Autoantistoffer ved cøliaki
Klinisk betydning og mulige mekanismer for dannelse
Maja Schenkel, MedStud
Veileder: Ludivg M. Sollid, MD, PhD, professor UiO
Prosjektoppgave, Medisinsk Fakultet UNIVERSITETET I OSLO
Februar 2019
II
Abstract
The principles of basic immunology have shown to play an important role in medicine as immunology reaches into a variety of medical fields. Through a better understanding of the pathogenesis on a molecule level, treatments in forms of immunotherapy can be established.
Writing this thesis, it was therefore logical for me to present a platform of immunological theory before starting to dissect dysregulation that can take place and create autoimmunity.
Coeliac disease is in a unique position with a well-established understanding of the genetic predisposition and with the driver for the disease identified, namely gluten. Thus, I will use this disease as a model to illustrate possible mechanisms underlying production of
autoantibodies. With help of basic concepts, the aim is to illuminate possible mechanisms and see if they have clinical value in diagnostics. Literature were collected from a search in PubMed, and supplemented with references from the supervisor and references cited in what was my primary literature.
The HLA-DQ molecules HLA-DQ2.2, HLA-DQ2.5 and HLA-DQ8 have a chief role in coeliac disease. These HLA molecules preferentially bind deamidated gluten peptides and present them to CD4+ T cells which then become activated. The gluten peptides become deamidated by the enzyme transglutaminase 2 (TG2). This enzyme can also cross-link gluten peptides including to the enzyme itself so that complexes of TG2-gluten are formed. Such TG2-gliadin complexes are the basis of a so-called hapten-carrier model which outlines that gluten specific CD4+ T cells can give help to TG2 specific B cells thereby facilitating formation of the anti-TG2 autoantibodies. This model I will discuss at length.
In the first guidelines for paediatric coeliac disease was considered a food intolerance. The diagnostic scheme was based on intestinal biopsies showing alterations on elimination- provocation diets. In 2012, new guidelines were launched. In these guidelines, IgA anti-TG2 antibodies are central. As I will describe, many patients now effectively get their diagnosis on the basis of having auto-antibodies. Thus, coeliac disease has made a journey from being perceived a food intolerance disorder to being perceived an autoimmune disease. This fact illustrates very well how diagnostic approaches and medical wisdom rapidly can change.
III
Innholdsfortegnelse
Abstract ... II Innholdsfortegnelse ... III
1 Innledning ...1
2 Metode ...2
2.1 Søk i PubMed ...2
2.1.1 Kriterier ...2
2.1.2 Søket ...2
2.1.3 Utvelgelse av artikler ...3
2.2 Tilleggslitteratur ...3
2.2.1 Fagbok...3
2.2.2 Artikler fra veileder ...3
2.3 Dataekstraksjon ...3
3 Resultat ...4
3.1 Grunnleggende immunologisk teori ...5
3.1.1 B-celler reseptor ...5
3.1.2 T-celle reseptorer ...5
3.1.3 Antistoffets oppbygning og funksjon ...6
3.1.4 T- og B-celler reseptorene gjenkjennelsesmetode ...7
3.1.5 Lymfocyttaktivering ...7
3.1.6 Selvtoleranse ...8
3.2 Cøliaki – pasienten foran deg ...12
3.2.1 Hva er cøliaki? ...12
3.2.2 Kliniske aspekter ved cøliaki ...13
3.3 Autoantistoffer ved cøliaki – mulig mekanisme for dannelse ...14
3.3.1 Grunnleggende forsvar i aktuelt vev ...14
3.3.2 Antistoffer ved cøliaki ...14
3.3.3 Mekanismer for produksjon av antistoffer mot TG2 ...15
3.3.4 Unike trekk i immunresponsen ...18
3.4 Klinisk anvendelse av autoantistoffer ved cøliaki ...20
3.4.1 Retningslinjer for diagnostisering av cøliaki ...20
3.4.2 Prospektiv evaluering av retningslinjene ...22
IV
4 Diskusjon ...24
4.1.1 Kommunikasjonen mellom B- og T-celler ...24
4.1.2 Autoimmunitet, er cøliaki en autoimmun sykdom? ...25
4.1.3 Autoantistoffproduksjon mot TG2 ...25
4.1.4 Klinisk anvendelse ...27
4.1.5 Begrensninger ved prosjektoppgaven ...28
4.1.6 Konklusjon ...28
5 Litteraturliste ...30
Figur 1. Seleksjon av T-celler for dannelse av sterk selvtoleranse ...9
Figur 2. Mekanismer for B-celle selvtoleranse ...10
Figur 3. B- og T-celle kommunikasjon. ...11
Figur 4. TG2-spesifikke B-celler reseptor mediert opptak av TG2-gliadin-kompleks. ...16
Figur 5. Enzymatisk aktiv TG2, bundet til BCR, som fortsetter å kryssbinde substrater.. ...16
Figur 6. TG2 danner et multimer og samler BCR, ved å kryssbinde BCR og glutenpeptider. 17 Figur 7. Flytskjema for pasienter med symptomer assosiert med cøliaki ...21
1
1 Innledning
Immunologi er en viktig del av mange sykdomsprosesser, og inngår derfor i bortimot alle medisinske fagfelt. Både ved endokrinologiske, dermatologiske, revmatologiske og
gastroenterologiske sykdommer er immunologi involvert, og behandlinger som interferer med immunologiske prosesser er sentrale (1). For å kunne gi pasientene et best mulig
behandlingstilbud bør leger i alle deler av helsevesenet ha kunnskap om immunologi og hvordan de ulike immunologiske mekanismene fungerer.
