TRABAJO DE FIN DE GRADO
IMPACTO DEL BLOQUEO DEL RECICLAJE DEL PEPTIDOGLICANO Y LA EXPRESIÓN DE BETA- LACTAMASAS DE CLASE D SOBRE LA CAPACIDAD DE INVASIÓN CELULAR DE
Pseudomonas aeruginosa
Daniel García Cuaresma
Grado de Bioquímica Facultad de Ciencias
Año Académico 2020-21
IMPACTO DEL BLOQUEO DEL RECICLAJE DEL PEPTIDOGLICANO Y LA EXPRESIÓN DE BETA- LACTAMASAS DE CLASE D SOBRE LA
CAPACIDAD DE INVASIÓN CELULAR DE
Pseudomonas aeruginosa
Daniel García Cuaresma
Trabajo de Fin de Grado Facultad de Ciencias
Universidad de las Illes Balears
Año Académico 2020-21
Palabras clave del trabajo:
Pseudomonas aeruginosa, peptidoglicano, β-lactamasas, virulencia, invasividad celular, tasa de crecimiento bacteriano
Nombre Tutor/Tutora del Trabajo Dr. Carlos Juan Nicolau
Se autoriza la Universidad a incluir este trabajo en el Repositorio Institucional para su consulta en acceso abierto y difusión en línea, con fines exclusivamente académicos y de investigación
Autor Tutor Sí No Sí No
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ÍNDICE Página
1. RESUMEN/ABSTRACT --- 2
2. INTRODUCCIÓN --- 3
2.1 Características generales de Pseudomonas aeruginosa --- 3
2.2 Estructura y metabolismo del peptidoglicano en Pseudomonas aeruginosa --- 4
2.3 Relevancia clínica de Pseudomonas aeruginosa --- 7
2.4 Resistencia a antibióticos β-lactámicos en Pseudomonas aeruginosa --- 8
2.4.1 Resistencia a β-lactámicos mediada por AmpC en P. aeruginosa--- 10
2.4.2 Resistencia a β-lactámicos por adquisición horizontal en P. aeruginosa --- 13
2.5 Relación entre peptidoglicano, producción de β-lactamasas y virulencia. --- 17
3. ANTECEDENTES, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS --- 19
4. MATERIALES Y MÉTODOS --- 20
4.1 Cepas bacterianas --- 20
4.2 Línea celular --- 20
4.3 Soluciones y medios de cultivo --- 21
4.4 Cultivos celulares: Mantenimiento y preparación para la infección --- 21
4.5 Ensayo de infección --- 22
4.6 Ensayo de crecimiento bacteriano --- 24
4.7 Análisis estadístico --- 24
5. RESULTADOS --- 25
6. DISCUSIÓN--- 27
7. CONCLUSIONES --- 29
8. BIBLIOGRAFÍA --- 30
1. RESUMEN
Pseudomonas aeruginosa es uno de los patógenos nosocomiales más relevantes, así como una de las principales causas de infección respiratoria crónica, con una gran importancia clínica debido a su elevado nivel de resistencia a los antibióticos. Actualmente, la creciente escasez de fármacos antipseudomónicos efectivos hace que sea imprescindible el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, entre ellas, aquellas destinadas a la reducción de su patogenia (terapias anti- virulencia). En estudios previos se ha observado como la combinación de i) expresión de β- lactamasas de clase D adquiridas horizontalmente y ii) bloqueo del reciclaje del peptidoglicano a través de la inactivación de la permeasa AmpG, conlleva una clara pérdida de virulencia de P.
aeruginosa sobre modelo invertebrado. A través de este trabajo se pretendió determinar si esta disminución de virulencia se correlaciona con una menor tasa de invasión celular, y al mismo tiempo ver cómo afectan las particularidades de cada β-lactamasa de clase D testada (OXA-2, OXA- 161, OXA-224 y OXA-539) a este parámetro y a la tasa de crecimiento bacteriano. Los resultados obtenidos en este trabajo indican que la expresión de β-lactamasas de clase D (a excepción de OXA- 539) en P. aeruginosa defectiva en el reciclaje del peptidoglicano provoca, en términos generales, una disminución de la capacidad invasiva sobre la línea celular A549, que se puede correlacionar con su pérdida de virulencia en modelo invertebrado. A pesar de que no se descarta que otros factores puedan contribuir a esta citada atenuación, nuestros resultados pueden ser muy útiles para el diseño de futuras terapias anti-virulencia contra P. aeruginosa.
1. ABSTRACT
Pseudomonas aeruginosa is one of the most relevant nosocomial pathogens and one of the main causes of chronic respiratory infections, showing high clinical importance due to its high level of antibiotic resistance. Currently, the growing shortage of effective antipseudomonal drugs makes essential the development of new therapeutic strategies, including those aimed at reducing its pathogenesis (anti-virulence therapies). In previous studies it has been shown that the combination of i) expression of horizontally acquired class D β-lactamases and ii) blockade of peptidoglycan recycling through the inactivation of AmpG permease, leads to a clear virulence loss of P. aeruginosa over invertebrate model. Through this work we sought to determine if this virulence attenuation is correlated with a lower rate of cell invasion and ascertain how the particularities of each class D β- lactamase tested (OXA-2, OXA-161, OXA-224 and OXA-539) may affect this parameter and the bacterial growth rate. Our results indicate that the expression of class D β-lactamases (excepting OXA-539) in a peptidoglycan recycling-defective P. aeruginosa strain causes, in general terms, a decrease in the invasive capacity over the A549 cell line, that can be correlated with its loss of virulence over invertebrate model. Although other factors may contribute to this mentioned attenuation, our results can be very useful for the design of future antipseudomonal anti-virulence therapies.
2. INTRODUCCIÓN
2.1. Características generales de Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa es un bacilo Gram-negativo no formador de esporas, con una longitud de entre 1,5-5 μm y una anchura entre 0,5-1 μm, que suele poseer un flagelo polar que le proporciona movilidad (1). Taxonómicamente se clasifica de la siguiente manera (Tabla 1):
Tabla 1 - Clasificación taxonómica de P. aeruginosa. Fuente: (2)
Filo Proteobacteria
Clase Gammaproteobacteria
Orden Pseudomonadales
Familia Pseudomonadaceae
Género Pseudomonas
Especie Pseudomonas aeruginosa
Metabólicamente se trata de un microorganismo muy versátil, pudiendo utilizar una gran diversidad de compuestos orgánicos como fuente de energía y de carbono. Se trata de un organismo aerobio estricto que requiere del uso del oxígeno como aceptor final de electrones, si bien es cierto que en condiciones anaerobias es capaz de utilizar el nitrógeno como aceptor final alternativo. Es oxidasa y catalasa positivo, y es incapaz de fermentar la lactosa. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37 ºC, aunque también puede crecer en rangos de temperatura entre los 4 ºC-42 ºC (3).
Sus colonias suelen ser aplanadas y grandes, con un borde característico en forma de sierra y un olor dulzón (3). A pesar de ser este el aspecto habitual de las colonias de P. aeruginosa, existen otras variantes como las llamadas colonias puntiformes o SCV (small colony variant, por sus siglas en inglés) que muestran una tasa de crecimiento por debajo de la normal. Las SCV frecuentemente se aíslan de infecciones pulmonares crónicas tales como aquellas asociadas a los pacientes con patologías respiratorias subyacentes como la fibrosis quística (FQ) y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (4).
