Genvarianter med mulig betydning for legemiddelrespons ved
stamcelletransplantasjon
Marthe Resløkken
Masteroppgave i farmakologi
Farmasøytisk institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO
Avdeling for medisinsk biokjemi og Avdeling for farmakologi
Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet
Mai 2016
II
III
Genvarianter med mulig betydning for legemiddelrespons ved
stamcelletransplantasjon
Marthe Resløkken
Masteroppgave i farmakologi, Farmasøytisk institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO
Oppgaven ble utført ved:
Avdeling for medisinsk biokjemi og Avdeling for farmakologi
Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet
Hovedveileder:
Sara Bremer, Avd. for medisinsk biokjemi, OUS
Internveileder:
Stein Bergan, Avd. for farmasøytisk biovitenskap, Farmasøytisk institutt og
Avd. for farmakologi, OUS
Mai 2016
IV
© Marthe Resløkken 2016
Genvarianter med mulig betydning for legemiddelrespons ved stamcelletransplantasjon Marthe Resløkken
http://www.duo.uio.no/
Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo
V
Sammendrag
Innledning: Busulfan (BU) og syklofosfamid (Cy) inngår i standard forbehandlingsregime i forbindelse med allogen stamcelletransplantasjon (HSCT). Doseringen av disse cytostatika er krevende, da for lav eksponering kan øke risikoen for tilbakefall, mens for høy eksponering øker risikoen for livstruende toksisitet. I tillegg gis kalsinevrinhemmeren ciklosporin (CsA) profylaktisk mot transplantat-mot-vert-sykdom (GVHD). Hensikten med denne studien er å undersøke assosiasjonen mellom genvarianter i relevante metabolismeenzymer og
legemiddeltransportører og markører på legemiddeleffekt og -toksisitet hos pasienter som har gjennomgått allogen stamcelletransplantasjon. I tillegg skal genotyperesultater fra ulikt prøvemateriale, henholdsvis blod- og hårprøver, sammenlignes.
Materiale og metode: Totalt 96 av de 111 pasientene som ble inkludert i «AlloSS-young»- studien ble også inkludert i den farmakogenetiske delen av studien. For 58 av pasientene ble det innhentet blodprøver som var tatt før transplantasjon. For de resterende pasientene ble det tatt hårprøver (etter transplantasjon). For å validere analysemetodene ble det i tillegg tatt hårprøver av 18 pasienter der man hadde tilgang på blodprøver. Analyse av sekvensvarianter i CYP2B6-, CYP3A4-, CYP3A5-, GSTA1- og ABCB1 (P-gp)-genene ble utført med
sanntidspolymerase kjedereaksjon (PCR) og smeltekurveanalyse, mens GSTM1-genkopitall ble analysert ved kvantitativ PCR. Legemiddelkonsentrasjoner, biokjemiske parametere og kliniske data ble hentet fra laboratoriedatasystem og pasientjournaler.
Resultater: Analyse av 10 ulike genvarianter i både hår- og blodprøver fra 18 pasienter viste fullt samsvar i analyseresultat mellom prøvematerialene. Selektiviteten og sensitiviteten ved genanalysene basert på hårprøver var henholdsvis ≥ 98,8 % og ≥ 97,2 %. Det var utført BU- konsentrasjonsmålinger for 13 av pasientene i studiepopulasjonen og det var stor individuell variasjon i BU Css og CL/F blant disse. Det var videre signifikant forskjell i BU Css og CL/F mellom de tre dagene (P=0,025 for både BU Css og CL/F). Det var ingen signifikant forskjell i BU Css og dosenormalisert konsentrasjon mellom ulike GSTA1- og GSTM1-genotypegrupper, men en svak tendens til høyere dosenormalisert konsentrasjon blant pasienter med
GSTA1*A/*A-genotype (P=0,217).
Konsentrasjonsmålinger fra intravenøs administrering av CsA viste at det var stor spredning blant pasientene i eksponering for legemidlet. Det var signifikant forskjell i CsA C0 fra transplantasjonsdag og frem til dag 16 etter HSCT (P≤0,005), med de høyeste verdiene
VI
observert ved dag 16 (355 (115-500) µg/L). Videre ble det observert høyere C0 og dosenormalisert C0 blant pasienter med CYP3A4*1/*1-genotype sammenlignet med CYP3A4*1/*22, og forskjellen var signifikant ved dag 3 (hhv. P=0, 039 og P=0,044).
Undersøkelse av CYP3A5 og CYP3A-kombinerte genotyper viste ingen statistisk signifikant korrelasjon med CsA C0 eller dosenormalisert C0. Det ble påvist en signifikant assosiasjon mellom bærerer av minst ett T-allel i c.3435 og økt CsA C0 og dosenormalisert C0 (dag 3), sammenlignet med pasienter med C/C-genotype (P=0,046). For ABCB1 c.61A>G, c.1236T>G og c.2677T>C observerte vi ingen assosiasjon mellom genotypevarianter og
konsentrasjonsnivåer av CsA.
En korrelasjon mellom maksimale bilirubinverdier (målt ≤ 1måned etter HSCT) og alder kunne påvises (r=0,394; P<0,002). Det kunne ikke påvises en statistisk signifikans mellom GSTA1- eller GSTM1-genotyper og maksimal bilirubinkonsentrasjon. GFR ble estimert for pasientene ≥ 18 år (n=25), men heller ikke mellom GFR og CsA C0 ble det påvist en statistisk signifikant assosiasjon.
Tilfeller av akutt GVHD ble undersøkt opp mot ulike parametere og det ble blant annet funnet at økt CsA C0 var assosiert med færre tilfeller av akutt GVHD (P=0,006 ved dag 16 etter HSCT). En økt forekomst av akutt GVHD blant pasienter med GSTA1*B/*B-genotype sammenlignet med GSTA1*A/*A-genotype ble også observert.
Konklusjon: Studien viser at hårfollikler kan være et egnet prøvemateriale for genotyping av stamcelletransplanterte pasienter. Videre viser studien at genotypevarianter av GST- og CYP- enzymer, samt ABCB1-sekvensvarianter, kan være av betydning for CsA-
konsentrasjonsnivåer og kliniske utfall, som GVHD, i forbindelse med HSCT. Det trengs imidlertid å gjøres studier i større og ulike pasientpopulasjoner for å kunne bekrefte eller avkrefte våre funn.
VII
Forord
Denne masteroppgaven ble utført ved Avdeling for medisinsk biokjemi og Avdeling for farmakologi ved Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet, fra august 2015 til mai 2016.
Først og fremst vil jeg takke min hovedveileder Sara Bremer. Din kunnskap, optimisme og gode veiledning har vært uvurderlig. Jeg har lært mye av deg om et krevende, men spennende fagfelt. Du har en fantastisk personlighet og det har vært utrolig hyggelig å bli kjent med deg dette året.
Jeg vil også takke min internveileder Stein Bergan for nyttige innspill og tilbakemeldinger.
Særlig disse siste ukene har du hjulpet meg med å holde motivasjonen oppe og vært en god støtte.
Videre vil jeg takke alle dere på «FARM» for hyggelige lunsjpauser og mye god sjokolade – det hjelper på motivasjonen! Dere sprer mye glede rundt dere, og det har derfor alltid vært hyggelig å komme hit.
Takk til Marit og resten av gjengen på «GEN» for hyggelige sammenkomster gjennom året – dere er en herlig gjeng! Jeg vil også takke dere for lån av instrument, og at dere har vært så hjelpsomme og fleksible. En særlig takk til Anja for hjelp med sekvensering og praktiske spørsmål.
Takk til Ellen Ruud, Phoi Phoi Diep og Elna Hamilton Larsen ved Barnemedisinsk avdeling for samarbeid om studien. Jeg vil særlig takke Phoi Phoi for hjelp med journaldata.
Takk til alle dere fine medstudenter i kull-2016 for fem minnerike år sammen.
Til slutt vil jeg takke familie, venner og Magnus som har støttet og motivert meg – særlig disse siste ukene. Dere er alle fantastiske!