I det kliniske møte med cøliaki er det ofte barn med mageproblemer og/eller malabsorpsjon det rapporteres om (2). Sykdommer kan også ramme i voksen alder, ofte i form av et diffus sykdomsbilde, blandet av fordøyelsesrelaterte problemer og andre plager. Grunnen til
fordøyelsesvanskene ligger i tarmen. Over tarmepitelet, barrieren mot omverden, pågår det en immunreaksjon. Ifølge immunologiske teorier er kroppen godt rustet til å motstå en slik selvdestruerende-reaksjon (3). Med en flat tarm som resultat, etter tarmtottatrofi og krypthypertrofi (4, 5), gir det seg at næringsstoffer absorberer dårlig. En pågående inflammasjonsprosess kan medføre magesmerter eller løs avføring. Molekylært er det en intrikat prosess i gang.
Denne oppgaven skal ta for seg dannelsen av autoantistoffer ved cøliaki, og jeg vil derfor starte med en presentasjon av grunnleggende immunologiske prinsipper og en redegjørelse for hvordan autoantistoffer kan dannes. Oppgaven begrenses til å primært omhandle mulige mekanismer for dannelse av autoantistoffer, og hvordan sykdomsspesifikke autoantistoffer ved cøliaki brukes i diagnostikk, særlig i pediatrien.
Det er en pågående debatt om hvorvidt autoantistoff-tester er spesifikke nok til å kunne stille en cøliaki-diagnose uten å benytte seg av biopsi (2). Utfallet av denne debatten vil ha store konsekvenser for pasientene, og denne oppgaven vil lage et teoretisk bakteppe for å bedre forstå denne diskusjonen.
2
2 Metode
2.1 Søk i PubMed
Søket er ment for oppgaveseksjonen som tar for seg mekanismer for dannelse av autoantistoffer ved cøliaki.
2.1.1 Kriterier
Inklusjonskriterier:
Omhandler cøliaki.
Ser på mulige mekanismer/patogenese for dannelsen av autoantistoffer ved cøliaki.
Gluten og transglutaminase.
Eksklusjonskriterier:
Litteratur publisert før 2009
Litteratur publisert på andre språk enn engelsk Tilgjengelig abstract i PubMed
2.1.2 Søket
Det har blitt søkt etter relevante artikler i PubMed databasen, publisert mellom 2009- 2019(søket ble gjennomført 9.jan 2019). Se fullstendig søk nedenfor.
Søk i PubMed:
((("gliadin"[MeSH Terms] OR "gliadin"[All Fields]) OR ("transglutaminases"[MeSH Terms]
OR "transglutaminases"[All Fields])) AND "celiac disease"[MeSH Major Topic]) AND
"autoantibodies/immunology"[MeSH Terms] AND hasabstract[text] AND ("2009/01/12"[PDat] : "2019/01/09"[PDat] AND English[lang])
3
2.1.3 Utvelgelse av artikler
Først så jeg igjennom artiklenes overskrifter, så abstrakter/sammendrag for å identifisere de relevante artiklene. Videre leste jeg fulltekst for endelig avgjørelse om deres inklusjon.
2.2 Tilleggslitteratur
For å dekke grunnleggende immunologisk teori, nyere oppdagelser og til slutt den kliniske verdien av autoantistoffer ved cøliaki var det behov for litteratur utover søket.
2.2.1 Fagbok
2.2.2 Artikler fra veileder
Artikler for grunnleggende immunologi og cøliaki for å komplementere og holde fagstoffet oppdatert.
Artikler om mekanismer for dannelsen av autoantistoffer.
For klinisk anvendelse har veileder anvist til oppdaterte artikler og retningslinjer.
2.3 Dataekstraksjon
PubMed søket er gjort for å innhente nyere forskning som belyser/avdekker mulige mekanismer for dannelsen av autoantistoffer ved cøliaki. Der artikler fra veileder er supplement. Fagboken er ment for å dekke etablert immunologisk teori, mens tilleggs artiklene utfyller. Dagens diagnostiske verktøy presenteres ut i fra retningslinjer og artikler for klinisk anvendelse av autoantistoffer.