Pseudomonas aeruginosa produce sideróforos, que son moléculas que le permiten capturar el hierro libre presente en el medio, y que por tanto son esenciales para su supervivencia. Un ejemplo es la pioverdina, que además otorga a P. aeruginosa una coloración amarillenta-verdosa típica, que al ser excitada con luz UV emite fluorescencia. P. aeruginosa también puede secretar otros pigmentos como la piocianina (azulada), la piomelanina (marrón) o la piorubina (rojiza). La producción de pigmentos, sin embargo, no es una característica general para todas las cepas, y de hecho, es habitual que los aislados procedentes de infecciones crónicas no produzcan pigmentos, lo cual se ha interpretado como una ventaja adaptativa al nicho de la infección respiratoria crónica como la causada en pacientes con FQ o EPOC, de forma similar a la citada adaptación resultante en fenotipos SCV (5). El genoma de una de las cepas de referencia de esta especie, PAO1, se encuentra secuenciado desde el año 2000. Es un genoma muy complejo compuesto por 6,3 millones de pares
de bases que contiene alrededor de 5.500 marcos abiertos de lectura (ORF), de la mayoría de los cuales se desconoce su función. Entre aquellos de los que sí se sabe su papel, destacan multitud de genes pertenecientes a sistemas de regulación (como los sistemas de quorum sensing, que controlan gran variedad de procesos metabólicos en función de las condiciones ambientales), así como otros que codifican para un amplio abanico de factores de virulencia [síntesis del lipopolisacárido (LPS), sistemas de secreción de toxinas, proteasas, fimbrias y pili, etc.], que posibilitan su estilo de vida patogénico e importancia clínica. La gran complejidad de su genoma se refleja además en la capacidad de P. aeruginosa para desarrollar resistencia a los antibióticos, y de hecho, esta es una de las principales características de esta especie (6). Actualmente se dispone de multitud de genomas secuenciados de cepas de P. aeruginosa y otras especies de dicho género, a los que se puede acceder libremente desde el dominio web: www.pseudomonas.com.
Pseudomonas aeruginosa es un organismo ambiental común que presenta una gran capacidad de supervivencia en condiciones fisicoquímicas adversas, lo que le permite colonizar multitud de nichos ecológicos ambientales así como los seres vivos, si bien es cierto que prolifera con más facilidad en hábitats con cierto grado de humedad. Es por ello por lo que podemos encontrarla en multitud de ambientes terrestres y acuáticos (plantas, frutas, el propio suelo, ríos y lagos…) así como en ambientes domésticos (piscinas, baños y duchas) y hospitalarios (sistemas de ventilación, equipos de respiración asistida, soluciones de limpieza...) (7). De hecho, es uno de los principales patógenos oportunistas nosocomiales, aspecto que se abordará más adelante.
2.2. Estructura y metabolismo del peptidoglicano en Pseudomonas aeruginosa
Los microorganismos Gram-negativos como P. aeruginosa poseen una pared celular (Figura 1) constituida por la membrana citoplasmática, que está rodeada por un fina capa de peptidoglicano (PGN, situado en el periplasma), y una membrana externa anclada al propio PGN, formada por fosfolípidos y proteínas, en la cual se halla fijado el Lipopolisacárido (LPS).
Figura 1. Estructura de la pared celular de los microorganismos Gram-negativos. Imagen extraída de fuente web: https://curiosoando.com/que-es-una-bacteria-gram-negativa
El PGN es una macromolécula formada por cadenas glucídicas lineales de disacáridos de N- acetilglucosamina (NAG) y N-acetilmurámico (NAM), unidos mediante enlaces β-1,4. Estas cadenas lineales, situadas paralelamente, se enlazan entre sí a través de pentapéptidos laterales [L-alanina – D-glutamato – ácido meso-diaminopimélico (DAP) – D-ala – D-ala] unidos al NAM, que a su vez se enlazan a los péptidos laterales de otras cadenas glucídicas, formándose así una estructura reticular muy resistente (Figura 2B). Esta estructura, cuya unidad monomérica se considera el disacárido- pentapéptido (Figura 2A), sirve para conferir forma a la bacteria, así como para permitir el anclaje de la membrana externa y de estructuras como el flagelo y los sistemas de secreción de toxinas. Además, otorga resistencia a la bacteria ante la presión osmótica (4).
Figura 2. Estructura del Peptidoglicano. A) unidad estructural básica del PGN, el disacárido-(NAG-NAM)- pentapéptido. B) Puntos de corte de las principales endolisinas bacterianas sobre la estructura del PGN.
Imagen extraída de: (8).
De forma muy resumida, para la construcción de esta estructura en el periplasma, son esenciales las PBP (Penicillin Binding Proteins por sus siglas en inglés). Algunas de ellas presentan actividad glicosil- transferasa, que permite la adición de nuevas unidades de disacárido-pentapéptido a las cadenas glucídicas a partir de un intermediario, el Lípido II (Figura 3), procedente de la síntesis en el citosol.
Por otro lado, la generación del mencionado enlace entre las cadenas de pentapéptidos laterales, se denomina transpeptidación (o cross-linking) y en Gram-negativos suele darse entre el DAP de un péptido y la D-ala de la cuarta posición del péptido contiguo, gracias a PBPs con actividad carpoxipeptidasa y transpeptidasa.
El PGN no es una estructura estática sino dinámica, que durante el ciclo de vida de la bacteria deberá remodelarse, posibilitando por ejemplo su crecimiento en tamaño o su división. Además, deberá sufrir degradaciones puntuales para permitir el ensamblaje de estructuras como los citados sistemas de secreción y flagelos. De hecho, se calcula que aproximadamente un 50% del PGN de los Gram- negativos se degrada en cada generación para facilitar estos procesos. En esta degradación controlada participan diferentes enzimas conocidas genéricamente como auto o endolisinas o hidrolasas. Entre ellas podemos destacar aquellas con actividad endopeptidasa, que permiten la lisis de los enlaces de cross-linking; las transglicosilasas líticas, que escinden los enlaces entre el NAM de una unidad de disacárido y la NAG del disacárido adyacente (dando lugar a un anillo 1,6-anhidro- NAM); las N-acetil-glucosaminidasas, que escinden los enlaces entre NAG y NAM de una misma
unidad de disacárido, y las amidasas, que escinden el enlace entre NAM y la cadena peptídica lateral (Figura 2) (9,10). Obviamente, estos procesos de degradación y remodelación están estrechamente regulados, pues una excesiva activación de estas hidrolasas (o una actividad degradativa no compensada con una correcta síntesis, como causan los β-lactámicos) daría lugar a un PGN debilitado que desembocaría en lisis por presión osmótica.
Figura 3. Rutas para la biosíntesis y el reciclado del PNG. Imagen extraída de: (4)
Durante este proceso degradativo, se estima que únicamente el 10% de los fragmentos generados son desechados y liberados al medio externo. Así pues, la gran mayoría (≈90%) de los fragmentos derivados de esta degradación (genéricamente conocidos como muropéptidos), son internalizados al citoplasma, donde seguirán una vía de reciclaje (Figura 3), que contribuirá al ahorro energético al no tener que sintetizarse de novo todo el material degradado. Si bien es cierto que como resultado de este proceso degradativo se genera un amplio abanico de fragmentos diferentes en el periplasma (incluyendo NAG libre, NAM libre y péptidos/aminoácidos libres), el segmento que se libera en gran mayoría son los NAG-1,6-anhidro-muropéptidos. Así, el proceso de reciclaje comienza con el transporte de estos NAG-1,6-anhidro-muropéptidos al citoplasma a través de la permeasa específica AmpG. Una vez en el citoplasma, estas unidades son procesadas por diferentes enzimas como NagZ, una β-N-acetilglucosaminidasa que escinde las unidades de NAG, produciendo los 1,6- anhidromuropéptidos, que son procesados a continuación por la amidasa citosólica AmpD, obteniéndose péptidos, NAM y NAG libres. Finalmente, todos estos compuestos se reincorporan, a través de diferentes reacciones, a las rutas biosintéticas del PGN hasta conformar el lípido II, última unidad previa a la incorporación de nuevos disacáridos-pentapéptidos al PGN. Un intermediario anterior a este lípido II muy importante por las implicaciones en relación a la resistencia, es el UDP- NAM-pentapéptido, pues como se verá, este proceso de degradación/reciclaje del PGN también está íntimamente ligado a la resistencia a β-lactámicos y a la virulencia (11,12).
2.3. Relevancia clínica de Pseudomonas aeruginosa
A pesar de su origen ambiental, la evolución ha hecho de P. aeruginosa uno de los más importantes patógenos oportunistas y principales causantes de infecciones intrahospitalarias, aunque también puede causar, con poca frecuencia, algunas infecciones a nivel comunitario. De hecho, no suele infectar a personas inmunocompetentes o a los tejidos sanos, sino que es necesario un descenso de la función inmunológica, por ejemplo una neutropenia, para que la invasión e infección tenga éxito.
La pérdida de la integridad epitelial también permite la entrada del patógeno a regiones corporales estériles, hecho habitualmente ligado a la aplicación de tratamientos invasivos como cirugías, catéteres venosos, sondas urinarias o intubaciones ligadas a la respiración asistida (13).