Oslo, mai 2016 Marthe Resløkken
VIII
IX
Innholdsfortegnelse
1 Innledning ... 1
1.1 Hematopoetiske stamceller ... 1
1.2 Historisk utvikling av stamcelletransplantasjon ... 1
1.3 Indikasjoner for stamcelletransplantasjon ... 2
1.3.1 Maligne blodsykdommer ... 2
1.3.2 Ikke-maligne sykdommer ... 3
1.4 Hematopoetisk stamcelletransplantasjon ... 3
1.4.1 Forbehandling før stamcelletransplantasjon ... 4
1.4.2 Høsting og transfusjon av hematopoetiske stamceller ... 5
1.5 HLA-uforlikelighet ... 5
1.6 Komplikasjoner etter stamcelletransplantasjon ... 6
1.6.1 Infeksjoner ... 7
1.6.2 Toksiske effekter knyttet til forbehandlingen ... 8
1.6.3 Transplantat-mot-vert-sykdom (GVHD) ... 9
1.7 Myeloablativ kjemoterapi ... 11
1.7.1 Busulfan (BU) ... 11
1.7.2 Syklofosfamid (Cy) ... 12
1.8 Terapeutisk legemiddelmonitorering ... 14
1.9 Farmakogenetikk ... 14
1.9.1 Prøvemateriale til genanalyser etter stamcelletransplantasjon ... 18
2 Problemstilling ... 19
3 Metode ... 20
3.1 Reagenser og utstyr ... 20
3.2 «AlloSS-young»-studien ... 22
3.2.1 Pasientprøver ... 22
3.3 Isolering av DNA ... 22
3.3.1 Forbehandling av hårprøver før DNA-isolering ... 23
3.3.2 DNA-isolering med MagNA Pure robotsystem ... 23
3.4 Genetiske analyser ... 24
3.5 Sanntids-PCR ... 25
3.6 Smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober ... 26
X
3.7 Kvantitativ analyse av genkopitall ... 28
3.8 Utvikling av nye metoder for ABCB1-genanalyse ... 31
3.8.1 Primer- og probedesign ... 31
3.8.2 Eksperimentell evaluering av primerselektivitet ... 32
3.9 Legemiddeleksponering og kliniske endepunkter ... 34
3.10 Statistikk ... 35
4 Resultater ... 36
4.1 Pasienter ... 36
4.2 Genanalyser ved bruk av hår- og blodprøver ... 37
4.3 Forekomst av genvarianter ... 38
4.4 Legemiddelkonsentrasjoner ... 39
4.4.1 Busulfankonsentrasjoner ... 39
4.4.2 Ciklosporinkonsentrasjoner ... 40
4.5 Kliniske utfall ... 43
5 Diskusjon ... 48
5.1 Prøvemateriale for genanalyser blant stamcelletransplanterte pasienter ... 48
5.2 Farmakogenetiske markører og legemiddeleksponering ... 49
5.3 Kliniske utfall ... 53
5.4 Veien videre ... 55
6 Konklusjon ... 56
Litteraturliste ... 57
Vedlegg ... 63
XI
FORKORTELSER
ABCB1 ATP-bindende kassett-transportør B1; Permeabilitets-glykoprotein; P-gp ALL Akutt lymfatisk leukemi
AML Akutt myelogen leukemi ATG Antitymocyttglobulin
BU Busulfan
CMV Cytomegalovirus
Cp Terskelsyklus (crossing point)
CsA Ciklosporin
CSF Kolonistimulerende faktor
Cy Syklofosfamid
CYP Cytokrom P-450
FRET Fluorescens resonans energioverføring GSH Glutation
GST Glutation S-transferase
GVHD Transplantat-mot-vert-sykdom (graft-versus-host disease)
HL Hodgkin lymfom
HLA Humant leukocytt antigen
HSCT Hematopoetisk stamcelletransplantasjon KLL Kronisk lymfatisk leukemi
KML Kronisk myelogen leukemi
XII
MHC Hovedhistokompabilitetskompleks (major histocompatibility complex) NHL Non-Hodgkin lymfom
NFAT Nuclear factor of activated T-cells NK-celler Naturlige dreperceller
PCR Polymerasekjedereaksjon P-gp P-glykoprotein; Pgp; ABCB1 OUS Oslo universitetssykehus
SAA Alvorlig aplastisk anemi (severe aplastic anemia)
SCID Alvorlig kombinert immunsvikt (severe combined immuno deficency) SNP Enkeltnukleotid variant (single nucleotide polymorfism)
TBI Helkroppsbestråling (total body irradiation)
TDM Terapeutisk legemiddelmonitorering (therapeutic drug monitoring)
Tm Smeltetemperatur
Tx Transplantasjon
VOD Venookklusiv leversykdom (veno-occlusive disease) WAS Wiskott-Aldrich syndrom
1
1 Innledning
1.1 Hematopoetiske stamceller
Stamceller er opphavet til alle spesialiserte celler i kroppen og sørger for at celler som dør blir erstattet med nye celler. Det finnes mange typer stamceller. Hematopoetiske stamceller dannes i benmargen og er forløpere til alle blodcellene våre. Stamcellene utvikler seg videre til forløpere for enten lymfatiske celler eller myeloide celler, som igjen differensierer til blant annet B-celler, T-celler, monocytter og erytrocytter. Ioniserende stråling, virusinfeksjoner eller andre genetiske forandringer kan føre til unormal differensiering og celledeling av blodceller, noe som igjen kan føre til et økt antall umodne eller ikke-funksjonelle blodceller.
1.2 Historisk utvikling av stamcelletransplantasjon
Allerede tidlig på 1950-tallet fikk forskere øynene opp for hematopoetisk
stamcelletransplantasjon (HSCT) som et mulig behandlingsalternativ ved maligne
blodsykdommer. Den første pasienten ble stamcelletransplantert i 1959. Pasienten hadde leukemi i siste fase og ble behandlet med helkroppsbestråling med etterfølgende infusjon av benmarg fra pasientens identiske tvilling. Som en følge av behandlingen oppnådde pasienten remisjon i tre måneder (1). Prognosene ved stamcelletransplantasjon var imidlertid dårlige gjennom hele 1960-tallet, mye på grunn av manglende kunnskap om blant annet
vevstypeuforlikelighet, stamcelleutslettende regimer, immunsuppresjon og komplikasjoner som transplantat-mot-vert-sykdom («graft-versus-host disease»; GVHD). Fra begynnelsen av 1970-tallet begynte utviklingen å gå i riktig retning. Dette skyldtes blant annet forbedret infeksjonsprofylakser mot sopp, bakterier og virus, introduksjonen av syklofosfamid i forbehandlingsregimer sammen med helkroppsbestråling og etter hvert introduksjonen av ciklosporin (CsA) som GVHD-profylakse. Utviklingen av rekombinante kolonistimulerende faktorer (CSF) på 1990-tallet gjorde det videre mulig å høste stamceller direkte fra blodbanen til donor, noe som var en mindre invasiv prosedyre (2).
2
1.3 Indikasjoner for stamcelletransplantasjon
I dag er HSCT etablert som et viktig behandlingsalternativ ved flere maligne blodsykdommer og enkelte alvorlige ikke-maligne tilstander. Ved maligne og ikke-maligne blodsykdommer vil de hematopoetiske stamcellene eller blodcellene hos pasienten ikke differensiere eller fungerer slik de skal, og derfor får pasienten tilførsel av hematopoetiske stamceller fra en donor (allogen HSCT), eller ved at man bruker rensede stamceller fra pasienten selv (autolog HSCT) (3). HSCT blir også brukt ved enkelte metabolske sykdommer, som Hurler syndrom (4). De vanligste indikasjonene for HSCT hos voksne ved Oslo universitetssykehus (OUS), Rikshospitalet, er akutt myelogen leukemi (AML), akutt lymfatisk leukemi (ALL), kronisk myelogen leukemi (KML) og myelodyplastisk syndrom, ALL og AML er de hyppigste indikasjonene blant barn. Andre indikasjoner for HSCT blant barn er alvorlig kombinert immunsvikt (SCID), alvorlig aplastisk anemi (SAA) og Hurler syndrom (5, 6).
1.3.1 Maligne blodsykdommer
Leukemier
Leukemier er en gruppe maligne blodsykdommer som utgår fra beinmarg eller lymfeknuter og kjennetegnes ved en økning i antall unormale leukocytter. Man skiller mellom lymfatisk og myelogen leukemi, der henholdsvis de lymfatiske og myeloide cellelinjene rammes. Videre differensierer man mellom akutte og kroniske former. Akutt leukemi innebærer en rask økning i umodne leukocytter, mens symptomene ofte kommer gradvis og over lang tid hos pasienter med kronisk leukemi. Ved kronisk leukemi ser man i større grad økte nivåer av modne, men unormale, leukocytter (3).
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) rammer de lymfoide cellelinjene som er forløpere til B- celler, T-celler og NK-celler. KLL er den vanligste leukemiformen i den vestlige verden og forekommer hovedsakelig blant voksne personer (3). Ved ALL ser man et økende antall av lymfocyttlignende blaster (lymfoblastisk). Det er denne typen leukemi som oftest opptrer hos barn (7). KML rammer de myeloide cellelinjene, det vil si forløperne til de ulike
granulocyttene. KML utgjør omtrent 15–20 % av alle leukemitypene og rammer primært eldre personer (median diagnosealder 67 år). AML er en mer aggressiv form enn KML og er også vanligst blant eldre personer (3).
3
Lymfomer
Lymfomer, eller lymfekreft, deles vanligvis inn i de to hovedklassene Hodgkin lymfom (HL) og Non-Hodgkin lymfom (NHL). Disse kreftformene utvikler seg hovedsakelig fra de
lymfatiske cellelinjene. Årsaken til lymfom er ofte ikke kjent, men risikoen for å utvikle lymfom har blant annet blitt assosiert med enkelte typer virusinfeksjoner. HL omfatter i hovedsak B-lymfocytter og karakteriseres histologisk ved funn av «Reed–Sternberg»-celler med flere cellekjerner. NHL dekker lymfomer som ikke er HL, og er dermed en
eksklusjonsdiagnose. NHL kan ha utspring i både B-, T- og NK-celler, men B-cellelymfom er vanligst og utgjør omtrent 85 % av tilfellene (3).