4
3 Resultat
Søket i PubMed ga 96 artikler og veileder ga 4 artikler. Etter gjennomgang av artiklers overskrift og abstrakter ekskluderte jeg 83 artikler da de ikke passet inklusjonskriteriene. Jeg lest derfor som primærlitteratur 11 artikler. Fra artiklene plukket jeg også opp sentrale artikler som jeg leste, flere publisert før 2009. Oppgaven gir derfor ikke en fullstendig oversikt over litteraturen om autoimmunitet generelt og om autoimmunitet ved cøliaki spesielt. Snarere har jeg forsøkt å gi en fremstilling av kunnskapsforståelsen det er på disse områdene.
5
3.1 Grunnleggende immunologisk teori
For videre forståelse og sammenligningsgrunnlag presenteres først læreboks teori. Gjennom en fremstilling av det ervervete immunforsvaret, med primært fokus på B-celler og T-celler, vil kommunikasjon og gjenkjenning av antigen belyses. Deres kommunikasjon beror på deres membranbundne antigen-reseptorer, og er avgjørende for videre immunreaksjon (3).
3.1.1 B-celler reseptor
B-celle reseptoren (BCR) er permanent på cellens overflate og gjennom denne gjenkjenner cellen antigenet (3). BCR er et immunoglobulin som er bundet til cellemembranen (6).
Reseptoren virker på to måter; den gir både celle-aktivering og fører til opptak av antigen (3).
Antigen opptaket skjer når BCR har bundet antigen. B-cellen vil endocytere reseptor- antigenkomplekset (3, 7). I endosomene blir proteinantigener brutt ned til peptidfragmenter som så kan binde til MHC klasse 2-molekyler (3). MHC klasse 2-molekylenes bundne peptidfragmenter vil bli brakt til celleoverflaten slik at B-cellen vil kunne vise fram til T- celler fragmenter av antigenet som bandt til BCR (3, 8). Aktivering av B-cellen kan lede til celledeling og dannelse av hukommelse B-celler og til dannelse av effektor B-celler, såkalte plasmaceller (3). Plasmacellene produserer store mengder løselige immunoglobuliner – antistoff (3).
3.1.2 T-celle reseptorer
T-celle reseptoren (TCR) er beslektet til BCR (3). Reseptoren består av en heterodimer med alfa- og beta-kjede der begge kjedene har en konstant og en variabel del (3, 7). Denne
heterodimeren gjenkjenner et kompleks av peptid fra antigen bundet til et MHC-molekyl (3).
MHC klasse 1-molekyler presenterer peptid til CD8 T celler og MHC klasse 2-molekyler presenterer peptid til CD4 T celler (3). CD8 T celler er cytotoksiske T celler, mens CD4 T celler er T-hjelpeceller eller regulatoriske T-celler (3). Cytotoksiske T-celler dreper og tilintetgjør celler, blant annet virusinfiserte celler (3). T-hjelpeceller kan hjelpe B-celler til å produsere antistoff, skille ut cytokiner som aktiverer monocytter/makrofager og gi hjelp og vekstfaktorer til cytotoksiske T-celler (3). Regulatoriske T-cellers funksjon er å hemme aktivering av andre lymfocytter og minke uhensiktsmessig skadeomfang (3).
6
MHC klasse 1-molekyler er uttrykt på alle celler med kjerne, mens MHC klasse 2-molekyler er det kun enkelte celler som har, blant annet antigenpresenterende celler, som dendrittiske celler, monocytter/makrofager og B-celler (3). På MHC klasse 1-molekyler binder peptider med opphav fra cytosol, mens peptider fra cellens sekretoriske pathway eller fra det
ekstracelluære rom binder til MHC klasse 2-molekyler (3). Det vil si at CD4+-T celler får presentert fragmenter av proteiner fra spesialiserte celler som har i oppgave å
endocytere/fagocytere ekstracellulære materiale og vise det frem, mens CD8+ T-celler i større grad sjekker alle celler i kroppen proteiner produsert inne i cellene selv (i cytosol).
3.1.3 Antistoffets oppbygning og funksjon
Antistoffet er strukturert i en Y-formasjon, konstruert av to tunge og to lette kjeder (6).
Kjedene består av en konstant del, Fc, og en variabel del, Fab (3, 8). Den konstante delen bestemmer effektor funksjonene til antistoffet (IgG/IgM/IgA/IgE og IgD) (3). Det er
”stammen” som avgjør isotypen, og dermed interaksjonene med effektormolekyler/-celler (3).
Fab, altså de variable delene av antistoffet, gir diversitet ved å ha ulike aminosyresekvenser (3, 8). Den variable delen på den lette og tunge kjeden har henholdsvis tre hypervariable regioner som sammen danner ”setet” for antigenbindingen (3). De seks regionene kalles
”complementarity-determinging regions” (CDR), og er kontaktflaten mellom antigenet og antistoffet (3). Det betyr at hver enkel CDR er delaktig i å skape variabiliteten, affiniteten og spesifisiteten til antistoffet. Antistoffet gjenkjenner antigenets konformasjon, altså 3D form, på sammen måte som BCR, mens TCR gjenkjenner en aminosyresekvens (3, 6).
