos a 1,6-anhdroNAM-péptidos. Sólo estos últimos muropéptidos son capaces de incorporarse a las rutas de síntesis del peptidoglucano, y de unirse a AmpR para promocionar la expresión de AmpC. De ahí que AmpG y NagZ sean clave en el reciclaje, pero también en la hiper-producción de AmpC. Es decir, su inactivación mutacional comportaría el bloqueo del reciclaje del peptidoglucano, pero también de la capacidad de hiperproducir AmpC [3].
Todos los aspectos explicados a lo largo de este apartado están representados en la siguiente figura (figura 6) [3].
Antecedentes de nuestro marco experimental. Conexión entre la resistencia a beta-lactámicos, metabolismo del peptidoglucano y virulencia en Pseudomonas aeruginosa
Ya se ha explicado en el anterior apartado como el peptidoglucano, estructura de gran importancia para la viabilidad de P. aeruginosa, no sólo juega un papel clave en el crecimiento del microorganismo sino que también participa en gran medida en la regulación de la expresión de la cefalosporinasa AmpC.
Así mismo, gracias a la toda una serie de estudios realizados por el grupo de investigación del Dr. Marcelo Pérez Gallego se ha podido averiguar cómo la suma de dos factores concretos: I) bloqueo del reciclaje peptidoglucano por la inactivación de los determinados componentes responsables de su reciclaje y II) la Figura 6 – Regulación de la expresión del gen ampC en P. aeruginosa. A) Condiciones normales en que la producción de AmpC se encuentra reprimida por los fragmentos UDP-NAM-pentapéptidos unidos a AmpR. B) Aumento de la concentración del compuesto 1,6-anhidroNAM-péptidos en el citoplasma por la presencia de un antibiótico beta-lactámico dando lugar a la saturación de AmpD y la estimulación de la expresión de AmpC
aeruginosa. Esto se comprobó en la cepa PAO1 de dicho microrganismo (caracterizada esta por presentar una virulencia no muy elevada así como una citotoxicidad nula), mediante su inoculación en el modelo animal invertebrado Galleria mellonella [1], [12] .
Este descenso drástico en la virulencia se atribuyó a motivos energéticos (pues el bloqueo del reciclaje del peptidoglucano implica un obvio malgasto de energía), pero también a una potencial actividad residual de AmpC (que procede evolutivamente de enzimas degradativos de la pared celular) sobre el peptidoglucano de la bacteria, que podría degradarlo en exceso, contribuyendo a su lisis prematura y pérdida de virulencia.
Estos hechos ponen de manifiesto conexiones muy interesantes entre el metabolismo del peptidoglucano, la regulación de AmpC y la virulencia de P. aeruginosa, en las que conviene profundizar, puesto que podrían ser explotables como un punto débil a atacar por futuras terapias para combatir las infecciones por esta especie. [3]
Teniendo en mente todos los aspectos introductorios sobre P. aeruginosa así como también los aspectos más importantes sobre la virulencia y la susodicha relación existente anteriormente comentada, ya podemos proceder a la explicación del marco experimental planteado inicialmente para este estudio.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Una vez hemos detallado que P. aeruginosa es un microorganismo con una elevada resistencia, esto gracias a la presencia de toda una serie de mecanismos, así como también se ha detallado la relación existente entre las vías metabólicas pertenecientes a la síntesis, remodelación y reciclaje del peptidoglucano y la resistencia a beta-lactámicos mediada por AmpC y la virulencia; es hora de pasar a la formulación de las distintas hipótesis y los objetivos correspondientes a nuestro marco experimental propuesto.
En primer lugar, decir que en este marco experimental se pretenderá trabajar con toda una serie de cepas distintas de P. aeruginosa: mutantes knockout en diversos genes implicados en la ruta de regulación de AmpC/metabolismo del peptidoglucano y/o transformantes con plásmidos expresando distintas beta- lactamasas, en concreto, de la familia de las OXA, para así comprobar si presentan una mayor o menor virulencia en comparación a la cepa salvaje (wild-type). Cabe añadir además, que como marcador específico de virulencia se utilizará en este trabajo la capacidad citotóxica de las mencionadas cepas sobre cultivo celular.
Es necesario comentar que para nuestro marco experimental se ha planteado el uso de distintas beta- lactamasas distintas, siendo estas: beta-lactamasa intrínseca AmpC (clase C) y beta-lactamasas tipo OXA (clase D), pudiendo encontrar en este última dos grupos diferenciados los cuales son las beta-lactamasas de espectro reducido, como OXA-2, y beta-lactamasas de espectro ampliado (caracterizadas estas por derivar evolutivamente de la anterior nombrada y por ser capaces de degradar un mayor abanico de beta-lactámicos que su variante originaria), como OXA-144, OXA-161 y OXA 539.