1.3.2 Ikke-maligne sykdommer
Stamcelletransplantasjon kan også være et viktig behandlingsalternativ ved enkelte alvorlige ikke-maligne sykdommer. Ved SAA svikter produksjonen av blodceller i benmargen slik at pasienten får pancytopeni med lave nivåer av både erytrocytter, leukocytter og trombocytter.
Årsaken til SAA er ofte ukjent, men tilstanden er assosiert med autoimmune prosesser som kan være utløst av for eksempel legemiddelbruk, stråling eller infeksjoner (8). Talassemier er en gruppe arvelige sykdommer som kjennetegnes ved syntese av unormale
hemoglobinmolekyler, som igjen fører til hemolyse og anemi (3). HSCT brukes også ved arvelige sykdommer som SCID eller Wiskott-Aldrich syndrom (WAS), som skyldes defekter i henholdsvis T- og B-cellefunksjon og blodplatedannelse. Begge sykdommene opptrer i løpet av de første levemånedene eller -årene, og HSCT er i mange tilfeller eneste mulighet for helbredelse (2, 3). I tillegg blir HSCT brukt til behandling av den medfødte lysosomale avleiringssykdommen Hurler syndrom. Man utnytter da at donorleukocytter kan syntetisere det manglende enzymet, som igjen tas opp av pasientens egne celler (2, 4).
1.4 Hematopoetisk stamcelletransplantasjon
Det skilles mellom autolog og allogen hematopoetisk stamcelletransplantasjon. Ved en autolog HSCT, også kalt stamcellestøtte, får pasienten en overføring av egne stamceller.
Stamcellene blir først hentet fra pasienten og deretter renset og bestrålt slik at kreftceller blir fjernet fra stamcelleløsningen. Pasienten blir behandlet med cytostatika, og eventuelt
bestråling, før de rensede stamcellene tilbakeføres til pasienten. Ved denne type HSCT er det ingen problematikk rundt immunrespons og vevstypeforlikelighet, men risikoen for tilbakefall
4
av malign sykdom er høyere sammenlignet med allogen HSCT (1, 3). Allogen HSCT gjennomføres ved overføring av stamceller fra en HLA-forlikelig donor. Med unntak av eneggede tvillinger, så vil det imidlertid alltid være en viss grad av vevstypeuforlikelighet mellom to ulike individer. Dette innebærer at pasientene i varierende grad vil oppleve immunreaksjoner i etterkant av HSCT, og at bruk av immundempende legemidler er
nødvendig. Immunreaksjonen bidrar imidlertid til at risikoen for tilbakefall av malign sykdom er lavere enn ved autolog HSCT (9).
I perioden 1985–2012 gjennomgikk 734 voksne pasienter allogen HSCT ved OUS,
Rikshospitalet (5). For barn er tallet 267 i perioden 1974-2014 (6). De siste 5–10 årene har omtrent 45–55 voksne og 15–20 barn blitt stamcelletransplantert årlig ved Rikshospitalet.
1.4.1 Forbehandling før stamcelletransplantasjon
I forkant av en HSCT må pasienten gjennom et forbehandlingsregime. Man skiller mellom myeloablativ og ikke-myeloablativ forbehandling.
Myeloablativ forbehandling
Ved myeloablativ forbehandling er målet å utslette pasientens egne stamceller.
Standardregimet for myeloablativ forbehandling ved OUS, Rikshospitalet består i dag av busulfan (BU) og syklofosfamid (Cy). Behandlingen starter med BU som gis i høydose på 1,0–1,25 mg/kg fire ganger i døgnet, i fire påfølgende dager med oppstart syv dager før stamcelletransplantasjon. Tidligere ble BU gitt peroralt, men i dag brukes hovedsakelig intravenøs administrering. Etter fire dager med BU gis Cy 50–60 mg/kg som infusjon en gang daglig i to dager. Standardregimet brukes både ved akutte og kroniske leukemier, samt ved alvorlig aplatisk anemi (10). Ved metabolske sykdommer og immundefekter blir Cy i enkelte tilfeller gitt i fire dager. Det kan også være aktuelt å gi Cy i kombinasjon med
helkroppsbestråling (10), eller erstatte Cy med fludarabin for å redusere
behandlingstoksisiteten (11). Det er imidlertid usikkert om BU-fludarabin er like effektivt som BUCy-regimet (11-14). Andre myeloablative kombinasjonsregimer omfatter blant annet melfalan og antithymocyttglobulin (ATG).
5
Ikke-myeloablativ forbehandling
Ikke-myeloablativ forbehandling er hovedsakelig indisert til pasienter over 60 år, samt hos yngre der komorbiditet er en begrensende faktor for bruk av standardregimet (15). Målet med behandlingen er ikke å utslette pasientens egen benmarg, men å oppnå en kraftig
immundempende effekt som gjør det mulig for donors stamceller å etablere seg. Fordi pasientens egen benmarg ikke har blitt utslettet, vil det etter transplantasjonen først etableres en kimær av mottakers og donors stamceller. Dersom transplantasjonen er vellykket vil donors T-celler i de påfølgende dagene gradvis drepe de gjenværende stamcellene hos
mottaker. I tillegg er det ønskelig med en transplantat-mot-leukemi-effekt der donors T-celler dreper resterende tumorceller hos mottaker. Pasienter som gjennomgår ikke-myeloablativ forbehandling har vanligvis kortere opphold på sykehus og isolat enn pasienter som får myeloablativ forbehandling (15).
1.4.2 Høsting og transfusjon av hematopoetiske stamceller
Det finnes ulike metoder for å høste hematopoetiske stamceller fra en donor til
stamcelletransplantasjon. Ved direkte høsting fra benmargen går man inn i hoftekammene og henter ut stamceller derfra. Man kan også høste stamceller direkte fra blodbanen ved
leukaferese etter at donor har fått behandling med CSF. I noen tilfeller blir det også brukt stamceller fra navlestrengsblod (5).
Etter forbehandlingen får pasienten en dag «pause» før de nye stamcellene gis som infusjon på dag åtte i behandlingsregimet. De nye stamcellene vil nå etablere seg i pasientens benmarg og videreutvikle seg til modne blodceller. Etter omtrent 14 dager kan man vanligvis påvise modne leukocytter i blodet til pasienten (16).
1.5 HLA-uforlikelighet
Major histocompatibility complex molecules (MHC-molekyler) er membranassosierte proteiner som presenterer antigener på overflaten av celler slik at disse kan gjenkjennes av T- cellereseptorer (antigenpresentasjon). Humane MHC-molekyler kalles humane leukocytt antigener (HLA) og deles inn i HLA klasse I- og klasse II-molekyler. HLA klasse I-
molekylene uttrykkes på alle kjerneholdige celler og presenterer antigener fra intracellulære patogener (f.eks. virus) for cytotoksiske T-celler (CD8+), mens HLA klasse II-molekyler
6
uttrykkes på B-celler, antigenpresenterende celler (APC) og aktiverte T-celler, og presenterer antigener fra ekstracellulære patogener (f.eks. bakterier) for T-hjelpeceller (CD4+). HLA klasse I-molekylene består av en transmembran α-kjede som danner et kompleks med β2- mikroglobulin. Videre består α-kjeden av tre ekstracellulære domener; α-1, α-2 og α-3, hvorav α-1 og α-2 danner et bindingssete for peptider. HLA klasse II-molekylene består av to
transmembrane kjeder, en α-kjede og en β-kjede, hvorav hver kjede bidrar med ett domene til peptidbindingssetet (9).
HLA-komplekset er lokalisert på kromosom 6 og deles inn i HLA klasse I-, II- og III- regioner, hvorav genene i klasse I- og II-regionene har størst betydning i forbindelse med transplantasjoner. Klasse I-regionen omfatter HLA-A, HLA-B og HLA-C som koder for den tunge kjeden (α-1, α-2 og α-3) i HLA klasse I-molekyler, mens HLA klasse II-regionen omfatter genene som koder for α- og β-kjeden i HLA-DP, HLA-DQ og HLA-DR (9). HLA- genene er svært polymorfe og det er per i dag identifisert flere hundre HLA-alleler. Det store antallet HLA-alleler innebærer videre at det er svært liten sannsynlighet for at ulike individer arver de samme kombinasjonene av HLA-alleler. I forbindelse med transplantasjoner kan ulikheter i HLA-molekyler (HLA-uforlikelighet) føre til immunreaksjoner fordi antigener fra donor/mottaker vil oppfattes som fremmede.