Funksjonelt vil antistoffer nøytralisere eller føre til opsonisering av det fremmede (3). Fab binder med spesifisitet til antigenet, mens Fc rekrutterer andre celler og molekyler for å destruere det fremmede (3). Videre håndtering avhenger av antigenet. Ekstracellulære antigen nøytraliseres av antistoffer som binder seg til dem, og deres aktivitet vil da hemmes (3). For bakterier er ikke dette tilstrekkelig, antistoffet fester seg til bakterien, celler som har reseptor for Fc kan da fagocytere bakterien, en prosess kalt opsonisering (3).
7
3.1.4 T- og B-celler reseptorene gjenkjennelsesmetode
En naiv lymfocytt har ikke møtt sitt antigen, og er derfor ikke blitt aktivert, i motsetning til effektor lymfocytter. Disse er funksjonelle lymfocytter som etter møte med sitt antigen, er aktivert og har differensiert til effektorceller (3). Et antigen er et molekyl eller en del av et molekyl som spesifikt gjenkjennes av de høyt spesialiserte proteinene på lymfocyttene (3).
TCR og BCR har ulik struktur og gjenkjennelsesmetode (7). Området på antigenet som lymfocytter binder til, kalles epitop (9). Et antigen kan ha mange epitoper som registreres av ulike antistoffer, BCR eller TCR (3). Det er en prinsipiell forskjell i gjenkjenning av antigen for antistoffer, BCR og TCR. TCR vil gjenkjenne deler av proteiner, peptidfragmenter, bundet i kompleks med MHC-molekyler, altså både peptid og MHC (3). Antistoffer eller BCR, membranbundet antigen reseptor, gjenkjenner antigenet alene, vanligvis som en konformasjon eller 3D struktur (3, 8).
Som nevnt finnes det to typer MHC-molekyler; klasse 1 og 2. De er ulike i struktur og ekspresjon. MHC 1 dannes av en a-kjede og b2-mikroglobulin, og MHC 2 har en a- og b- kjede (3). Begge danner en grop hvor peptidet kan binde seg (3). Dette området er svært polymorft som gir utallige variasjoner for peptidbinding (3). Klasse 1 molekyler er mer rigid når det kommer til lengden på peptidet, og binder sekvenser på 8-10 aminosyrer (3). For MHC klasse 2-molekyler vil antallet aminosyrer i peptidet gjerne være over 13 (3).
3.1.5 Lymfocyttaktivering
Samtalen mellom T-celler og B-celler
Kommunikasjonen mellom B- og T-celler foregår over MHC klasse 2-molekylet (3, 4). B- celler laster fragmenter av antigen på MHC-molekyler via reseptor mediert endocytose (6).
MCH-peptid-komplekset på B-cellens overflate kontrolleres av T-cellens TCR (3).
Aktivering
CD8+ og CD4+ T-celler har ulike funksjoner. Aktivert CD8+ utretter cytotoksiske drap direkte etter ko-stimulering, hvis et antigen på MHC klasse 1-molekyl oppfattes som fremmed og dermed farlig (3). CD4+ celler vil ved antigenpresentasjon på MHC klasse 2-molekyl få
8
ko-stimulering og aktiveres til å sekrere cytokiner, som fører til selvdestruering av APC og/eller aktivering av B-celler til å produsere antistoffer mot antigenet (3).
For B-celler kan gjenkjennelse av antigen alene vanligvis ikke stimulere til effektorceller funksjon, dvs. omdannelse til plasmaceller som produserer antistoff (3). B-cellen kan aktiveres ved mønstergjenkjennende-reseptorer (f.eks. TLR) eller av antigen med repetitive epitoper som binder flere BCR, gir da høy aviditet og stimuli til aktivering (3). Men for isotypeskiftet eller differensiering til hukommelsescelle trengs en CD4-celle til, via CD40- CD40-ligand mellom B og T celler (3, 8). For at B-cellen skal aktiveres av T-hjelpecelle (CD4+), må et epitop på et antigen bindes til BCR, deretter internaliseres i endosomer, hvor antigen spaltes til peptidfragmenter som lastes på MHC klasse 2-molekyler og til slutt vises fram på B-cellens overflate (8). Aktiveringen skjer hvis T-hjelpecelle (CD4+) med sin TCR gjenkjenner dette peptid-MHC komplekset og stimulerer til aktivering av B-cellen (7). B- og T-cellen trenger ikke gjenkjenne et identisk epitop, men epitopene må være fysisk koblet, dette kalles koblet-gjenkjennelse (3). Etter stimulerende interaksjon med T-hjelpecellen vil B cellen bevege seg til såkalte germinalsenter hvor B-cellen prolifererer (klonal ekspansjon) og differensiere til plasmaceller eller hukommelsesceller (3). I germinalsenteret gjennomgår B- cellene affinitetsmodning, somatisk hypermutasjoner, for å bedre affinitet til antigenet og videre bytte av isotype som bestemmer immunoglobulinets klasse (3, 8).