El amplio abanico de infecciones en las que más frecuentemente se ve implicada P. aeruginosa se expone en la Tabla 2. P. aeruginosa es de hecho el principal agente causal de la neumonía asociada a la ventilación mecánica (NAV), infección cuya incidencia es de aproximadamente 10 casos por cada 1.000 días de ventilación, pudiendo afectar hasta a un 40% de los pacientes intubados. Al asociarse habitualmente P. aeruginosa con amplios perfiles de resistencia antibiótica, es frecuente el fracaso terapéutico, alcanzando la NAV causada por este patógeno altas tasas de mortalidad de hasta el 40%
(14,15).
La patogénesis de este microorganismo es multifactorial, ya que no hay un único factor al que se le pueda atribuir su virulencia. La mayoría de las cepas son citotóxicas y/o invasivas ya que producen en su superficie factores de virulencia que permiten la adhesión, colonización e invasión de tejidos, además de secreciones (toxinas y proteasas) que dañan a las células epiteliales e inmunitarias e inducen la secreción de citoquinas inflamatorias. Entre estos factores de virulencia destacan el flagelo, diferentes adhesinas, la exotoxina A, las enzimas proteolíticas LasA y LasB, y el alginato (parte fundamental de los biofilms), entre otros muchos. Estos factores permiten a la bacteria adherirse y dañar los tejidos del huésped para facilitar la diseminación de la infección, pero también perjudicar su respuesta inmune (tanto celular como humoral), con la misma finalidad (13).
Por otra parte, la infección crónica en pacientes con FQ o EPOC es también una de las principales características de P. aeruginosa, que parece haberse adaptado a la perfección a un hábitat tan particular como el representado por las vías respiratorias de estos pacientes. Para causar estas infecciones, P. aeruginosa crece en forma de biofilms (biopelículas). La formación de estas biopelículas bacterianas, formadas principalmente por secreciones de exopolisacáridos como el alginato, confiere a la bacteria un mecanismo de adaptación al dificultar la difusión de antibióticos y componentes del sistema inmune. Así pues, a lo largo del proceso crónico P. aeruginosa va acumulando mutaciones adaptativas (pérdida de capacidad de estimulación del sistema inmune para pasar desapercibida, menor tasa de crecimiento, híper-producción de alginato, mutaciones ligadas a la resistencia antibiótica, etc.) causando una infección crónica prácticamente imposible de erradicar (16).
Tabla 2 - Principales infecciones causadas por P. aeruginosa en el ser humano. Fuente: (4)
Zona anatómica afectada Infección
Infecciones comunitarias
Piel Foliculitis
Oído Otitis externa; Otitis externa maligna (OEM)
Huesos Osteomielitis (derivada de una OEM)
Ojos Queratitis y Endoftalmitis (asociadas al uso de lentillas), Pulmón Neumonía adquirida en la comunidad; Infección crónica en FQ y EPOC Corazón Endocarditis (asociada al consumo de drogas por vía parenteral)
Infecciones nosocomiales (intrahospitalarias)
Piel Infección en grandes quemaduras; Infección en heridas quirúrgicas, úlceras (por presión o inmovilidad)
Pulmón Neumonía asociada a ventilación mecánica (NAV) Corazón Endocarditis (habitualmente asociada a cirugías) Peritoneo Peritonitis (habitualmente asociada a cirugías) Sistema urinario Infección urinaria (asociada al uso de sondas)
Sangre Bacteriemia, sepsis y shock séptico (asociados al uso de catéteres, o a la diseminación sistémica de una infección inicialmente localizada)
2.4. Resistencia a antibióticos β-lactámicos en Pseudomonas aeruginosa
Los β-lactámicos son un grupo de agentes bactericidas de amplio espectro, que constituyen la familia de antibióticos más usados en clínica, y que fueron desarrollados a partir del descubrimiento de la penicilina por Alexander Fleming en 1928, cuando al estudiar cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus contaminados por hongos, observó un halo de inhibición de crecimiento de la bacteria alrededor de dicho hongo (Penicillium notatum).
Químicamente son un grupo heterogéneo de compuestos que tienen como nexo común la presencia de un anillo β-lactámico o un azetidín-2-ona en su estructura, que al unirse a diferentes radicales adquieren diferentes perfiles de actividad antimicrobiana. Los β-lactámicos actúan inhibiendo la correcta síntesis y estructuración del PGN al unirse a ciertas PBPs deshabilitándolas principalmente para la transpeptidación, desequilibrando así la balanza síntesis-degradación, hacia la lisis bacteriana mediada por endolisinas. Entre los principales β-lactámicos encontramos: penicilinas [clasificadas en aminopenicilinas (p. ej.: amoxicilina y ampicilina), isoxazólicas (p. ej.: oxacilina) y ureidopenicilinas o penicilinas anti-pseudomónicas (p. ej.: piperacilina), entre otras], cefalosporinas (cronológicamente se han generado de la 1ª a la 5ª generación, con cada vez mayor espectro de acción), monobactámicos (p. ej.: aztreonam) y carbapenémicos (p. ej.: imipenem y meropenem) (17).
Se pueden distinguir dos tipos de resistencia a antimicrobianos en general (y a β-lactámicos en particular) en P. aeruginosa , y de hecho en toda bacteria (18):
1. Resistencia intrínseca: viene dada de forma innata en la bacteria, a través de la expresión constitutiva de genes cromosómicos de resistencia. Ello ha permitido a P. aeruginosa adaptarse primero a los antibióticos naturales producidos por hongos en el medio ambiente, y posteriormente al estilo de vida de patógeno hospitalario, al poder desarrollar resistencia también a los β-lactámicos de uso clínico. La resistencia intrínseca a los β-lactámicos de P.
aeruginosa se basa en:
• Inactivación enzimática de los β-lactámicos: P. aeruginosa expresa de forma innata la β-lactamasa cromosómica AmpC, que confiere resistencia a diversos β-lactámicos al degradarlos en el periplasma. Esta degradación consiste en la hidrólisis del enlace amida del anillo β-lactámico, dejándolo sin actividad. Así pues, la resistencia intrínseca a β-lactámicos de P. aeruginosa se debe principalmente a la expresión basal-inducible de AmpC (cuyas bases mecanísticas serán abordadas más adelante).
Esta expresión natural de AmpC permite a P. aeruginosa obtener resistencia a la mayoría de penicilinas (excepto las antipseudomónicas) y cefalosporinas de hasta 3ª generación (excepto ceftazidima) (19).
• Reducción de la concentración intracelular del antibiótico: P. aeruginosa aprovecha los mecanismos de transporte activo en su membrana, como las bombas de eflujo expresadas de forma natural, para la expulsión de prácticamente todas las familias de antibióticos. Entre las principales bombas de eflujo de P. aeruginosa se encuentran MexAB-OprM, MexEF-OprN, MexCD-OprJ y MexXY-OprM (20).
2. Resistencia adquirida: es la que la bacteria adquiere durante su vida a través de distintos mecanismos y cuya fuerza ejecutora es la presión selectiva producida por el uso de los antibióticos. Entre los mecanismos responsables encontramos:
• Selección de mutaciones en genes cromosómicos: Puede dar lugar a distintos fenómenos, como i) la alteración de la secuencia aminoacídica/estructura de la diana de los antibióticos, como es el caso de ciertas PBPs, reduciendo la afinidad del β- lactámico por su diana, y por tanto su efectividad; ii) alteraciones en proteínas implicadas en la regulación de AmpC, dando lugar a una híper-producción estable de esta β-lactamasa (hasta cientos de veces por encima de la expresión basal), ampliando el espectro de resistencia a todas las penicilinas, monobactámicos, ceftazidima y cefalosporinas de 4ª generación (cefepime); iii) mutaciones causantes de hiperexpresión constitutiva de las citadas bombas de eflujo en la membrana incrementando el nivel de expulsión de antibióticos; iv) mutaciones causantes de pérdida de porinas por las que de forma normal entraría el antibiótico, siendo OprD el ejemplo típico, causando resistencia a imipenem (21).
• Adquisición horizontal de genes de resistencia: A través de la presencia de elementos móviles tales como transposones o plásmidos que permiten el salto de material genético entre cepas de la misma especie o incluso especies diferentes.