For å redusere risikoen for immunreaksjoner blir det alltid utført vevstyping av både pasienten og potensielle donorer i forkant av en allogen HSCT. Det vanligste er å bruke en HLA-
forlikelig søskengiver hvis det er mulig, evt. foreldre eller andre familiemedlemmer. I de senere årene har det også blitt mer vanlig å bruke HLA-forlikelige, ubeslektede donorer (9, 17). De viktigste HLA-genene man tester for er HLA-A, -B, -C, -DRB1 og -DQB1 (17).
Fordi man ved en HSCT har utslettet pasientens egen benmarg, er det sjelden problemer med rejeksjon av de transplanterte cellene, slik det er ved organtransplantasjon. Ved HSCT vil pasientene imidlertid i større eller mindre grad oppleve en transplantat-mot-vert-reaksjon der modne T-celler fra donor går til angrep på pasientens organ.
1.6 Komplikasjoner etter stamcelletransplantasjon
Forbehandlingsregimet som blir gitt før HSCT er assosiert med stor risiko for toksisitet og komplikasjoner av ulik alvorlighetsgrad. Når det gjelder både BU og Cy er det liten forskjell mellom doser som gir utilstrekkelig effekt og doser som kan gi livstruende toksisitet.
7
Noen komplikasjoner, slik som venookklusiv leversykdom (VOD), er direkte forbundet til forbehandlingsregimet, mens andre oppstår som følge av selve transplantasjonen.
Komplikasjonene kan opptre akutt få dager eller uker etter transplantasjonen, eller oppstå etter flere måneder eller år. Risikoen for mange av komplikasjonene kan reduseres ved å gi
forebyggende behandling før og etter HSCT.
Ved behandling med cytostatika er kvalme en svært vanlig og plagsom bivirkning. Alle pasientene får derfor metoklopramid eller ondansetron som kvalmeprofylakse ved OUS.
Terskelen for kramper reduseres betydelig ved behandling med BU (18). Det er derfor viktig at BU kombineres med krampeforebyggende behandling, som regel gis da fenytoin ved OUS.
1.6.1 Infeksjoner
Det er vanlig at pasienter får infeksjoner i etterkant av HSCT, men typen og
alvorlighetsgraden varierer betydelig. Munnhulen affiseres i stor grad av candida- og aspergillusinfeksjoner. Det blir derfor gitt profylaktisk behanding med flukonazol i tre måneder etter HSCT. For å forebygge lungebetennelse med Pneumocystis jiroveci blir det i tillegg gitt behandling med trimetoprim-sulfa fra tre uker til fire dager før HSCT.
Behandlingen fortsetter deretter i ytterligere seks måneder etter at pasienten har oppnådd stabil benmargsfunksjon (leukocytter >1,0 x 109/L). Pasienter som er positive for herpes simplex-virus og varicella-zoster-virus, eller som får stamceller fra en positiv donor, får valaciklovir fra dagen før til en måned etter transplantasjon (5, 10).
Cytomegalovirus
Cytomegalovirus (CMV) er et herpesvirus som ofte fører til komplikasjoner hos både organ- og stamcelletransplanterte pasienter. Viruset er svært utbredt i befolkningen og gir vanligvis ingen sykdom hos immunkompetente individer. Etter førstegangsinfeksjon vil imidlertid viruset ligge latent og kunne reaktiveres som følge av tilstander som reduserer
immunforsvaret. Det er anslått at reaktivering og utvikling av en CMV-infeksjon skjer hos 30
% av pasienter som gjennomgår allogen stamcelletransplantasjon (19). Reaktivering skjer som oftest i løpet av de første 30 dagene etter HSCT. En CMV-infeksjon kan blant annet føre til en alvorlig form for lungebetennelse (interstitiell pneumoni). Pasientene følges derfor opp nøye, og dersom en CMV-infeksjon oppstår startes vanligvis behandling med ganciklovir (10, 19, 20).
8
1.6.2 Toksiske effekter knyttet til forbehandlingen
Hemorragisk cystitt
Cytostatikabehandlingen, og da særlig Cy, kan føre til hemorragisk cystitt, som kjennetegnes av sår, blødninger og betennelser i slimhinnen i urinblæren. Hemorragisk cystitt forebygges ved bruk av uroprotektor (mesna) som binder toksiske nedbrytningsprodukter og forsert hydrering under BU-Cy-behandlingen(10).
Mukositt
Som følge av cytostatika- eller strålebehandling kan det oppstå direkte skade på celler i slimhinnene i kroppen. Det kan føre til alvorlige inflammasjoner i slimhinner (mukositt) i blant annet munn og tarm. Oral mukositt gir ofte svært smertefulle sår i munnhulen og pasientene behandles derfor ofte med opiater. Sårene medfører også en risiko for infeksjoner.
Venookklusiv leversykdom (VOD)
VOD er en alvorlig komplikasjon hvor hepatocyttene og endotelcellene i leversinusoider har blitt skadet av toksiske cytostatikametabolitter eller ioniserende stråling. Skadene fører etter hvert til obstruksjon av blodstrømmen i leversinusoidene, med påfølgende nekrose av hepatocytter. Alvorlig VOD opptrer som regel innen fire uker etter HSCT og kan føre til multiorgansvikt og i verste fall død. Gjennomsnittlig insidens av VOD angis ofte å være 8–
14 % i studiepopulasjoner, men den er også rapportert å være høyere eller lavere, avhengig av diagnostiske kriterier (21, 22). VOD diagnostiseres vanligvis ved bruk av enten Seattle eller Baltimore kriteriene (Dalle). Ved Rikshospitalet brukes Seattle-kriteriene som definerer VOD som bilirubinkonsentrasjon i serum ≥34 µmol/L, hepatomegali med abdominalsmerter på høyre side og ascites med eventuell vektøkning (>2 %). To eller flere av disse kriteriene må være til stede før dag 30 etter HSCT (21)
Det blir ikke gitt noen profylakse mot VOD i Norge i dag. Studier har imidlertid vist at prognosen ved alvorlig VOD kan bedres ved antitrombotisk behandling med defibrotid (Defitelio®) (10, 23, 24).
9
1.6.3 Transplantat-mot-vert-sykdom (GVHD)
GVHD er en immunologisk respons der modne T-celler fra donor går til angrep på pasientens vev og organer som oppfattes som fremmede pga. forskjeller i HLA-genotype. I tillegg kan forbehandlingsregimet gi skader på vev og organer som kan akselerere den immunologiske responsen ytterligere.
Man skiller mellom akutt GVHD, som oppstår ≤ 100 dager etter HSCT, og kronisk GVHD, som oppstår > 100 dager etter HSCT. Akutt GVHD klassifiseres fra grad 1 til 4 og omfatter hovedsakelig symptomer som hudutslett, diaré og hyperbilirubinemi som følge av
levertoksisitet. Ved grad 2–4 får pasienten behandling med metylprednisolon. Kronisk GVHD er i tillegg assosiert med symptomer fra luftveiene og slimhinner, infeksjoner og
nevromuskulære symptomer. Tilfeller av kronisk GVHD klassifiseres som «limited» eller
«extensive». Kronisk GVHD behandles primært med CsA og
glukokortikoider.Alvorlighetsgraden av GVHD er assosiert med HLA-forlikelighet mellom donor og mottaker, der større grad av uforlikelighet gir økt risiko for alvorlig GVHD (25).
For å forebygge GVHD blir det gitt CsA fra dagen før stamcelletransplantasjon og i inntil seks måneder etter transplantasjon. De fleste pasientene får i tillegg forebyggende behandling med metotreksat som gis dag 1, 3, 6 og 11 etter HSCT (26).
Ciklosporin (CsA)
CsA virker immundempende ved å hemme fosfatasen kalsineurin og dermed
defosforyleringen av transkripsjonsfaktoren NFAT (nuclear factor of activated T-cells). Dette motvirker transkripsjonen av proinflammatoriske cytokiner, som blant annet interleukin-2 (IL-2), noe som igjen bidrar til å hemme proliferasjonen av T-celler (27).
CsA har et smalt terapeutisk vindu og stor variabilitet i farmakodynamikk og -kinetikk. Det er derfor vanskelig å forutsi legemiddelresponsen hos den enkelte pasient. Det er særlig stor individuell variasjon i absorpsjon og metabolisme av legemidlet. CsA metaboliseres via cytokrom-P450 (CYP)-enzymene CYP3A4 og CYP3A5 i tarm og lever til de tre
hovedmetabolittene AM1, AM9 og AM4N (Figur 1) (28). Aktiviteten til CYP3A-enzymene vil dermed påvirke både biotilgjengeligheten og eliminasjonen av legemidlet. CsA er i tillegg substrat for efflukstransportøren P-glykoprotein (P-gp; ABCB1), som blant annet er uttrykt i tarm, nyrer og lever, og pumper CsA ut av celler (Figur 1). Biotilgjengeligheten og
10
eliminasjonen av CsA påvirkes dermed trolig også i stor grad av aktiviteten til denne transportøren. Aktiviteten til CYP-enzymene og P-gp avhenger videre både av fysiologiske faktorer, genetikk og miljøfaktorer. Absorpsjonen av perorale CsA-formuleringer kan i tillegg påvirkes direkte av sykdomstilstand og tilstedeværelse av mat og galle i
gastrointestinaltraktus (29). De første 15–20 dagene etter HSCT blir CsA vanligvis
administrert intravenøst en gang daglig, fulgt av peroral dosering to ganger daglig. De første intravenøse dosene gis som faste doser i henhold til vekt, og deretter styres den videre doseringen etter konsentrasjonsmålinger.