3.1.6 Selvtoleranse
Den sentrale selvtoleranse skjer i primær lymfoid vev som tymus og benmargen (3). Under modningen i tymus blir alle T-cellene presentert for autogene aminosyresekvenser for å sjalte ut lymfocytter som interagerer uhensiktsmessig – autoreaktive (10). For B-cellene skjer dette i benmargen gjennom klonal delesjon og endring av BCRs bindingssted for antigener (8).
T-celler – sentral selvtoleranse
T-celler undergår somatisk rekombinasjon av TCR i tymus (10). Under eksponering av autoantigener, uttrykt av AIRE, i tymus formes et repertoar av TCR som vil kunne dekke nesten alle mulige antigen(fremmede) (3). Mekanismer som positiv og negativ seleksjon former TCR, hvor de med lav affinitet positivt selekteres videre og de som ikke gjenkjenner MHC klassene eller binder for hardt elimineres (3, 10). Se figur 1. Enkelte T-cellers oppgave blir å regulere andre celler i periferien som binder for hardt eller reagerer på autoantigener,
9 disse kalles Treg (10). Eliminasjonen er et viktig prinsipp for å unngå autoimmune sykdommer og opprettholder selvtoleransen (3). Hver T-celle er unik og vil dekke for eventuelle
antigener, med mulighet for klonal ekspansjon til effektorceller og hukommelsesceller (3).
Figur 1. Seleksjon av T-celler for dannelse av sterk selvtoleranse. Publisert med godkjennelse fra Cold Spring Harbor Laboratory Press
Regulatoriske T-celler
Av T-cellene er Treg en viktig modulator i å forebygge autoimmunitet. Gjennom to veier, den ekstrinsike virker ved å påvirke aktiverte T-celler og APC, mens den intrinsike modulerer lengden og størrelsen på den immunologiske reaksjonen (3). Den skiller seg ut ved å kunne undertrykke autoreaktive lymfocytter (3). To typer Treg er kjent, ‘natural’ Treg som fra modning i tymus er programmert til å uttrykke FoxP3 i respons til autoantigener, som i periferien forhindrer andre T-celler i å konvertere til effektorceller (3). Den andre kalles
‘induced’ Treg og uttrykker også FoxP3, men vil først modnes i periferien under gitte betingelser (3). FoxP3 er essensiell i å forhindre autoimmunitet sammen med Treg (3).
B-celler – sentral selvtoleranse
B-celler dannes og modnes i benmarg, gjennom sentral selvtoleransen (3, 6). Her vil B-cellers BCR under modning gjennomgå reseptor-editing, hvor de lette kjedene rearrangeres, for å endre affinitet (8). Hvis affiniteten svekkes kan B-cellen fortsette. For B-celler der det ikke medfører tilstrekkelig tap av affinitet eller aviditet, blir de stoppet og fjernet (6). Ved såkalt klonal delesjon, der autoreaktive B-celler elimineres ved apoptose (11). Se figur 2.
10
Perifer selvtoleranse
Det slippes ut autoreaktive B-celler fra benmargen. Estimater antyder at 20% av modne naive B-celler reagerer på egent vev (12). Mange av disse B-cellene er anerge og vanskelig å aktivere til å bli effektor B-celler (figur 2). I andre tilfeller kommer cellene ut i periferiene fordi antigenet ikke er tilgjengelig for B-cellen, verken i benmargen eller perifert (6). Dette er såkalte ignorante B-celler (figur 2). Et viktig poeng er at en autoreaktiv B-celle vanligvis bare vil kunne starte å produsere autoantistoffer dersom den får T-celle hjelp (3).
Figur 2. Mekanismer for B-celle selvtoleranse. Figur fra Ludvig Sollid. Brukt etter tillatelse.
Viktig for toleranse: B-celler kontrolleres av T-cellene
B-celler er kontrollert av T-celler, og vil ikke aktiveres i fravær av T-cellens stimuli mot bundet antigen (13). TCR og BCR leser antigen prinsipielt forskjellig, likevel er de avhengig av hverandre og aktiveres mot samme antigen. Hvordan kan de snakke sammen? Gjennom
"masse effekt", gjennom opptak og lasting på MHC-molekylene i endosomet vil
konsekvensen være at MHC klasse 2-molekylene fylles opp med peptidfragmenter som stammer fra det antigenet som BCR gjenkjenner (3). Dette gjør at CD4+ T-celler og B-cellen gjenkjenner samme antigen, om enn på forskjellig måte, vil snakke sammen. B-cellen er avhengig av T-celle hjelp for å kunne differensiere til plasmacelle og produsere antistoff og er således under kontroll av T-celler (3). Se figur 3. T-celler gjennomgår streng seleksjon i tymus og således tilegner en sterk toleranse. Tilsvarende ses ikke for B-celler, der toleransen
11 er svak. Mange har autoreaktive B-celler (12), men disse blir ikke antistoffproduserende fordi de ikke får T-celle hjelp (autoreaktive T-celler finnes ikke) (3).