Principalmente, este fenómeno está representado en P. aeruginosa por la adquisición de β-lactamasas y de enzimas modificadores de aminoglucósidos, codificados en plataformas génicas denominadas integrones (4).
2.4.1. Resistencia a β-lactámicos mediada por AmpC en Pseudomonas aeruginosa: regulación de la β-lactamasa y relación con el metabolismo del peptidoglicano
El anteriormente mencionado proceso de reciclaje del PGN en P. aeruginosa y en otros microorganismos Gram-negativos, muestra una estrecha conexión con la regulación de la expresión de β-lactamasas intrínsecas, como es la cefalosporinasa cromosómica AmpC (22). Parece ser que el punto de interconexión entre estos dos fenómenos se basa en la detección del daño a la pared celular: al producirse un deterioro en la misma por la presencia de antibióticos β-lactámicos, los microorganismos han establecido una relación bioquímica entre los fragmentos procedentes de la destrucción del PGN y la activación transitoria de un mecanismo de resistencia inducible, como es AmpC. En condiciones basales (ausencia de β-lactámico) la expresión de AmpC es muy baja, lo cual supone un ahorro energético pues al no haber agresión por parte de un β-lactámico, sería inútil expresar un mecanismo de resistencia. Sin embargo, en presencia de ciertos β-lactámicos conocidos como inductores (ej.: cefoxitina), la expresión del gen ampC aumenta considerablemente de forma transitoria, llegando hasta unas 50 veces la expresión basal con el consiguiente incremento de hidrólisis y resistencia al agente inductor. Si bien es cierto que no se conoce en profundidad qué bases moleculares sustentan el hecho de que algunos β-lactámicos sean inductores de AmpC y otros no (ej.: ceftazidima, cefepime, aztreonam, penicilinas anti-pseudomónicas, etc.), parece ser que el perfil diferencial de PBPs inhibido por cada antibiótico da lugar a diferencias cuali/cuantitativas en los fragmentos liberados desde el PGN a partir de la acción de las autolisinas. Estas diferencias en los muropéptidos liberados serían las que posibilitarían una expresión diferencial de ampC, a través de los mecanismos que se verán a continuación. Así pues, P. aeruginosa muestra resistencia intrínseca a aquellos antibióticos que son inductores de ampC y a la vez sensibles a su hidrólisis, como ciertas penicilinas y cefalosporinas de 1ª y 2ª generación. En estos casos, la expresión basal no basta para conferir resistencia, pero al estar transitoriamente híper-producida, AmpC acaba hidrolizando a estos fármacos (4). En cualquier caso, los principales componentes que regulan la expresión basal/inducida de ampC se reflejan en la siguiente tabla (Tabla 3).
Tabla 3 - Principales componentes que participan en la vía de reciclado del PGN así como en la regulación de AmpC. NAG: N-acetilglucosamina; PGN: peptidoglicano; NAM: ácido N- acetilmurámico. Fuente: (4)
Componente Descripción
PBP4
Proteína fijadora de penicilina de bajo peso molecular codificada por dacB. Actúa como un sensor de daño de la pared por presencia de β-lactámicos inductores: estos bloquean a dicha proteína lo que desemboca en una mayor liberación de muropéptidos procedentes de la degradación del PGN, y en una consiguiente hiperproducción de AmpC mediada por AmpR.
AmpG Permeasa específica que transporta los NAG-1,6-anhidro-muropéptidos procedentes de la degradación del PGN hacia el citoplasma bacteriano.
NagZ
Glucosaminidasa que procesa los NAG-1,6-anhidro-muropéptidos una vez han entrado en el citoplasma bacteriano. Como resultado de su acción se generan unidades de NAG y 1,6- anhidromuropéptidos libres.
AmpD
N-acetilmuramil-L-alanina amidasa citoplasmática que actúa sobre el enlace entre el péptido y el NAM de los 1,6-anhidromuropéptidos, hidrolizándolo, permitiendo la entrada de estos componentes en las rutas de reciclaje.
AmpR
Regulador transcripcional de la familia LysR que controla la expresión de ampC. Es fundamental en la inducción/represión de la producción de la β-lactamasa AmpC al adoptar diferentes conformaciones cuando se une a productos de degradación/síntesis del PGN.
Algunos de estos componentes ya han sido mencionados previamente en el contexto del reciclaje del PGN, haciéndose evidente una vez más la estrecha relación entre estos dos procesos. Así pues, en ausencia de mutaciones, la expresión diferencial de ampC se desarrolla en dos condiciones (4) (Figura 4):
Figura 4. Representación esquemática del mecanismo de regulación de la expresión de ampC en P. aeruginosa en dos situaciones: A) En condiciones basales; B) En presencia de un β-lactámico inductor. Imagen extraída de:
(4). Cuadrado azul: NAG–1,6-anhidro-muropéptido; Triángulo naranja: 1,6-anhidromuropéptido; hexágono verde: NAM; círculo gris: péptido libre; estrella azul: UDP-NAM-pentapéptido.
• Condiciones basales: los NAG–1,6-anhidro-muropéptidos del espacio periplasmático procedentes de la degradación basal del PGN llegan al citoplasma a través de AmpG. Una vez en el citoplasma son procesados por NagZ y posteriormente por AmpD dando como resultado péptidos libres, NAG y NAM. Estos productos son reincorporados a la ruta biosintética del PGN hasta producir UDP-NAM-pentapéptidos (Figura 3). Sin embargo, parte de éstos no son procesados inmediatamente para su incorporación al PGN, sino que se unen a AmpR provocando en este regulador una conformación represora. Atendiendo a esto se puede considerar a AmpD importante no solo para el reciclaje del PGN, sino como represor indirecto de ampC ya que lleva a cabo una reacción esencial para la síntesis de los UDP-NAM-pentapéptidos, que a su vez actúan como causantes de una conformación represora de AmpR, que al unirse a la región intergénica ampC-ampR, frena la expresión de la β-lactamasa a nivel mínimo.
• Condiciones de inducción: En presencia de un β-lactámico inductor como la cefoxitina se inhiben a ciertas PBPs por su acción, y se desequilibra la balanza hacia la degradación por autolisinas, produciéndose una mayor liberación de NAG-1,6-anhidro-muropéptidos desde el PGN, lo que desemboca en altos niveles de estos compuestos en el citoplasma. Estas elevadas concentraciones provocan la saturación de AmpD y dichos 1,6-anhidro-
muropéptidos, que quedan libres en el citoplasma sin procesar, son capaces de desplazar competitivamente a los UDP-NAM-pentapéptidos de la unión con AmpR. Este hecho induce un cambio conformacional del regulador hacia su forma activadora de la transcripción de ampC. A continuación, AmpC es híper-producida (hasta 50 veces por encima del nivel basal) y exportada al periplasma, donde degrada al β-lactámico. Simultáneamente a ello, el β- lactámico inductor también provoca la inhibición de PBP4 que activa el sistema regulador de dos componentes CreBC, lo que aumenta aún más la eficiencia de AmpC mediante una compleja respuesta metabólica aún no completamente descrita. Este proceso es totalmente reversible, reduciéndose la expresión de AmpC a niveles basales cuando desaparece el agente inductor (23,24).
Por último, y como se ha mencionado anteriormente, durante el tratamiento con ciertos antibióticos β-lactámicos no inductores (ej.: piperacilina, ceftazidima, aztreonam), pueden seleccionarse mutaciones en diferentes genes, que desencadenan la hiperproducción estable de AmpC, lo cual desemboca en resistencia a esos mismos β-lactámicos. De hecho, esta es la estrategia que más habitualmente sigue P. aeruginosa para obtener resistencia adquirida en cepas clínicas, si bien es cierto que la contribución de la hiperexpresión de bombas y/o pérdida de porinas es también muy relevante.
Las mutaciones que más habitualmente causan la hiperproducción estable de AmpC son aquellas que inactivan a dacB o ampD (por inserciones/deleciones de nucleótidos que cambian el marco de lectura, o forman un codón stop prematuro), dando lugar a un fenómeno similar al explicado para la inducción (inhibición de PBP4/saturación de AmpD), pero de forma permanente. No obstante, recientemente se han descrito otras dianas causantes de hiperproducción de AmpC, como por ejemplo las inactivaciones mutacionales de ciertas enzimas participantes en el metabolismo del PGN, como los homólogos de AmpD (AmpDh2 y AmpDh3), Mpl, NuoN, SltB1, MltB, etc. Además, diferentes mutaciones en AmpR causantes de su conformación constitutiva activadora de la expresión de ampC, se han descrito también en cepas clínicas de P. aeruginosa (Figura 5) (25).