Este diseño experimental propuesto nos permitirá comprobar si existen diferencias basales en cuanto al coste biológico asociado a las beta-lactamasas de clase C en comparación al existente asociado a las beta- lactamasas de clase D; así como también nos permitirá verificar si el hecho de aumentar el espectro de hidrólisis (esto enfocado al uso de las beta-lactamasas de espectro ampliado) tiene verdaderamente un coste biológico en forma de pérdida de virulencia.
Aparte de todo esto, con la realización de este marco experimental se pretende observar el impacto de la expresión de las ya mencionadas beta-lactamasas sobre la virulencia comparando un background wild-type vs background defectivo en diferentes genes implicados en el reciclaje del peptidoglucano, todo ello con la intención de obtener una medida de la importancia de estos procesos para la eficacia biológica, que en nuestro caso vendría representada por la citotoxicidad sobre el cultivo celular, del microorganismo.
Por tanto, podemos decir, a partir de lo escrito, que las hipótesis principales que podemos establecer para nuestro marco experimental son las siguientes:
1. Las cepas de P. aeruginosa que presenten defectos en las rutas de reciclaje del peptidoglucano, esto a través de la inactivación de diferentes genes como ampG, nagZ o ampD-ampDh2-ampDh3, es probable que experimenten cierto descenso en su capacidad citotóxica en comparación con la cepa wild-type;
todo esto dada la importancia que tiene el reciclaje del peptidoglucano para el ahorro energético de la bacteria.
2. Las cepas de P. aeruginosa transformadas con plásmidos multicopia conteniendo diferentes beta- lactamasas clonadas para su hiper-expresión , siendo estas AmpC (clase C), OXA-2, OXA-144, OXA- 166 y OXA 539 (clase D), es probable que experimenten cierto descenso en su capacidad citotóxica en comparación con la cepa wild-type, esto dado al conocido coste biológico que suelen implicar los mecanismos de resistencia a los antibióticos
3. Es muy esperable que, al sumar los dos tipos de circunstancias mencionados (bloqueo del reciclaje y hiperexpresión de beta-lactamasas) conjuntamente en una cepa, la pérdida de citotoxicidad sea mucho más exagerada que en las cepas en las cuales sólo se dé una de las dos circunstancias, lo cual estaría de acuerdo con trabajos previamente publicados ()
4. Es probable que aparezcan diferencias en cuanto al nivel de atenuación de citotoxicidad al comparar las diferentes rutas que se han utilizado para bloquear el reciclaje del peptidoglucano y/o al comparar las distintas beta-lactamasas clonadas. Esto parece plausible dado que, a pesar de que conceptualmente se hable de “bloqueo de reciclaje”, o bien de “hiper-expresión de beta-lactamasas”, existen muchos matices en cuanto a los diferentes genes inactivados para el bloqueo (ampG, nagZ o ampD-ampDh2-ampDh3, pues codifican para enzimas de funciones diferentes), o en las características de las beta-lactamasas de clase C vs clase D (OXA), e incluso dentro de estas últimas, al comparar espectro reducido vs espectro ampliado. Por tanto, es esperable que todo ello tenga cierto impacto sobre la citotoxicidad, y se puedan apreciar diferencias entre cepas.
5. No es descartable que el descenso de virulencia apreciado en trabajos previos (sobre todo aquellos en los que se sustenta la tesis del Dr. Marcelo Pérez Gallego) sobre el modelo invertebrado Gallera mellonella, al sumar el bloqueo de reciclaje más la hiper-expresión de beta-lactamasa, no se traduzca en un descenso apreciable en la citotoxicidad de las cepas. Ello invalidaría a este parámetro como una medida adecuada para estimar la virulencia de P. aeruginosa en el contexto de este trabajo, e implicaría que el mencionado descenso de virulencia general in vivo se debe a otros factores y no a la citotoxicidad directamente.
Pasando ahora a los objetivos, estos presentan relación con las distintas hipótesis formuladas y podemos decir que son:
• Obtención de las distintas cepas transformantes de P. aeruginosa, con los plásmidos multicopia conteniendo las beta-lactamasas clonadas AmpC, OXA-2, OXA-144, OXA-161 y OXA-539, a través del procedimiento de electroporación. Tales transformaciones se llevarán a cabo tanto en la cepa PA14 wildtype, como en diferentes mutantes noqueados en genes implicados en el reciclaje del peptidoglucano (ampG, nagZ o ampD-ampDh2-ampDh3).