Figur 3. B- og T-celle kommunikasjon.
Mekanismer som kan føre til autoimmunitet
Autoimmunitet kjennes ved at immunforsvaret reagerer mot molekyler, tilhørende kroppens vev og celler, og fører til vevsskade (14). Mulige komponenter som føre til autoimmunitet kan deles i genetiske og miljøfaktorer (3). Det er vist genetisk predisposisjon for flere
autoimmune sykdommer. HLA-molekylene er sentrale og er viktig i immunresponsen og tenkt å spille en rolle for at T-celle toleransen brytes (3). Med brutt T-celle toleranse, vil autoreaktive T-celler kunne gi hjelp til autoreaktive B-celler slik at autoantistoffer produseres (3, 15). Hvordan T-celle toleranse brytes har derfor vært et sentralt tema i forståelsen av autoimmune sykdommer. Miljøstimuli som infeksjon trekkes frem i etiologien for flere kjente autoimmune sykdommer, (3, 5, 16). Mekanismene for hvordan miljø kan bryte
immunologisk selvtoleranse er ikke fullt ut forstått. En mulig forklaring kan være såkalt
"molecular mimicry" hvor peptid-MHC komplekset for en T-celle som gjenkjenner et
fremmed peptid likner så mye på peptid-MHC komplekset til et eget peptid at en T-celle som opprinnelig reagerte på noe fremmed senere reagerer på selv (15). Som jeg vil gå inn på under om cøliaki, finnes det andre muligheter for at miljøfaktorer kan bryte immunologisk
selvtoleranse.
12
3.2 Cøliaki – pasienten foran deg
3.2.1 Hva er cøliaki?
Cøliaki er en kronisk inflammatorisk tarmsykdom. Proteinet gluten, som finnes i hvete, bygg og rug, utløser en autoimmun inflammasjon i tynntarmen som resulterer i avfatning av tarmtottene (5). Det er en autoimmun sykdom i en unik posisjon, i den betydning at man har funnet ut miljøkomponenten, assosierte gener og at vevet er lett tilgjengelig (4).
Genetisk faktorer
Cøliaki er en sykdom hvor gener er viktige. Konkordansraten hos eneggede tvillinger er 75%
og 10% av førstegradsslektninger er affisert (4). Det er mange gener som bidrar til den arvelige sykdomsdisposisjonen. HLA er den viktigste genetiske faktoren. Cøliaki er assosiert til HLA variantene HLA-DQ2 og HLA-DQ8 med fordelingen HLA-DQ2.5 (90%), HLA- DQ2.2 (5%) og HLA-DQ8 (5%) (4).
Gluten - proteinet
Glutenproteiner (gliadiner og gluteniner) er spesielt ved at det har flere glutamin-prolin-rike områder som er motstandsdyktig mot proteaser (5, 16). Det brytes mindre opp før de
transporteres over epitelet, og vil derfor finnes som polypeptider. HLA-DQ variantene som disponerer for cøliaki binder særlig godt peptider med aminosyrer med negativ ladete
sidekjeder (glutamat og aspartat) (17). Glutenproteiner har i utgangspunktet få negativ ladete aminosyrer, men enzymet transglutaminase 2 (TG2) kan modifisere glutenpeptider slik at de får negativt ladete aminosyrer ved at glutamin omdannes til glutamat (deamidering) (16).
Den deamideringen som TG2 utfører er avgjørende for glutenpeptider skal kunne binde HLA- DQ-molekylene HLA-DQ2.5, HLA-DQ2.2 og HLA-DQ8 (17).
Gluten-spesifikke CD4+ T celler
Sammen med HLA-DQ molekylene spiller CD4+ T-celler en sentral rolle i patogenesen (7).
Fra biopsiene til pasienter med cøliaki finner man gluten-spesifikke CD4+ T-celler (7). I utgangspunktet vil ikke glutenpeptidene bundet til HLA-DQ2/DQ8 være immunogent. Som nevnt er glutenpeptider glimrende substrater for TG2, områdene som deamideres får økt
13 affinitet til HLA-DQ-molekylene (17). Glutenspesifikke-CD4+ T-celler gjenkjenner
deamidert gliadin (gluten) som antigen og starter en immunrespons (7). Det setter TG2 sentralt i dannelsen av antigen for CD4+. På tvers av pasienter med cøliaki er deres CD4+ T- celler merkverdig like i gjenkjenning av epitopene på glutenpeptidene og peker mot seleksjon av TCR (7).