Figura 5. Principales dianas mutacionales causantes de hiperproducción estable de AmpC en P. aeruginosa.
Imagen extraída de: (25)
2.4.2. Resistencia a β-lactámicos por adquisición horizontal de β-lactamasas en Pseudomonas aeruginosa
La adquisición de β-lactamasas de transmisión horizontal por parte de P. aeruginosa es un fenómeno preocupante a nivel epidemiológico, por la obvia capacidad de diseminación que implica dentro del medio hospitalario no sólo en esta especie sino en otros patógenos oportunistas. La presión selectiva ejercida por los tratamientos generalizados y a veces erróneos con β-lactámicos tiende a amplificar progresivamente esta amenaza clínica.
De todas formas, las β-lactamasas transferibles han existido desde mucho antes, como consecuencia de la presencia de antibióticos naturales en el medio ambiente, y la necesidad de la bacteria de ser capaz de sortear su acción para sobrevivir. Además, la evolución no sólo ha tendido a diversificar enormemente el abanico de enzimas, caracterizadas por diferentes perfiles de hidrólisis de β- lactámicos, sino también a seleccionar complejos y eficientes sistemas de regulación (incluyendo por ejemplo promotores más eficaces para aumentar la expresión) y plataformas genéticas para la captura y diseminación de estos genes de resistencia, como son los integrones codificados en transposones/plásmidos (4).
A día de hoy hay descritas más de 1.000 variantes de β-lactamasas, que pueden clasificarse atendiendo a varios criterios. En la llamada clasificación molecular o de Ambler, se tienen en cuenta la secuencia aminoacídica y los mecanismos de interacción enzima-sustrato, dando lugar a 4 clases [A, B (las únicas que no tienen serina en el centro activo y que requieren de zinc para ser funcionales), C (AmpC sería un típico ejemplo) y D], que serán abordadas más adelante (26).
Pseudomonas aeruginosa se suele caracterizar por la adquisición de genes de β-lactamasas en unas plataformas especializadas en la captación y expresión de genes denominadas integrones (Figura 6).
Se han descrito 5 clases de integrones que difieren entre sí básicamente en la secuencia del gen que codifica la integrasa, proteína que permite la captación e integración de nuevos genes de resistencia, que suelen denominarse genéricamente “casetes”. En P. aeruginosa, los genes de resistencia a antibióticos se suelen localizar casi de forma exclusiva, en integrones de clase 1.
Figura 6. Estructura de un integrón de clase 1. Imagen extraída de: (27)
Estos presentan en sus extremos 5’ y 3’ unas secuencias de ADN muy conservadas denominadas 5’- CS y 3’-CS, teniendo éstas una longitud de ≈1,4 kb y ≈2 kb respectivamente. Estas secuencias distales delimitan las zonas que incluyen los genes de resistencia a antimicrobianos, las cuales presentan una longitud variable en función del número de genes insertados en ellas (Figura 6). La región 5’-Cs codifica para el gen de la mencionada integrasa (intI) que es una tirosina-recombinasa de 337
aminoácidos. Adyacente a ésta, se encuentra el sitio de recombinación específico attI donde se integra el casete génico de resistencia, al recombinar este sitio, con el sitio attC propio de cada casete gracias a la acción de la integrasa, que reconoce precisamente a attI1 y attC De esta forma, el integrón va capturando casetes de resistencia (ADN circular) que pueden hallarse en el ambiente, y los irá integrando siempre en la posición más cercana a la integrasa. Así, un mismo integrón puede codificar multitud de casetes que se han ido adquiriendo a lo largo del tiempo, siendo los más cercanos al extremo 5’ aquellos que se han adquirido más recientemente. Para que la recombinación entre las mencionadas attI y attC llevada a cabo por la integrasa se dé con una alta eficiencia, es necesario que el sitio attI sea de 65 pb así como que presente la secuencia conservada GTTRRRY (donde R: cualquier purina, Y: cualquier pirimidina). Dispuestos entre intI y attI existen dos promotores divergentes: PI , que Controla la expresión de la integrasa y PC ,que controla la expresión de los casetes génicos insertados (estos suelen carecer de promotor). Así pues, a mayor proximidad al extremo 5’, más fuerte es la expresión del casete, al estar más cercano a PC (28,29).
El extremo 3’-CS presenta tres ORFs: qacEΔ1, sul1 y orf5 que se corresponden respectivamente a un derivado truncado del gen aacE que confiere resistencia a los amonios cuaternarios, un gen que proporciona resistencia a sulfonamidas, y un gen cuya función se desconoce (27).
Así pues, estos integrones suponen un peligro para la salud pública por diferentes motivos: i) la gran capacidad que tienen para capturar y expresar eficientemente casetes de resistencia; ii) la habitual codificación de diferentes genes en un mismo integrón, que pueden co-transferirse e implicar perfiles muy amplios de resistencia; iii) la habitual codificación de estos integrones en plataformas móviles dentro del propio genoma y/o transmitirse horizontalmente (por conjugación, habitualmente), como transposones y los plásmidos. No obstante, también es habitual que en cepas clínicas los integrones se acaben insertando en el cromosoma, teóricamente perdiendo capacidad de diseminación horizontal.
Independientemente de los elementos genéticos portadores, entre las β-lactamasas más frecuentemente adquiridas por P. aeruginosa hasta hace unas décadas, destacaban aquellas denominadas de “espectro reducido o estrecho”, pues sólo hidrolizaban a los β-lactámicos usados en clínica en ese momento, como las aminopenicilinas y las cefalosporinas de 1ª y 2ª generación. Entre ellas, podemos destacar (4):
• β-lactamasas de tipo PSE (por las siglas en inglés de Pseudomonas-specific enzyme) pertenecientes a la clase A. Dentro de este grupo las PSE-1 y PSE-4 son unas de las β- lactamasas más comúnmente detectadas en aislados clínicos de P. aeruginosa, aunque parecen tener un impacto clínico limitado, ya que de forma intrínseca P. aeruginosa es bastante resistente a las penicilinas.
• β-lactamasas tipo OXA (denominación procedente de “oxacilinasas”, al ser la oxacilina su sustrato preferido, originalmente). Pertenecen a la clase D y se han descrito centenares de variantes, de las cuales las más habituales en P. aeruginosa (sobre todo antes de la introducción de las cefalosporinas de espectro ampliado, esto es, de 3ª/4ª generación), son las OXA-1, OXA-2, OXA-4 y la OXA-10.
Sin embargo, durante la década de 1990 y ante el incremento de resistencias, la introducción de
nuevos β-lactámicos [como las penicilinas anti-pseudomónicas, las cefalosporinas de espectro ampliado y los monobactámicos], y su uso indiscriminado provocó la selección de variantes aminoacídicas de β-lactamasas con un espectro de hidrólisis más amplio. Éstas se conocen como β- lactamasas de espectro extendido (BLEE) y son capaces de hidrolizar a estos β-lactámicos más recientemente introducidos. Sin embargo, las BLEE no muestran habitualmente capacidad de hidrólisis sobre las cefamicinas como la cefoxitina (que se consideran variantes de cefalosporinas de 2ª generación) ni los carbapenémicos. Además presentan al menos cierto (aunque desigual) grado de sensibilidad a la inhibición por parte de fármacos administrados conjuntamente con ciertos β- lactámicos, los denominados inhibidores de β-lactamasas, cuya finalidad es obvia (ej.: ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam, y el recientemente introducido avibactam). Entre las BLEE más habitualmente detectadas en cepas clínicas de P. aeruginosa encontramos: PER-1; tipo VEB; tipo BEL;
tipo PME, y tipo GES (entre las cuales algunas variantes aminoacídicas llegan a hidrolizar incluso a los carbapenémicos).