Figur 1: Metabolisme av ciklosporin. Metabolisme av CsA skjer via CYP3A-enzymer. I tillegg pumper P-gp (ABCB1) CsA ut av cellene. AM4N, AM9 og AM1 er hovedmetabolittene og er anslått å ha <10 % av aktiviteten til CsA.
11
1.7 Myeloablativ kjemoterapi
Regimer for myeloablativ forbehandling før stamcelletransplantasjon består vanligvis av de alkylerende cytostatika BU og Cy. Alkylerende cytostatika er forbundet med mindre toksisitet og bedre effekt på ikke-prolifererende tumorceller enn andre typer kjemoterapi, som
antrasykliner og taksaner (30).
1.7.1 Busulfan (BU)
BU er et alkylsulfonat som kryssbinder DNA og hemmer DNA-replikasjon og celledeling.
DNA-skaden fører videre til celledød ved apoptose (31). Legemidlet har toksisk effekt på ikke-proliferende stamceller i benmargen, samt på maligne celler ved for eksempel ALL, AML og KML. Den begrensede toksisiteten på modne lymfocytter gjør at BU må kombineres med andre cytostatika i myeloablative forbehandlingsregimer. Tidligere var BU bare
tilgjengelig som oral formulering. Dette medførte stor inter- og intraindividuell variasjon i farmakokinetikk, toksisitet og effekt. Introduksjonen av en intravenøs BU-formulering har bidratt til å redusere variasjonen i biotilgjengelighet. Bruken av intravenøs BU har også blitt assosiert med lavere risiko for levertoksisitet (18, 30), men det er fortsatt store forskjeller i BU-farmakokinetikk, -toksisitet og -effekt mellom individer (31). BU blir detoksifisert via konjugering med glutation (GSH) og denne reaksjonen katalyseres av glutation S-transferaser (GST). Det viktigste GST-isoenzymet som katalyserer denne konjugeringen er GST-alfa 1 (GSTA1), men enzymene GST-my 1 (GSTM1) og GST-pi 1 (GSTP1) er også rapportert å være involvert i detoksifiseringen av BU (Figur 2) (32). De store individuelle variasjonene i BU-eksponering, effekt og toksisitet kan trolig både skyldes forskjeller i glutationnivåer og funksjonen til GST-enzymer, som igjen avhenger av fysiologi, miljøfaktorer og genetiske faktorer (31, 33, 34).
Ved oppstart gis BU som faste doser i henhold til kroppsvekt, mens den videre doseringen vanligvis styres etter plasmakonsentrasjonsmålinger (30). Ved Rikshospitalet tilstrebes det å oppnå en gjennomsnittlig likevektskonsentrasjon (Css) på ca. 900 µg/L.
12
1.7.2 Syklofosfamid (Cy)
Cy er en sennepsgassanalog som alkylerer DNA og hemmer celledeling, spesielt delingen av immunceller og kreftceller. I lavere doser brukes Cy som immunsuppressiva til behandling av autoimmune sykdommer, som for eksempel reumatoid artritt. Gitt som høye doser brukes Cy som cytostatika i behandling av ulike kreftformer og som en del av forbehandlingsregimet ved HSCT. Cy er et prodrug og aktiveres av CYP-enzymer i leveren til den aktive
metabolitten fosforamid-sennepsgass. Dette skjer først ved oksidering av Cy til 4-
hydroksysyklofosfamid som er i likevekt med aldofosfamid (Figur 3). Reaksjonen katalyseres blant annet av CYP2A6, -2B6, -2C9, -2C19, -3A4 og -3A5 enzymene, der CYP2B6-enzymet har vist høyest aktivitet (35, 36). Aldofosfamid er ikke selv cytotoksisk, men diffunderer inn i cellene og brytes raskt ned til de aktive metabolittene fosforamid-sennepsgass og akrolein.
Fosforamid-sennepsgass har vist å være assosiert med terapeutisk effekt, mens akrolein er særlig forbundet med flere av de toksiske bivirkningene ved Cy (33, 35).
Figur 2: Metabolisme av busulfan via GST-isoenzymer. GSH, glutation; GSTA1, glutation S-transferase (GST)-alfa 1; GSTM1, GST-my 1; GSTP1, GST-pi 1; CYP, cytokrom P450; DPEP, dipeptidase; GGT, gamma-glutamyl-transferase; NAT, N-acetyl-transferase; FMO, Flavin monooksygenase.
13
Cy-metabolittene detoksifiseres via aldehyd dehydrogenaser, CYP-enzymer og GST-enzymer (Figur 3). CYP3A4 og -3A5 er hovedansvarlig for deaktivering av Cy, som skjer ved
oksidasjon av sidekjedene som gir dannelse av den inaktive metabolitten 2-
dekloroetylsyklofosfamid og den cytotoksiske metabolitten kloroacetaldehyd. GSH er også involvert i detoksifisering av Cy, da i særlig grad metabolittene 4-hydroksysyklofosfamid, fosforamid-sennepsgass og akrolein.
Behandlingen med Cy kompliseres av store inter- og intraindividuelle forskjeller i farmkokinetikk og legemidlets smale terapeutiske område. Faktorer som dose, alder, diagnose, annen behandling og genetiske faktorer spiller en vesentlig rolle på effekt og toksisitet av legemidlet (33).
Figur 3: Metabolismeveier for syklofosfamid.
Aktive eller cytotoksiske metabolitter er angitt i blått, mens inaktive forbindelser er illustrert i grått.
Aldofosfamid diffunderer inn i celler og nedbrytes til fosforamid-sennepsgass og akrolein.
CYP, cytokrom P450; GSH, glutation; GST, glutation-S-transferase; ALDH, aldehyd dehydrogenase.
14
1.8 Terapeutisk legemiddelmonitorering
Terapeutisk legemiddelmonitorering («therapeutic drug monitoring»; TDM) er særlig viktig for legemidler med smale terapeutiske områder og stor farmakokinetisk variabilitet, slik som er tilfellet for CsA, Cy og BU. TDM baseres på måling av en kjemisk parameter, vanligvis legemiddelkonsentrasjon, i bestemte biologiske væsker for videre å kunne tilpasse den
enkeltes legemiddeldosering slik at man oppnår konsentrasjoner innenfor et ønsket terapeutisk område.
1.9 Farmakogenetikk
Dagens TDM er ikke tilstrekkelig for å individualisere legemiddelbehandling med BU og CsA. For Cy har det vist seg vanskelig å utvikle egnede metoder for TDM. En av grunnene til dette er at metabolittene er ustabile og sammenhengen mellom behandlingseffekt og
-toksisitet og konsentrasjoner av Cy og de ulike metabolittene i liten grad er kartlagt. Det er derfor et stort behov for å optimalisere behandling med BU, CsA og Cy ytterligere. Flere studier har vist at individuelle forskjeller i farmakokinetikken til disse tre legemidlene til dels kan forklares av variasjoner i gener som koder for metabolismeenzymer eller
legemiddeltransportører (31, 33, 37, 38).
Genvarianter med betydning for CYP3A-aktivitet
CYP3A4- og CYP3A5-enzymene har stort overlapp i substratspesifisitet og er involvert i metabolismen av både Cy og CsA.
Aktiviteten til CYP3A5-enzymet er i stor grad genetisk betinget. CYP3A5*1-allelet koder for et funksjonelt CYP3A5-enzym. Det vanligste allelet blant kaukasiere er imidlertid CYP3A5*3 med allelfrekvens på 85–90 %. Videre er frekvensen 60–73 % blant asiatere og 27–55 % hos afroamerikanere. Allelet karakteriseres av en enkeltnukleotidvariant (SNV) i posisjon c.219- 237A>G (jf. NM_000777.3, rs776746) i intron 3 som medfører en spleisedefekt som gir svært lavt eller manglende uttrykk av CYP3A5-enzymet. Personer som er homozygote for
CYP3A5*3-allelet vil ha et ikke-funksjonelt enzym, mens de med ett eller to CYP3A5*1-allel vil uttrykke enzymet. Individer med funksjonelt enzym vil derfor metabolisere noen CYP3A- substrater raskere enn de som ikke uttrykker enzymet (39).