3.2.2 Kliniske aspekter ved cøliaki
Prevalens, symptomer og diagnose
Grunnet bevisstgjøring rundt cøliaki har prevalensen økt drastisk de siste tiårene (5).
Sykdommen debuterer typisk i 1-2 årsalder (5). Den pediatriske pasient har ofte diare, konsipert, underernært og dårlig trivsel (faliure to thrive) (2), mens hos voksne er
sykdomsbildet mer diffust, fra mangelsykdom, mageproblemer, fatigue (5). Utredning baserer seg på klinikk og serologisk testing for sykdomsspesifikke antistoffer og HLA-genotyping, mens det for voksne fortsatt er biopsi som er gullstandard for diagnose (5).
Histologiske forandringer i tynntarmen
Ved inntak av gluten vil det medføre strukturelle forandringer i tynntarmen. Normalt tarmepitel har lange, tynne villi og korte, proliferative krypter, som gir stor overflate til absorpsjon og nedbrytning av næringsstoffer (5). Hos en cøliaker som spiser gluten vil villi bli kortere, atrofiere, og kryptene større, hyperplasi, som resulterer i en redusert tarmoverflate og forklarer symptomer som diare og dårlig ernæringsstatus (5). I tillegg er det funnet en økning av immunceller, som intraepiteliale lymfocytter og plasmaceller i lamina propria (18).
Glutenfri diett og oppfølging
Det er svært viktig å ikke starte glutenfri diett før diagnosen er bekreftet. Siden ødeleggelsen er reversibel og eliminasjon av gluten fra kostholdet fører til inflammasjonstopp (5).
Tarmepitelet er proliferativt og vil på kort tid gjenskape opprinnelig arkitektur (5). Hvis blodprøver viser mangelsykdommer skal det følges opp og kosttilskudd bør vurderes (19). For mange vil edukativ behandling, i form av henvisning til ernæringsfysiolog eller kurs i regi av Norsk Cøliakiforening for å lære å lage mat uten gluten, være nyttig.
14
3.3 Autoantistoffer ved cøliaki – mulig mekanisme for dannelse
3.3.1 Grunnleggende forsvar i aktuelt vev
Epitelet i tarmen, skal være plattform for beskyttelse og opptak av næring. Tarmepitelet er enlaget for å fasilitere absorpsjon. Det pågår en betydelig slitasje av epitelet, både mekanisk og kjemisk, derfor foregår en uavbrutt utskiftning av epitelet, med en fullstendig utskiftning ila. 3-5 dager (5). En kontinuerlig bevoktning av tarmlumen og epitelet skjer via
intraepiteliale lymfocytter (IEL), dendrittiske celler og M-celler for å kunne sette i gang forsvarstiltak når det skulle oppstå (3, 5). Med en stadig utsettelse for orale antigen er det avgjørende å ha et immunsystem som ignorerer og tolererer harmløse antigen, oraltoleranse - denne balansen er enten brutt eller aldri oppstått hos dem med cøliaki (5). Uten oraltoleranse starter proinflammatoriske og immunologiske responser mot gluten og tarmvevet (5). Videre vil fokuset være samspillet mellom T-hjelpe celle (CD4+) og B-celler som resulterer i sekresjon av autoantistoffer.
3.3.2 Antistoffer ved cøliaki
Det er flere antistoffer assosiert med cøliaki. Pasientene danner, når de spiser gluten,
antistoffer mot deamidert glutenpeptider og mot autoantigenet transglutaminase 2 (TG2) (5).
Det at cøliakipasienter danner antistoffer mot glutenpeptider er ikke overraskende all den tid cøliaki skyldes en immunreaksjon mot gluten. Det at pasientene danner antistoffer mot TG2 er derimot overraskende. Dette tyder en autoimmun komponent ved cøliaki (4). Så hvorfor og hvordan dannes autoantistoffet anti-transglutaminase 2?
Autoantigenet – Transglutaminase 2 (TG2)
Transglutaminase 2 tilhører en familie kalsium-avhengig enzymer som katalyserer
posttranslasjonell modifisering av glutamin-aminosyrer i polypeptider (16, 17). Enzymet kan transamidere (kryssbinde) og deamidere (16, 17). Ved kryssbinding dannes en
isopeptidbinding mellom sidekjedene til glutamin og lysin som er et primært amin (16, 20). I fravær av amin-substrater i et miljø med lavere pH kan TG2 reagere med vann istedenfor et
15 primært amin (16). Resultatet er deamidering hvor glutamin er omdannet til glutamat og hvor det innføres en negativ ladning (4).