Si bien todas estas BLEE son merecedoras de gran atención debido a su impacto sobre la resistencia a los antibióticos, aquí destacamos, por su relación directa con este trabajo, a las denominadas OXAs de espectro extendido. Obviamente, estas OXAs de espectro extendido derivan de otras OXA de espectro reducido (como las anteriormente citadas OXA-2 u OXA-10, por ejemplo) por selección de mutaciones resultantes en cambios aminoacídicos que ampliaron su espectro de hidrólisis. A día de hoy se han descrito diferentes variantes con perfil BLEE en P. aeruginosa y otras especies en diferentes localizaciones geográficas (OXA-11, OXA-15, OXA-17, OXA-18, etc.). Sin embargo, por su proximidad, son más interesantes para este trabajo las variantes de OXA-2 descritas recientemente en Mallorca:
• OXA-161: Detectada por primera vez en 2008 en una cepa de P. aeruginosa aislada de un paciente de la UCI pediátrica del Hospital Universitario Son Dureta (Palma, España). La presencia de esta β-lactamasa deriva en un alta resistencia a ceftazidima y reducción de susceptibilidad a piperacillina, cefepime y aztreonam (30).
• OXA-226: Detectada en un estudio experimental sobre la actividad de la nueva cefalosporina de 5ª generación CXA-101 (denominada comercialmente ceftolozano) sobre cepas clínicas de P. aeruginosa resistentes a múltiples antibióticos. Confiere un alto nivel de resistencia a ceftazidima y ceftolozano (31).
• OXA-539: Está documentada como la primera selección in vivo de una variante OXA tipo BLEE durante el tratamiento de una infección humana con cefalosporinas de amplio espectro (aislamiento inicial sensible vs aislado post-tratamiento, resistente). La muestra se tomó de una herida quirúrgica de un paciente con cáncer de colon en el Hospital Universitario Son Espases (Palma, España) en el año 2017. Esta cepa desarrolló resistencia a ceftazidima, ceftazidima-avibactam y ceftolozano-tazobactam, explicada por la mutación seleccionada en la OXA-2 inicial (muestra anterior al tratamiento con estos β-lactámicos) para dar lugar a la OXA-539 (32).
Las diferencias aminoacídicas entre estas OXAs tipo BLEE con respecto a la OXA-2 original, y que explican sus particularidades en los respectivos espectros de hidrólisis (por ejemplo, sólo OXA-226 y OXA-539 hidrolizan eficientemente el ceftolozano), están representadas en la siguiente tabla (Tabla 4).
Tabla 4 - Diferencias en la secuencia aminoacídica de las OXA-161, 226 y 539 con respecto a la OXA-2 originaria.
Fuente de las secuencias: GenBank (NCBI). Fuente de los cambios: (30–32) SNP: Single nucleotide polymorphism (polimorfismo de un solo nucleótido).
Posteriormente a la introducción de las mencionadas cefalosporinas de espectro ampliado, ante el problema de la creciente resistencia, se introdujeron en clínica los carbapenémicos (década de los 1990). Al principio, se utilizaron como “agentes de última línea” o “antibióticos de último recurso”
cuando las infecciones se volvían intratables o se sospechaba que albergaban bacterias resistentes a los antibióticos de corte más generalista (33). Sin embargo, progresivamente su uso se fue extendiendo, lo cual propició la aparición de enzimas especializados en su hidrólisis, las denominadas carbapenemasas, que son muy frecuentemente detectadas en P. aeruginosa (34). Estas carbapenemasas pertenecen a tres de las cuatro clases moleculares definidas por Ambler (4):
• Carbapenemasas de clase A: Dentro de esta clase encontramos a algunas β-lactamasas de tipo GES, (como las GES-2, -4, -5, -6, -11 y -18), que se han encontrado en cepas de P.
aeruginosa con cierta frecuencia, y las KPC, más habitualmente detectadas en Klebsiella pneumoniae.
• Carbapenemasas de clase B: también conocidas como Metalo-β-lactamasas (MBL), son probablemente el grupo más relevante de carbapenemasas, tanto por su diversificación en diferentes variantes aminoacídicas como por su diseminación prácticamente mundial y en diferentes microorganismos. Dentro de estas encontramos las tipo IMP, VIM, NDM, SPM, FIM y HMB, siendo los 2 primeros tipos los de mayor presencia en cepas clínicas de P.
aeruginosa.
• Carbapenemasas de clase D: representadas por OXAs que presentan una acción moderada sobre los carbapenémicos aunque siempre superior al efecto sobre las cefalosporinas de espectro extendido y monobactámicos, que es prácticamente nulo (por tanto, no se consideran BLEE). Entre estas OXAs encontramos por ejemplo a OXA-23, OXA-24, OXA-48, etc., que apenas se han reportado en P. aeruginosa.
Secuencia aminoacídica (Código de 1 letra) Cambio
OXA-2
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Secuencia original
OXA-161
MAIRIFAILFSIFSLATFAHAQEGTLERSDWRKFFSEFQAKGTIVVADERQADRMLVFDPVR SKKRYSPASTFKIPHTLFALDAGAVRDEFQIFRWDGVNRGFAGHNQDQDLRSAMRNSTV WVYELFAKEIGDDKARRYLKKIDYGDADPSTSNGDYWIEGSLAISAQEQIAFLRKLYRNELPF RVEHQRLVKDLMIVEAGRNWILRAKTGWEGRMGWWVGWVEWPTGSVFFALNIDTPNR MDDLFKREAIVRAILRSIEALPPNPAVNSDAAR
SNP Asn148Asp
OXA-226
MAIRIFAILFSIFSLATFAHAQEGTLERSDWRKFFSEFQAKGTIVVADERQADRAMLVFDPV RSKKRYSPASTFKIPHTLFALDAGAVRDEFQIFRWDGVNRGFAGHNQDQDLRSAMRNSTV WVYELFAKEIGDDKARRYLKKIDYGNADPSTSNGDYRIEGSLAISAQEQIAFLRKLYRNELPF RVEHQRLVKDLMIVEAGRNWILRAKTGWEGRMGWWVGWVEWPTGSVFFALNIDTPNR MDDLFKREAIVRAILRSIEALPPNPAVNSDAAR
SNP Trp159Arg
OXA-539
MAIRIFAILFSIFSLATFAHAQEGTLERSDWRKFFSEFQAKGTIVVADERQADRAMLVFDPV RSKKRYSPASTFKIPHTLFALDAGAVRDEFQIFRWDGVNRGFAGHNQDQDLRSAMRNSTV WVYELFAKEIGDDKARRYLKKIDYGNADDPSTSNGDYWIEGSLAISAQEQIAFLRKLYRNEL PFRVEHQRLVKDLMIVEAGRNWILRAKTGWEGRMGWWVGWVEWPTGSVFFALNIDTP NRMDDLFKREAIVRAILRSIEALPPNPAVNSDAAR
Duplicación Asp149
2.5. Relación entre peptidoglicano, producción de β-lactamasas y virulencia.
Muchas características fenotípicas de las bacterias vienen determinadas por las complejas interrelaciones del propio metabolismo (35). De hecho, como hemos visto, la adquisición de resistencia a β-lactámicos mediante AmpC implica la interconexión de diferentes vías, incluyendo reguladores transcripcionales como AmpR, y otros actores participantes en el reciclaje del PGN. Sin embargo, no todo es beneficioso para la bacteria, sino que se sabe que esta adquisición de resistencia provoca cambios en la fisiología bacteriana que a menudo conllevan un coste biológico (36). Concretamente la eficacia biológica o fitness de los mutantes resistentes a antibióticos es, como normal general, más baja que la de una bacteria sensible, pues suele implicar la alteración de dianas (con el habitual perjuicio que suele conllevar la mutación en éstas para su correcto funcionamiento) o un sobrecoste energético ligado a la hiperexpresión de ciertos mecanismos (35). Sin embargo, ese descenso de fitness y virulencia es rentable al mutante al obtener a cambio resistencia al antibiótico que está presente en el medio, y que eliminará a aquellas cepas/especies (a priori más eficientes y virulentas en condiciones normales), que no han desarrollado resistencia.