15
Aktiviteten til CYP3A4-enzymet påvirkes i stor grad av fysiologi og miljøfaktorer som hormoner, næringsmidler, alder og bruk av legemidler, men også av genetiske faktorer. Det er per i dag rapportert om mer enn 40 allelvarianter i CYP3A4-genet. Den kliniske betydningen av disse er best dokumentert for CYP3A4*22-allelet, som karakteriseres av en SNV i posisjon c.522-191C>T (jf. NM_017460.5, rs35599367) i intron 6 i CYP3A4-genet. Allelfrekvensen av CYP3A4*22 er cirka 3–8 %. Hos personer med dette allelet har man sett en sammenheng med redusert uttrykk av CYP3A4-genet i lever. Individer uten dette allelet viser 1,7 ganger høyere mRNA-uttrykk og 2,5 ganger høyere enzymaktivitet sammenlignet med bærere av CYP3A4*22-allelet (40).
CsA metaboliseres av både CYP3A4 og CYP3A5 og betydningen av CYP3A5*3 og CYP3A4*22-allelene har blitt undersøkt i flere studier. CYP3A4*22 har blitt assosiert med CsA-clearance (37), og det er videre rapportert at pasienter med ett eller to CYP3A4*22- alleler får høyere CsA-konsentrasjoner enn pasienter uten allelet, og dermed trenger lavere CsA-doser for å oppnå konsentrasjoner innenfor ønsket område (40). Enkelte studier viser også en sammenheng mellom CYP3A5-genotype og CsA-konsentrasjoner (38, 41), mens andre studier ikke observerer noen assosiasjon (37, 42).
Genvarianter med betydning for CYP2B6-aktivitet
CYP2B6-enzymaktiviteten påvirkes både av miljøfaktorer og genetiske faktorer. Det er identifisert minst 38 CYP2B6-allelvarianter, hvorav flere har blitt assosiert med redusert enzymaktivitet (43). Den best karakteriserte CYP2B6-genvarianten som er assosiert med redusert enzymaktivtet er SNVen c.516G>T (jf. NM_000767.4, rs3745274/rs56308434) i ekson 4. Allelfrekvensen varierer mellom folkegrupper og er cirka 15–32 % blant europeere og populasjoner fra Øst-Asia, og ca. 35–41 % i populasjoner fra Afrika og Sør-Asia. En annen CYP2B6-variant som har blitt assosiert med lavere CYP2B6-proteinuttrykk og
-enzymaktivitet er sekvensvarianten c.1459C>T (jf. NM_000767.4, rs3211371) som er lokalisert i ekson 9 i CYP2B6-genet og gir aminosyresubstitusjonen
NP_000758.1:p.Arg487Cys. Allelfrekvenser for CYP2B6 c.1459C>T er rapportert å være cirka 3–14 % blant kaukasiere.
Flere studier tyder på at det er en sammenheng mellom CYP2B6-genvarianter og endret metabolisme av Cy (44-46). CYP2B6 c.516G>T er assosiert med redusert effekt og toksisitet ved behandling med Cy i kombinasjon med fludarabin ved at genotypevarianten har
16
innvirkning på aktiveringen av Cy (47). Den kliniske betydningen av CYP2B6 c.1459C>T er i mindre grad kartlagt og det finnes foreløpig lite data vedrørende mulige assosiasjoner mellom denne sekvensvarianten og Cy-metabolisme (44, 46).
Glutation S-transferase
GST-enzymene katalyserer konjugeringen av elektrofile forbindelser med GSH. Det er rapportert at aktiviteten til flere av disse enzymene avhenger av genetiske faktorer, der
spesielt varianter i genene som koder for GST-alfa 1 (GSTA1), GST-my 1 (GSTM1) og GST- pi 1 (GSTP1) har blitt assosiert med metabolisme av legemidler, deriblant BU og Cy.
Isoenzymet GSTA1 kodes for av GSTA1-genet som er lokalisert på kromosom 6.
Sekvensvarianten c.-135T>C (NM_145740.3, rs3957357, tidligere kjent som c.-69C>T) i promoterområdet til GSTA1-genet differensierer mellom haplotypene GSTA1*A (=C) og GSTA1*B (=T), hvor GSTA1*B er forbundet med redusert enzymaktivitet. Allelfrekensen for GSTA1*B er rapportert å være 40–46 % blant europeere, 32–36 % blant sør-asiater, 28–36 % blant afrikanere og 12–16 % blant øst-asiater (48). GSTM1-enzymet kodes av GSTM1-genet som vanligvis forekommer som 0, 1 eller 2 genkopier. Individer som har GSTM1 kopitall 0 er homozygote for delesjon av genet og mangler GSTM1-enzym, mens bærere av 1 og 2
genkopier uttrykker enzymet.
Genvariantene som er assosiert med GSTA1- og GSTM1-enzymaktivitet kan også være relevante med tanke på effekt og toksisitet av både BU og Cy (33, 35). Studier viser at bærere av ett eller to GSTA1*B-alleler har økt konsentrasjon og redusert clearance av BU (18, 31, 49, 50). Det er videre rapportert om assosiasjoner mellom GSTM1-kopitall og BU-clearance og konsentrasjon (31), samt at kombinasjonen av GSTA1- og GSTM1-genotyper i større grad kan forklare invididuelle forskjeller i BU-eksponering og -toksisitet enn de individuelle
genotypene (31, 50, 51).
Genvarianter med betydning for P-gp-aktivitet
P-gp kodes av ABCB1-genet som består av 29 eksoner (Assembly GRCh38). En rekke studier har undersøkt mulige assosiasjoner mellom ulike ABCB1-genvarianter og P-gp-uttrykk og -funksjon. De mest studerte genvariantene er c.1236T>C (jf. NM_000927.4, rs1128503), c.2677T>G/A (rs2032582) og c.3435T>C (rs1045642), som er lokalisert henholdsvis i ekson 12, 21 og 26. Variantene c.1236T>C og c.3435T>C er synonyme og gir ingen
17
aminosyresubstitusjon. De koder imidlertid for aminosyrer som er lokalisert i det første (p.Gly412=) og andre (p.Ile1145=) ATP-bindende domenet, og det er rapportert at
sekvensvariantene kan påvirke P-gp-proteinkonformasjon og interaksjon med substrater (52, 53). Sekvensvarianten c.2677T>G/A gir aminosyresubstitusjonen p.Ser893Ala/Thr (jf.
NP_000918.2) som er lokalisert i den cytoplasmatiske sløyfen til transportproteinet.
Allelfrekvensen for ABCB1 c.1236T>C, c.2677T>G og c.3435T>C er rapportert å variere mellom henholdsvis ca. 10–70 %, 36–98 % og 42–88 % i ulike geografiske populasjoner.
Blant europeere er tilsvarende allelefrekvenser rapportert å variere mellom ca. 57–62 %, 53–
62 % og 42–54 % (48).
Individer med T i posisisjon c.3435 har blitt rapportert å ha lavere P-gp uttrykk i tarm og økt biotilgjengelighet av P-gp-substrater som digoksin og CsA (38, 54-56). For P-gp-substratet feksofenadin er imidlertid T-allelet assosiert med økt P-gp-aktivitet og dermed lavere biotilgjengelighet (57). Andre studier rapporterer at c.3435T>C varianten er av liten eller ingen betydning for CsA-eksponering (42, 58). En studie blant HSCT-pasienter har vist en assosiasjon mellom T-allel i posisjon c.1236 og redusert transplantasjonsrelatert mortalitet og forlenget totaloverlevelse (59). Det er videre vist en sterk koblingsulikevekt mellom
seksvensvariantene c.1236T>C, c.2677T>G og c.3435T>C, som i mange populasjoner ofte forekommer som T-T-T- og C-G-C-haplotyper (60). T-T-T-haplotypen har blant annet blitt assosiert med økt serumkonsentrasjon av digoksin (53). Videre har både c.1236 T/T og c.2677 T/T genotyper blitt assosiert med høyere CsA-konsentrasjoner og det er i tillegg vist
signifikant lavere C0 av CsA for C-G-C-haplotypen sammenlignet med T-T-T-haplotypen (61). En annen studie rapporterte imidlertid redusert eksponering av digoksin og feksofenadin blant bærere av c.2677 T-allel (57). Andre studier finner imidlertid ingen signifikante
sammenhenger mellom disse ABCB1-genvariantene og CsA-konsentrasjon (54, 58).
En annen ABCB1-sekvensvariant som har blitt assosiert med legemiddelrespons er c.61A>G (rs9282564) i ekson 2 som gir aminosyresubstitusjonen p.Asn21Asp. Allelfrekvensen er 5–12
% blant europeere, 1–4 % i populasjoner fra Sør-Asia og < 0,5 % blant afrikanere og
populasjoner fra Øst-Asia (48). Funnene fra en in vitro studie tyder på at sekvensvarianten gir redusert transportfunksjon (62). En studie blant hjertetransplanterte pasienter har videre vist at bærere av G-allelet har økt risiko for nefrotoksisitet. Den samme studien fant også at
pasientene med variantallel (G) hadde en høyere konsentrasjon av takrolimus eller ciklosporin
18
enn pasienter uten denne varianten, noe som muligens kan forklare assosiasjonen med nefrotoksisitet (63).
1.9.1 Prøvemateriale til genanalyser etter stamcelletransplantasjon
Genetiske analyser utføres vanligvis basert på fullblodsprøver eller celler fra munnhule.