• Estudiar la virulencia de cada una de las cepas obtenidas, mediante la determinación de la citotoxicidad sobre cultivo celular de la línea A549.
• Todo ello con el objetivo general de cuantificar el impacto del bloqueo del reciclaje del peptidoglucano (a través de la inactivación de diferentes genes implicados) y de la hiper-expresión de beta-lactamasas de clase C vs D sobre la citotoxicidad de P. aeruginosa. .
MARCO EXPERIMENTAL PROPUESTO
Proceso de transformación génica. Obtención de las cepas del microorganismo deseadas para la realización del marco experimental
El primer paso que se plantea para la realización del marco experimental propuesto es la obtención de las distintas cepas del microorganismo deseadas. Para ello, se utiliza la técnica conocida como electroporación en las distintas cepas, sean wild-type o bien mutantes knockout (previamente obtenidos por el grupo de investigación) en diferentes genes implicados en la ruta del reciclaje del peptidoglucano. A modo de recordatorio, esta técnica se caracteriza por provocar la aparición de múltiples poros a partir de la aplicación de pequeñas descargas eléctricas en la membrana externa de las bacterias con el fin de garantizar la entrada del ADN exógeno. Ahora bien, es importante especificar que para poder aplicar dicha técnica es necesario realizar un procedimiento anterior, que permite predisponer a las células para que sean electrocompetentes, es decir, capaces de resistir la descarga eléctrica e incorporar el ADN exógeno.
Antes de seguir con la explicación de la técnica en cuestión, cabe comentar algunos detalles acerca de la cepa de P. aeruginosa que se plantea usar para este marco experimental. En este caso, la cepa empleada es la cepa tipo PA14 la cual se caracteriza por el hecho de presentar, en comparación con otras cepas, una elevada virulencia (y más en concreto, una elevada citotoxicidad), debido principalmente a la presencia en su genoma de varias islas de patogenicidad que no están presentes en otras cepas, y que sustentan la producción de una elevada cantidad de toxinas citotóxicas (como por ejemplo ExoU) inyectadas en las células del cultivo [13].
Se decidió el uso de esta cepa en contraposición con la previamente utilizada PAO1 [1], pues esta última, al ser muy poco citotóxica, necesita de tiempos de incubación muy largos sobre cultivo celular para apreciar resultados cuantificables. Además éstos serían ciertamente difíciles de interpretar, pues además del efecto de las propias toxinas de la bacteria, la invasión celular y otros mecanismos (como la producción de ciertos sideróforos y proteasas) acabarían también contribuyendo a la muerte del cultivo celular.
Ya para terminar con este apartado, en la siguiente tabla inferior (tabla 9) encontramos las distintas cepas de P.aeruginosa que se han planteado construir y usar en este marco experimental. Cabe decir que los mutantes knockout utilizados fueron previamente construidos por el grupo de investigación, siguiendo el protocolo basado en el sistema cre-lox para la deleción de genes en P. aeruginosa [14].
Tabla 9 - Cepas de P. eruginosa propuestas para el marco experimental así como sus características más importantes
CEPA MICROORGANISMO CARACTERÍSTICAS CEPA PA14
Cepa salvaje de P. aeruginosa caracterizada por presentar una elevada virulencia, principalmente mediada por una potente citotoxicidad
PA14 ΔAG Mutante defectivo en el proceso del reciclaje del peptidoglucano por la inactivación del gen codificante para AmpG
PA14 ΔNz Mutante defectivo en el proceso del reciclaje del peptidoglucano por la inactivación del gen codificante para NagZ
PA14
ΔAmpDΔAmpDh2ΔAmpDh3
Mutante defectivo en el proceso del reciclaje del peptidoglucano, esto debido a que presenta la delección de las amidasas AmpD y AmpDh2-AmpDh3; así como también se caracteriza por presentar una elevada hiperexpresión de la beta-lactamasa AmpC, llegando a ser esta hasta 5000 veces la expresión basal de la cepa salvaje.