Como se ha explicado anteriormente, la síntesis de β-lactamasas es el principal mecanismo de resistencia a β-lactámicos de P. aeruginosa. Sin embargo, y a pesar de la norma general de que la resistencia mutacional suele implicar pérdida de eficacia biológica, parece no haber unanimidad en el efecto que conlleva la producción de β-lactamasas (intrínsecas/adquiridas) sobre el fitness y la virulencia de este microorganismo. Así, existen diferentes estudios que ofrecen indicios contrapuestos:
Por lo que respecta a la β-lactamasa intrínseca AmpC, cabe decir que en este sentido hay pocos datos publicados. Sin embargo, según resultados previos del tutor de este trabajo, parece claro que la hiperproducción de AmpC, cuando se suma al bloqueo del reciclaje del PGN (por medio de la inactivación de AmpG o NagZ, por ejemplo), da lugar a un drástico descenso en la virulencia de P.
aeruginosa sobre el modelo invertebrado Galleria mellonella y sobre cultivo celular (37).
Posteriormente se propuso que este descenso de virulencia en las cepas de P. aeruginosa mostrando esta conjunción de factores (bloqueo de reciclaje + hiperproducción de AmpC), podría estar asociado al gran incremento de sensibilidad a los recursos del sistema inmune cuya diana es el PGN [lisozima y PGRPs (Peptidoglycan Recognition Proteins)], demostrado in vitro (38). Paralelamente, la sola inactivación de los mencionados AmpG o NagZ mostró ser causante de un notable descenso de virulencia en modelo murino, apuntando al reciclaje del PGN como un target interesante para el desarrollo de terapias anti-virulencia (39). Sin embargo, estos trabajos abrieron varios interrogantes, como por ejemplo la exacta base molecular del citado descenso de virulencia, así como la cuestión:
¿La atenuación de virulencia observada se vería únicamente asociada a AmpC, o también se produciría si la bacteria expresase otros tipos de β-lactamasas (adquiridas)?
Por lo que respecta a las β-lactamasas adquiridas:
• Algunos trabajos han demostrado que la producción de β-lactamasas horizontales no produce ningún hándicap importante para la bacteria o que incluso puede potenciar su fitness/virulencia, probablemente por la adquisición conjunta de genes de virulencia en los mismos plásmidos. Ello es hasta cierto punto lógico, si pensamos en la altísima diseminación
que tienen estas β-lactamasas a nivel mundial, que se vería mucho más reducida si tuviesen asociado un coste biológico muy alto.
o En 2004 Aoki et al. testaron la virulencia de la cepa de referencia de P. aeruginosa (PAO1) portadora del gen para una MBL tipo VIM. En dicho ensayo se concluyó que la presencia de esta MBL no afectaba significativamente a la virulencia de la bacteria (40).
o En 2008 Sahly et al. publicaron un trabajo donde se observaba un incremento de la invasividad y la adhesión de K. pneumoniae que expresaban diferentes BLEE (41).
o En Escherichia coli, por su parte, se ha demostrado repetidamente que la expresión de β-lactamasas tipo CTX-M (clase A) no tiene un coste apreciable, y de hecho, incluso ciertas cepas de esta especie diseminadas a nivel global, se caracterizan por poseer estas enzimas conjuntamente con un fenotipo híper-virulento (42–44).
• Sin embargo, otros estudios afirman que la producción de β-lactamasas horizontales tiene un efecto reductor del fitness y la virulencia de la bacteria:
o Un trabajo realizado con cepas de E. coli demostró grandes costes en términos de fitness para la bacteria, que se relacionaron con cambios en la composición del PGN, a su vez ligados a la expresión de las β-lactamasas adquiridas OXA-10, OXA-24 y SFO- 1 (β-lactamasa de clase A) (45).
o En otros estudios se demostró el hándicap que para Salmonella enterica serovar typhimurium tiene la adquisición de ciertas β-lactamasas (como VIM) (46), o la hiperproducción de AmpC (conseguida mediante un plásmido artificial) (47) conllevando una considerable reducción de la tasa de crecimiento, motilidad e invasividad.
o Para contestar a las interrogantes abiertas anteriormente respecto a la relación AmpC-PGN-virulencia, en un trabajo presentado en el congreso FEMS Online Conference on Microbiology (48), el grupo del Dr. Juan ha demostrado que la expresión de diferentes OXAs conlleva un importante hándicap para P. aeruginosa, variable dependiendo del tipo de enzima, y más visible en un background de reciclaje de PGN defectuoso. Así, la expresión de la OXA de espectro reducido OXA-2, mostró un ligero efecto negativo en la virulencia (sobre el modelo invertebrado G.
mellonella), mientras que otras derivadas de OXA-2 con perfil BLEE, tuvieron un mayor impacto. Así, la expresión de OXA-2 clonada en plásmido multicopia, en mutante defectivo en AmpG, incrementó la dosis letal 50 (DL50*) de P. aeruginosa desde 50 bacterias a ≈100, mientras que los incrementos para OXA-226 y OXA-161 fueron mayores, llegando hasta 175 y 600 bacterias, respectivamente.
La base molecular de todos estos controvertidos resultados no está clara, aunque varias ideas han sido aportadas al respecto. Por una parte, hay que tener en cuenta que no todas las β-lactamasas tienen porqué implicar los mismos costes biológicos, pues las diferentes clases (A, B, C y D), y dentro de ellas, cada variante aminoacídica tiene tendencias evolutivas, perfiles de hidrólisis y características propias, de manera que es normal que cada una afecte en mayor o menor medida al fitness/virulencia.
Por otro lado, es obvio que una bacteria con el reciclaje del PGN alterado, tendría un gran malgasto de energía, lo cual conlleva dificultades para crecer en medios hostiles en los que la disponibilidad de nutrientes no es ilimitada, como por ejemplo el cuerpo del hospedador de la infección. Así, una pérdida de energía en este contexto haría descender la tasa de crecimiento bacteriano, y consecuentemente, el fitness y la virulencia. Además, dado que el reciclaje está bloqueado, es plausible que la síntesis de novo del PGN no sea suficiente para dar lugar a una correcta llegada de nuevo material y construcción de este, de forma que esta estructura quedaría en cierta manera debilitada, siendo más sensible a la presión osmótica y a los ataques inmunitarios. Además, la hiperproducción de β-lactamasas podría contribuir a estos resultados, dado que estos enzimas probablemente proceden de ancestros comunes con determinadas autolisinas bacterianas, y seguramente aún conserven cierta parte de esa actividad degradadora del PGN. Esta actividad residual, mayoritariamente endopeptidasa, ha sido propuesta por diferentes autores para algunas β- lactamasas (45,47,49–51). Así, en condiciones normales, esa actividad residual podría no tener consecuencias negativas para la pared y la bacteria, pero a partir de ciertos niveles de hiperproducción del enzima, y en un background de reciclaje defectuoso y por tanto de pared más endeble, esa actividad podría ser decisiva para debilitar definitivamente el PGN, contribuyendo a la lisis. Ello, obviamente, tendría un claro impacto sobre la viabilidad celular, el fitness y la virulencia, y podría explicar los resultados del grupo del Dr. Juan obtenidos tanto en relación al coste ligado a AmpC como a las OXAs, en los estudios ya mencionados (37).
En cualquier caso, en este trabajo no se pretende dar respuesta a todas estas cuestiones, sino sólo aproximarse un poco más a entender los mecanismos de pérdida de virulencia asociados al bloqueo de reciclaje + producción de beta-lactamasas de clase D en P. aeruginosa (48). En este sentido, está documentada la pérdida de virulencia sobre modelo invertebrado, ¿pero qué bases la sustentan? Las razones para el descenso de virulencia general pueden ser multifactoriales, pero en este trabajo nos centraremos en determinar si el descenso en la virulencia se ve ligado o no a una disminución en la capacidad invasiva de la bacteria sobre cultivo celular. Obviamente, si las cepas estudiadas tienen una pared debilitada, es probable que pierdan capacidad de invadir las células del huésped al ser más sensibles a la lisis, lo cual explicaría el descenso de virulencia general observado en modelo invertebrado.
Todo ello tiene un gran interés, en el siguiente contexto: conocer las bases moleculares que sustentan la pérdida de virulencia de P. aeruginosa al expresar determinadas β-lactamasas nos acercará un paso más a encontrar puntos débiles en la bacteria para el futuro diseño de terapias destinadas no tanto a eliminar directamente a la misma, sino a hacerla menos virulenta: las llamadas terapias anti-virulencia (52).