Pasienter som har gjennomgått en allogen stamcelletransplantasjon vil imidlertid ha leukocytter som har opphav i stamcellene fra donor. Dette innebærer at genanalyser som utføres i blodprøver tatt etter stamcelletransplantasjon primært gir informasjon om donors genotype, og at resultatet dermed ikke er representativt for genotypen i pasientens vev og organer. For mange pasienter er det ikke tilgang på blodprøver tatt før transplantasjon, og eventuell genotyping av disse pasientene blir derfor vanskelig. Man kunne i prinsippet også benyttet spytt fra slimhinnene i munnen, men studier viser at det blir svært varierende mengde donor-DNA i disse prøvene fordi blant annet infeksjoner og bruk av immunsuppressiva vil påvirke mengden leukocytter (inneholder donor-DNA) i spyttet (64, 65). Det er imidlertid flere studier som indikerer at hårsekker kun inneholder pasientens eget DNA (64-67), og at dette derfor kan være en god kilde for å utføre genetiske analyser. Studier som har benyttet sensitive analysemetoder for spesifikk identifikasjon av donor-DNA har likevel klart å påvise små mengder donor-DNA i prøver fra hårfollikler (68, 69). Dette vil imidlertid neppe påvirke resultatene ved genotyping med sanntidspolymerase kjedereaksjon (PCR) og
smeltekurveanalyse fordi eventuell forekomst av små mengder donor-DNA vil
«undertrykkes» under amplifikasjonen og fordi metoden gir en indikasjon på det kvantitative forholdet mellom ulike alleler.
19
2 Problemstilling
Allogen stamcelletransplantasjon er et viktig behandlingsalternativ for pasienter med maligne blodsykdommer og enkelte ikke-maligne, genetiske sykdommer. Standard forbehandling i forbindelse med stamcelletransplantasjon består i dag av kjemoterapi med BU og Cy for å utslette pasientens egen benmarg. Doseringen av disse cytostatika er krevende, da for lav eksponering kan øke risikoen for tilbakefall, mens for høy eksponering øker risikoen for livstruende toksisitet. BU blir dosert etter vekt ved oppstart, og deretter blir dosen individuelt tilpasset basert på blodkonsentrasjonsmålinger. Derimot gis Cy som faste doser i henhold til vekt. I tillegg til forbehandlingen får pasientene CsA og metotreksat som profylakse mot transplantat-mot-vert-sykdom (GVHD). CsA har et smalt terapeutisk vindu og stor
farmakokinetisk variabilitet og doseringen styres derfor etter konsentrasjonsmålinger i blod.
Til tross for vekt- og konsentrasjonsstyrt dosering så er behandlingen med cytostatika og immundempende legemidler fortsatt en viktig årsak til alvorlige komplikasjoner i forbindelse med stamcelletransplantasjon. Det er derfor ønskelig å studere andre parametere som kan bidra til ytterligere individualisering av legemiddelbehandlingen ved
stamcelletransplantasjon, og som dermed kan bidra til å bedre de kliniske resultatene etter stamcelletransplantasjon.
Hensikten med denne masteroppgaven er å undersøke assosiasjoner mellom gener som er involvert i metabolisme eller transport av legemidlene BU, Cy og CsA og markører på legemiddeleffekt og -toksisitet hos pasienter som har gjennomgått allogen
stamcelletransplantasjon.
20
3 Metode
3.1 Reagenser og utstyr
Reagens/Kit Produsent Kat.nr.
LightCycler® 480 Probes Master Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
04707494001 LightCycler® 480 SYBR Green I
Master
Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
04707516001 MagNA Pure LC DNA Isoltation Kit I Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
03003990001 MagNA Pure 96 DNA and Viral NA
Small Volume Kit
Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
06543588001 MagNA Pure DNA Tissue Lysis
Buffer
Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
04805160001 Proteinase K, recombinant, PCR
Grade
Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
03115828001 DNA Molecular Weight Marker V Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
10821705001 Reliant Gel System 4 % NuSieve 3:1
Plus Agarose, 8 well
Lonza, Basel, Sveits (Lev. MedProbe AS)
54927
Bromphenol Blue Sigma-Aldrich Norway AS B-0126
Ficoll PM400 Amersham Pharmacia Biotech
AB
17-0300-10
ExoProStar™ GE Healthcare Life Science US78211
BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit
Applied Biosystems, Foster City, CA, USA
4336917 10x Tris/Boric Acid/EDTA (TBE)
Buffer
Bio-Rad, Norway 161-0733
Primere og prober, egendesignede (se Vedlegg 12 og 13)
TIB MOLBIOL, Berlin, Tyskland
- TE Buffer, 1X, Molecular Biology
Grade
Promega Corporation, Madison, WI, USA
V6231 BigDye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing Kit
Applied Biosystems, Foster City, CA, USA
4337455
Utstyr Produsent Kat.nr.
Micro tube, 1,5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland 72 690 001 LightCycler®480 Instrument Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
05015278001 Tabell 1: Oversikt over reagenser
Tabell 2: Oversikt over instrumenter og utstyr
21
LightCycler®480 Multiwell Plate 96 Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
04729692001 LightCycler® 480 Sealing Foil Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
04729757001 LightCycler®Software, Version 1.5 Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
04994884001 MagNA Pure LC 2.0 Instrument Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
05197686001 MagNA Pure LC Cartridge Seal Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
03118827001 MagNA Pure LC Cooling Block, 96-
well PCR Plate
Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
12189674001 MagNA Pure LC Sample Cartridges Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
03004112001 MagNA Pure LC Processing
Cartridges
Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
03004147001 MagNA Pure LC Medium Reagent
Tubs 20
Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
03004058001 MagNA Pure LC Reagent Tubs (large) Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
03004040001 MagNA Pure LC Tub Lids (small,
medium)
Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
03004082001 MagNA Pure LC Tub Lids (large) Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
03004074001 MagNA Pure LC Reaction Tips
(small)
Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
03004180001 MagNA Pure LC Reaction Tips
(large)
Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland
03004171001 MagNA Pure 96 Instrument Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
06541089001 MagNA Pure 96 Processing Cartridge Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
06241603001 MagNA Pure 96 Output Plate Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
06241611001 MagNA Pure Sealing Foil Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
06241638001 MagNA Pure Tip 1000µL Roche Diagnostics, GmbH,
Mannheim, Tyskland
06241620001 Eppendorf® Thermomixer R Dry
Block Heating and Cooling Shake
Eppendorf, AG, Hamburg, Germany
Z605271 Nanodrop®ND-1000
Spectrophotometer
Life Science, Saveen Werner RH 36798 MicroAmp PCR-rør Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA
N8010580 MicroAmp korker Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA
N810535 Bio-Rad Molecular Imager GelDoc™
XR
Bio-Rad 170-8170
MJ Research PTC-200 Thermal Cycler
Bio-Rad 05434-05
ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (kapillærelektroforese-sekvensator)
(Avd. for medisinsk genetikk, OUS)
RH 34718
22
3.2 «AlloSS-young»-studien
«The Norwegian Allo Survivorship Study» (AlloSS) kartlegger langsiktige komplikasjoner hos pasienter som er stamcelletransplantert ved OUS, Rikshospitalet i tidsrommet 1983–2008.
Delstudien «AlloSS-young», som dette masterprosjektet er en del av, fokuserer på subpopulasjonen med barn og yngre pasienter (< 30 år) fra «AlloSS».
Det ble totalt inkludert 111 pasienter i «AlloSS-young» studien i perioden fra juni 2014 til januar 2016. Kriteriene for inklusjon var at pasienten hadde fått HSCT ved OUS,
Rikshospitalet før pasienten var fylt 30 år og at diagnosen ikke var Hurlers syndrom (mukopolysakkaridose type I). Et ytterligere krav var at pasientene hadde blitt fulgt opp i minimum fem år etter HSCT. Pasientene måtte også være i live ved studiestart og samtykke skriftlig til deltakelse i studien. Totalt 15 pasienter ble ekskludert fra den farmakogenetiske delen av studien på grunn av manglende prøvemateriale eller etter ønske fra pasienten.
Delstudien i denne masteroppgaven omfatter dermed totalt prøvemateriale fra 96 pasienter.
3.2.1 Pasientprøver
For 58 av pasientene ble det innhentet EDTA-blodprøver som var tatt før HSCT og lagret i fryser ved –20 oC. For de resterende 38 pasientene ble det tatt hårprøver etter HSCT. Det ble i tillegg tatt hårprøver fra 18 pasienter hvor det også var tilgang til pre-HSCT blodprøver. Hver hårprøve bestod av ca. 3–10 hårstrå med hårfollikler. Etter prøvetaking ble hårfolliklene overført til Sarstedt-rør med 260 µL Tissue Lysis Buffer og frosset ved –20 oC frem til videre prøveopparbeidelse. Tissue Lysis Buffer bidrar til at cellene i hårfolliklene sprekker og DNA kommer ut i væsken. Nedfrysningen vil også bidra til denne prosessen.