Cepa de virulencia muy atenuada en el modelo invertebrado Galleria mellonella, esto al ocurrir los dos fenómenos ya explicados de manera simultánea: bloqueo del reciclaje y hiperproducción de AmpC [1]; pudiendo esperar con todo esto que la cepa presente un gran descenso en citotoxicidad
PA14
ΔAmpDΔAmpDh2ΔAmpDh3ΔAmpC
Mutante obtenido del anterior en el cual se ha deleccionado el gen ampC, esto con el objetivo de mantener el reciclaje del peptidoglucano bloqueado, pero deshabilitando la derivada hiperproducción de AmpC. Como ha perdido dicha hiperexpresión, la cepa recupera la virulencia sobre el anterior modelo invertebrado nombrado respecto de su cepa originaria (cepa superior explicada)
PA14 pUCP24 Cepa salvaje de PA14 conteniendo el plásmido multicopia pUCP24 vacío (a ser utilizada como control), o bien conteniendo las diferentes beta-lactamasas indicadas clonadas, como mecanismo artificial para conseguir una hiper-expresión de las mismas. Naturalmente, en el caso de pUCP-AmpC, la hiper- expresión desde el plásmido se sumaría a la expresión basal intrínseca de la cepa, que en condiciones normales es muy baja.
PA14 pUCP-AmpC PA14 pUCP-OXA-2 PA14 pUCP-OXA-144 PA14 pUCP-OXA-161 PA14 pUCP-OXA-539 PA14 ΔAG pUCP24
Mismo caso anterior comentado, pero este para un background defectivo en el gen codificante de AmpG
PA14 ΔAG pUCP-AmpC PA14 ΔAG pUCP-OXA-2 PA14 ΔAG pUCP-OXA-144 PA14 ΔAG pUCP-OXA-161 PA14 ΔAG pUCP-OXA-539
PA14 ΔNz pUCP24
Ídem, pero este para un background defectivo en el gen codificante de NagZ
PA14 ΔNz pUCP-AmpC PA14 ΔNz pUCP-OXA-2 PA14 ΔNz pUCP-OXA-144 PA14 ΔNz pUCP-OXA-161 PA14 ΔNz pUCP-OXA-539
Cultivos celulares. Mantenimiento y preparación para el proceso de infección
En el caso de este marco experimental, la línea celular propuesta para la infección y determinación de la citotoxicidad de las diferentes cepas de P. aeruginosa es la conocida con el acrónimo A549, correspondiente esta con células procedentes del tejido pulmonar [15]. Se trata de una línea que ha sido ampliamente utilizada en la bibliografía (tal como se registra en las siguientes referencias bibliográficas) como modelo de infección para multitud de especies bacterias [16]–[21]. Respecto a sus características más importantes, en la siguiente tabla inferior (tabla 10) se encuentran anotadas algunas de las más importantes [15]:
Tabla 10 - Características más importantes de la línea celular propuesta a ser usada en el marco experimental
ORGANISMO
ORIGEN Homo sapiens
TEJIDO Epitelio de los alvéolos pulmonares TIPO CELULAR Neumocitos tipo II
LÍNEA CELULAR
DE ORIGEN Cultivo primario PATOLOGÍA Carcinoma
CARIOTIPO
Células humanas hipotriploides con un número total de 66 cromosomas, aunque pueden encontrarse casos de células con un número total de 64, 65 y de 67 cromosomas
Respecto al manejo de esta línea celular se deben distinguir dos procedimientos: el primero sería el mantenimiento rutinario de los cultivos incluyendo los pases necesarios para evitar la excesiva confluencia celular (para lo cual se utilizarán botellas de cultivo celular de 175 cm2), y el segundo será aquel destinado a la obtención de diluciones de células adecuadas para proceder con el posterior proceso de infección, ensayo que será llevado a cabo en placas de 24 pocillos.
El medio de cultivo celular rutinario y para pases a botellas o a placas de pocillos, se denomina “medio de mantenimiento”, siendo su base el medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 de la casa Biowest, sin rojo fenol como indicador de pH, para no interferir con los posteriores ensayos de determinación extracelular de lactato deshidrogenasa (LDH), usada como marcador de citotoxicidad. El resto de componentes que se añaden para obtener el medio de mantenimiento completo se muestran en la Tabla 11.
Tabla 11– Aditivos y su concentración final presentes en la composición del medio de mantenimiento RPMI 1640 usado rutinariamente para el cultivo de la línea A549
MEDIO MANTENIMIENTO HEPES, 10 mM
ATB (antibiótico-antifúngico comercial), 1x SFB (suero fetal bovino), 10%
Glutamina, 2 mM
Como será detallado a continuación, en el momento de llevar a cabo la infección de los cultivos celulares, las células de P. aeruginosa se suspenderán en un medio ligeramente modificado, que se denomina “medio de infección”. Éste constará de los mismos componentes que el medio de mantenimiento, a excepción de la mezcla comercial de antibiótico que no será añadida, para así evitar la muerte de la bacteria.