3. ANTECEDENTES, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Dados los antecedentes en cuanto a la pérdida de virulencia de P. aeruginosa sobre modelo invertebrado, al darse las circunstancias de: bloqueo del reciclaje del PGN (a través de la inactivación de AmpG) + expresión de β-lactamasas adquiridas de tipo OXA (con ciertos matices en función de la variante enzimática) (48), en este trabajo planteamos la hipótesis que ese descenso en la virulencia puede ir asociado a una pérdida de la capacidad invasiva de la bacteria sobre cultivo celular.
Obviamente, al tener la bacteria potencialmente debilitado el PGN, por todo lo explicado durante la
introducción, perdería capacidad de resistir los cambios de presión osmótica que implica la invasión de la célula eucariota, lo cual redundaría en una mucha menor tasa de invasión, proporcional al descenso de virulencia observado en modelo invertebrado.
Para comprobar esta hipótesis, se plantean dos objetivos:
1. Cuantificar la capacidad de invasión sobre cultivo celular (línea humana pulmonar A549), de diferentes cepas de P. aeruginosa (salvaje vs defectivas en AmpG), portadoras de las OXAs OXA-2, OXA-161, OXA-226 y OXA-539, para analizar las potenciales diferencias en función de la variante enzimática, y relacionarlas con los datos previos de reducción de virulencia sobre modelo invertebrado.
2. Cuantificar la tasa de crecimiento de las mencionadas cepas durante el experimento de invasión, para analizar el potencial impacto sobre la capacidad invasiva y la virulencia general.
4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Cepas bacterianas
En la siguiente tabla (Tabla 5) se muestran las cepas/plásmidos utilizados en este trabajo y sus principales características:
Tabla 5 - Cepas y plásmidos utilizados.
Cepas/plásmidos Características Fuente
PAO1 Cepa de referencia de P. aeruginosa, considerada invasiva, con
genoma completo secuenciado. (6)
PA∆AG PAO1 ΔampG::lox. Mutante noqueado en ampG, que presenta el
reciclado del PGN bloqueado. (53)
pUCP24 Vector puente multicopia Escherichia-Pseudomonas basado en
pUC18; confiere resistencia a Gentamicina. (54) PA∆AG pUCP OXA2 PA∆AG con pUCP24 con el gen de la β-lactamasa OXA-2 (clase D,
narrow spectrum) clonado.
(30)
PA∆AG pUCP OXA161 PA∆AG con pUCP24 con el gen de la β-lactamasa OXA-161 (BLEE de clase D) clonado.
PA∆AG pUCP OXA226 PA∆AG con pUCP24 con el gen de la β-lactamasa OXA-226 (BLEE
de clase D) clonado. (31)
PA∆AG pUCP OXA539 PA∆AG con pUCP24 con el gen de la β-lactamasa OXA-539 (BLEE
de clase D) clonado. (32)
4.2. Línea celular
Se empleó la línea celular humana A549 (Cell Line Service; Eppelheim, Alemania), que procede de adenocarcinoma de pulmón y fue obtenida por 1ª vez en 1972 (55). Son células de naturaleza escamosa, pertenecientes a los denominados neumocitos de tipo II, que permiten la difusión de
sustancias (principalmente gases, como es obvio) en los alvéolos pulmonares. In vitro estas células crecen adherentemente formando una monocapa, con un tiempo de duplicación de aproximadamente 20-24h (56).
4.3. Soluciones y medios de cultivo - Medio de cultivo bacteriano
• LB (Luria-Bertani):
o LB Caldo: 5 g de NaCl + 5 g de extracto de levadura (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) + 10 g de triptona (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) por litro de agua destilada.
o LB Agar: 15 g de agar bacteriológico (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) por litro de caldo LB.
En ambos casos, los aditivos se disolvieron en el volumen apropiado de agua destilada, y las soluciones obtenidas fueron esterilizadas en autoclave a 121 ºC durante 20 minutos.
- Medios de cultivo celular
• Medio de mantenimiento: medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 W/O Phenol Red (Biowest; Nuaillé, Francia) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (Biowest) + tampón HEPES 10 mM (Biowest) + solución de antibiótico-antimicótico 1X (Biowest).
• Medio de infección: medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 W/O Phenol red (Biowest) suplementado con tampón HEPES 10 mM (Biowest).
• Medio de killing: Medio de infección + Amikacina 600 μg/mL (Laboratorios Normon; Tres Cantos, España).
• Otros reactivos:
- Tampón Dulbecco’s PBS, w/o Ca & Mg, w/o Phenol Red (Capricorn scientific;
Ebsdorfergrund, Alemania).
- Tripsina-EDTA 1x in solution w/o calcium w/o magnesium w/ Phenol Red (Biowest).
- Cloruro de sodio Meinsol®9 mg/mL (Fresenius kabi; Barcelona, España).
- Tritón X-100 (Sigma-Aldrich, Múnich, Alemania) al 0,1% en agua destilada estéril.
4.4. Cultivos celulares: Mantenimiento y preparación para la infección
El manejo de la línea celular A549, para la realización de los experimentos de este trabajo requirió de dos procedimientos:
• Mantenimiento rutinario de los cultivos: Las células se mantuvieron en botellas de 175 cm2 con 40 mL de medio de mantenimiento, incubándose a 37 ºC con 100% de humedad relativa
y un 5% de CO2. De forma rutinaria, cuando las células alcanzaron una elevada confluencia (≈0,5-1x105 células/cm2), se realizaron pases a botellas nuevas con medio de mantenimiento fresco. Para ello se llevó a cabo la resuspensión de las células tratándolas unos 5 minutos con 7 mL de solución 1X de tripsina-EDTA al 0,25%, previa eliminación del medio de mantenimiento, y lavado con buffer PBS (≈20 mL) para eliminar desechos e impurezas. Una vez pasados los 5 minutos (incubando a 37 ºC) se puedo observar como las células quedaban despegadas y suspendidas en la solución de tripsina-EDTA. Para neutralizar esta solución, se añadieron ≈10 mL de medio de mantenimiento nuevo, que además permitieron homogeneizar y recoger todas las células despegadas, tras lo cual se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos. Posteriormente, se descartó el medio y se resuspendieron las células en medio de mantenimiento nuevo. Aproximadamente 1/8 parte de cantidad total (dilución de la concentración original a 1:8) de este contenido celular se depositó en una nueva botella conteniendo ≈40 mL de medio fresco. De manera rutinaria, cada 2-3 días, se realizó este proceso.
• Preparación de placas para el ensayo de infección: El día previo al ensayo de infección se separaron las células A549 de la botella como se acaba de explicar para los pases rutinarios de mantenimiento. Aproximadamente 1/6 parte de las células procedentes de una botella confluente son suficientes para obtener una placa de 24 pocillos preparada para su infección al día siguiente. Así, la mencionada sexta parte de las células fue resuspendida en 13 mL de medio de mantenimiento nuevo, que una vez mezclados por pipeteo repetitivo para asegurar su homogeneidad, fueron repartidos a razón de 500 µL/pocillo. Ello aseguró la presencia de aproximadamente 0,5x105 células/pocillo. Finalmente, se incubaron las placas (37 ºC, 100% humedad relativa, 5% CO2) hasta el día siguiente, estimándose ≈1x105 células/pocillo.
4.5. Ensayo de infección
Una vez preparadas las placas de 24 pocillos (siempre el día anterior, para dejar tiempo suficiente para la adherencia adecuada de las células y aproximadamente una duplicación de su número), se evaluó la capacidad invasiva de las cepas de P. aeruginosa especificadas (Tabla 5). Para ello se realizaron ensayos clásicos de exclusión con aminoglucósidos, siguiendo protocolos descritos anteriormente (37). La infección se realizó por triplicado (3 pocillos por placa) para cada cepa, repitiéndose el ensayo con una placa nueva en tres días independientes. Para ello se siguieron los procedimientos:
1. Cálculos de la multiplicidad de infección bacteriana (multiplicity of infection, MOI) y adición del número apropiado de células de las cepas de P. aeruginosa: Se define como MOI el número de bacterias que se añaden a un cultivo celular con respecto al número estimado de células existentes en dicho cultivo. Se estima que en cada pocillo (una vez alcanzado el estado de confluencia del 80-90%) existen un total (teórico) de ≈1x105 células. En este trabajo, siguiendo protocolos previamente descritos (4), se trabajó con una MOI de 100, lo cual implicaba la adicción de ≈ 1x107 bacterias por pocillo.