3.3 Isolering av DNA
Før de genetiske analysene kunne gjennomføres ble det isolert DNA fra prøvematerialene ved hjelp av et robotsystem. For hårprøvene var det også nødvendig med en enkel
prøveopparbeidelse i forkant av isoleringen.
23
3.3.1 Forbehandling av hårprøver før DNA-isolering
Hårprøvene med 260 µL Tissue Lysis Buffer ble tint og tilsatt 40 µL Proteinase K før varmebehandling med kontinuerlig risting (500 rpm) på Eppendorf Thermomixer comfort.
Varmebehandlingen startet med 65 oC i 20 minutter, etterfulgt av et trinn med 90 oC i 16 minutter. Proteinase K inaktiverer endogene RNaser og DNaser, samt bidrar til lysering av cellene. Fra hvert prøverør ble det deretter overført 100 µL prøvelysat til 96-brønners brett for DNA-isolering på MagNA Pure 96 robot.
3.3.2 DNA-isolering med MagNA Pure robotsystem
Fra blodprøvene ble det isolert DNA ved hjelp av MagNA Pure LC (32-brønners format) og MagNA Pure 96 (96-brønners format)-robotsystemer. For hårprøvene ble det bare brukt MagNA Pure 96 robot. DNA-isoleringen på MagNA Pure LC og MagNA Pure 96 ble utført med henholdsvis MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I og MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit i henhold til produsentens anvisninger (www.roche-applied-
science.com). Prøvevolumet var 100 µL blod eller cellelysat for isolering med MagNA Pure 96 og 150 µL for isolering med MagNA Pure LC. Elueringsvolumet for begge
robotsystemene var 100 µL. Hovedtrinnene for isolering på MagNA Pure instrumentene er vist i Figur 4.
Figur 4: Trinnene for DNA-isolering på MagNA Pure LC.
(Figuren er hentet fra: www.roche-applied-science.com)
24
Prosessen starter med at prøvematerialet (fullblod/lysat fra hårprøver) overføres til et 32- brønners brett (MagNAPure LC) eller 96-brønners brett (MagNA Pure 96) (Trinn 1). Deretter blir det tilsatt Lysis/Binding Buffer til prøvematerialet. Bufferen fører til at cellene lyseres og nukleinsyrene slippes ut i blandingen samtidig som nukleaser denatureres. Tilsetning av Proteinase K fører til videre nedbrytning av proteiner (Trinn 3). I trinn 4 tilsettes magnetkuler (Magnetic Glass Particles, MGPs) som binder DNA som følge av kaotrope saltforhold, isopropanol og høy ionestyrke. Magnetkulene med bundet DNA separeres deretter fra den resterende løsningen ved hjelp av en magnet (Trinn 5), og vaskes flere ganger med
vaskebuffere (Wash Buffer I og II) for å fjerne PCR-hemmere, proteiner og salter (Trinn 6).
Til slutt separereres magnetkulene med bundet DNA fra vaskebufferløsningen (Trinn 7) før DNA elueres fra magnetkulene ved bruk av buffer med lav saltkonsentrasjon (Elution Buffer) og høy temperatur (Trinn 8). DNA-eluatet kan nå brukes videre til genetiske analyser.
3.4 Genetiske analyser
Genvariantene som ble undersøkt i studien er vist i Tabell 3. Analyse av
enkeltnukleotidvarianter ble utført ved sanntids-PCR med påfølgende smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober, mens analyse av GSTM1-kopitall ble gjort ved bruk av kvantitativ sanntids-PCR med hydrolyseprober.
Tabell 3: Oversikt over genetiske analyser
Genetiske analyser Nomenklatur
(HGVS og rs-nummer)
Analysemetode CYP-enzymer
CYP3A4*22 NM_017460.5: c.522-191C>T, rs35599367
Sanntids-PCR;
smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober CYP3A5*3 NM_000777.3: c.219-237A>G,
rs776746
Sanntids-PCR;
smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober CYP2B6 c.516G>T (*6) NM_000767.4: c.516G>T,
rs3745274
Sanntids-PCR;
smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober CYP2B6 c.1459C>T (*5) NM_000767.4: c.1459C>T,
rs3211371
Sanntids-PCR;
smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober GST-enzymer
GSTA1 c.-135T>C NM_145740.3: c.-135T>C, rs3957357
Sanntids-PCR;
smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober
25
3.5 Sanntids-PCR
Sanntids-PCR er en metode for å amplifisere en enkelt DNA-tråd til flere millioner kopier.
Metoden baseres på bruk av en varmestabil DNA-polymerase og gjentatte sykluser med temperaturregulering. Sekvensen som skal amplifiseres defineres av to primere. I tillegg til DNA-templat, DNA-polymerase og primere, så krever reaksjonen deoksynukleotider som
«byggesteiner» og en reaksjonsbuffer med tilpasset MgCl2-konsentrasjon. Ved sanntids-PCR brukes det i tillegg fluorescerende molekyler for å monitorere dannelsen av amplikoner underveis i PCR-reaksjonen. Detaljene for reaksjonsblandingene (mastermikser) som ble brukt for ABCB1, CYP2B6, CYP3A4, CYP3A5, GSTA1 og GSTM1 genanalyser er beskrevet i Vedlegg 1 til 11 og sekvensene for primere og prober er gitt i Vedlegg 12 og 13.
Prøvematerialet og mastermikser ble pipettert til 96-brønners brett ved hjelp av MagNA Pure LC.
De spesifikke PCR-programmene for henholdsvis genotyping ved smeltekurveanalye og kvantitativ kopitallsbestemmelse er beskrevet i Tabell 4 og Tabell 5. Begge programmene består av et denatureringstrinn der DNA-trådene separeres fra hverandre, et annealingstrinn der primere og prober fester seg til komplementær DNA-sekvens og et elongeringstrinn der polymerasen danner nye DNA-tråder. De tre trinnene gjentas i 40-45 sykluser (se Tabell 4 og Tabell 5).
GSTM1 genkopitall Kopitallsvariasjon Relativ kvantifisering ved sanntids-PCR med hydrolyseprober ABCB1 (P-gp)
ABCB1 c.61A>G NM_000927.4: c.61A>G , rs9282564
Sanntids-PCR;
smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober ABCB1 c.1236T>C NM_000927.4: c.1236T>C,
rs1128503
Sanntids-PCR;
smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober ABCB1 c.2677T>G/A NM_000927.4: c.2677T>G/A,
rs2032582
Sanntids-PCR;
smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober ABCB1 c.3435T>C NM_000927.4: c.3435T>C,
rs1045642
Sanntids-PCR;
smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober
26
3.6 Smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober
Smeltekurveanalysen utføres automatisk etter at selve PCR-reaksjonen er ferdig (Tabell 4).
Analysen omfatter en gradvis temperaturøkning under kontinuerlig måling av
fluorescenssignalet som genereres av et par sekvensspesifikke hybridiseringsprober.
Tabell 4: De ulike trinnene i temperaturprogrammet for genotyping ved bruk av smeltekurveanalyse.
Trinn Antall
sykluser
Temperatur Tid Formål/Resultat
Initial fase (denaturering)
1 95 oC 5 min DNA-trådene separeres fra hverandre (denaturering) og DNA-polymerase aktiveres
Amplifikasjon 40
Denaturering 95 oC 10 sek DNA-trådene separeres
Annealing 63 oC 59 oC 10 sek Primere og prober bindes til templattråd og DNA- polymerasen starter syntese av nye komplementære DNA-tråder.
Elongering 72 oC 30 sek Syntese av nye DNA-tråder (kopiering)
Smelting 1 99 oC
38 oC
38 oC 77 oC
10 min 1 min Gradvis økning
DNA-trådene separeres og polymerasen inaktiveres (denaturering ved 99 oC).
Reduksjon av temperatur og binding av prober.
Gradvis temperaturøkning og dissosiering av hybridiseringsprober under kontinuerlig måling av fluorescens (smelteprosessen).
Avkjøling 1 40 oC 30 sek
Hybridiseringsprober er et par med oligonukleotider som bindes spesifikt til en definert gensekvens via hydrogenbindinger. Den ene proben er merket med fluorescein i 3´-ende og kalles donorprobe. Den andre proben er merket med fluoroforen LightCycler® Red i 5´-ende og kalles akseptorprobe (Figur 5A). Lyskilden i LightCycler® 480-instrumentet eksiterer fluoresceinmolekylet på donorproben, som igjen sender ut et fluorescenssignal ved ca. 530 nm (detekteres ikke av instrumentet). Dersom donor- og akseptorproben er bundet til
målsekvensen med 1-5 nukleotiders mellomrom, vil det i tillegg skje en fluorescens resonans energioverføring (FRET) og eksitasjon av fluoroforen på akseptorproben. Dette fører til at akseptorproben sender ut fluoriserende stråling som måles ved 640 nm av instrumentet (Figur 5B). Energioverføringen mellom donor- og akseptorprobe skjer bare når begge probene er bundet til DNA-tråden samtidig (Figur 5A).