TG2 er uttrykt i mange vev og forekommer vanligvis i cytosol, men også ektracellulært (5, 16). TG2 er tilstede i endomysium¸ i bindevevet rundt glatte muskelceller (17), og det har betydning ved diagnostisering av cøliaki. Ved skade frigjøres TG2 og har i biologiske prosesser funksjoner som remodulering av matriks, sårreparasjon, celleoverlevelse og død, differensiering og migrasjon (16, 17). Med nøkkelrolle i flere viktige biologiske prosesser vil anomalier i TG2s ekspresjon, distribusjon eller regulering kunne ha patologisk betydning (16, 17).
Satt i sammenheng med cøliaki, observeres det ved skade eller hyperpermeabilitet av tarmepitelet, grunnet irritanter som toksisk glutenpeptider, frigjørelse av cytosolisk TG2 til ekstracellulær matriks (17). På grunn av høyt innhold av glutamin i gliadinpeptider, er disse peptidene ofte gode substrater for TG2 (17). Komplekser, gliadin-gliadin eller TG2-gliadin, virker som neoantigener og initierer en immunrespons, hos genetisk predisponerte personer, rettet mot både deamidert gliadin og TG2 (17).
3.3.3 Mekanismer for produksjon av antistoffer mot TG2
I følge immunologisk teori tilsier funn av IgA og IgG antistoff mot TG2 tilstedeværelse av TG2-spesifikke CD4+ T-celler. De TG2-spesfikke B-cellene trenger hjelp av CD4+ T-celler for å gjennomgå isotypeskifte og omdanning til plasmaceller (3). Imidlertid finnes det lite holdefunker for at slike TG2-reaktive CD4+ T-celler finnes (16). TG2 utrykkes i tymus noe som taler for at TG2-reative CD4+ T celler burde fjernes ved negativ seleksjon (21).
Dannelse av TG2-gluten-kompleks
Hvis ikke TG2-spesifikke CD4+ T-hjelpeceller finnes, eksisterer det da andre muligheter for T-celle hjelp? Det er foreslått en modell hvor hjelpen kommer fra glutenspesifikke T-celler (4). Denne modellen baserer seg på glutenpeptider og TG2 kan danne komplekser (17).
Modellen forutsetter gluten-TG2 komplekser kan føre til fremvisning av glutenpeptider til gluten-spesifikke CD4+ T-celler og aktivering av naive TG2-spesifikke B-celler (3).
Der den første modellen baserer seg på hapten-bærer-funksjon (16) der gluten tjener som bærer(immunogen), i en kovalent kryssbinding mellom TG2 og gliadin(gluten) (16). Se figur
16
4. Komplekset TG2-gliadin prosesseres av TG2-spesifikke B-celler, gliadin vises frem på HLA-DQ2/DQ8 molekylene til CD4+ T-celler (5, 16). Slik at TG2-spesifikke B-celler aktiveres (12) og starter å produsere autoantistoffet rettet mot TG2 (16).
Figur 4. TG2-spesifikke B-celler reseptor mediert opptak av TG2-gliadin-kompleks.
En annen hypotese foreslår at TG2, med enzymatisk aktivitet intakt, binder til BCR (12). TG2 fortsetter å kryssbinde substratene, hvorav glutenpeptid er et foretrukket substrat, i kovalente tverrbindinger til overflateproteiner på B-cellen (12). Se figur 5. Hvis TG2 kobler
glutenpeptider direkte på BCR, og selv er bundet til BCR, kan glutenpeptidet umiddelbart tas opp gjennom reseptor mediert endocytose (12) og deretter fremvise på MHC klasse 2-
molekyler (3).
Figur 5. Enzymatisk aktiv TG2, bundet til BCR, som fortsetter å kryssbinde substrater. Her Glutenpeptid direkte bundet til BCR.
Revidert modell, for den glutenavhengige-produksjonen av antistoffer, forutsetter TG2s bruk av immunoglobuliner til substrat for å kryssbinde og lage kovalente tverrbindinger mellom
17 seg og til glutenpeptider (12). For at det skal kunne finne sted er det avgjørende at TG2 sin enzymatiske effekt er upåvirket, dvs. deamidering og kryssbinding (12). Tester av humane monoklonale antistoffer, viser at formen på IgD og til en viss grad IgM (dvs. Ig som normalt finnes på overflaten til naive B-celler), virker som substrat for TG2 som kovalent kryssbinder immunoglobulinene seg imellom eller glutenpeptider til B-cellens overflate (12, 18). Se figur 6. Kryssbinding av membranbundet BCR (Ig) eller kovalent binding til antigen er kjent for å senke terskel for aktivering av B-celler (3, 18). På den måten øker sannsynligheten for aktivering av naive TG2-spesifikke B-celler (18). Det kan forklares ved at flere BCR bringes nærme hverandre på membranoverflaten og fører til aktivering av B-celler (12). Sammen med kryssbinding, av BCR eller kovalente bindinger til antigen til BCR, hevdes et tidlig og
massivt utbrudd av plasmablaster, med en allerede eksisterende affinitet og autoreaktivitet mot TG2, å senke terskel for aktivering og medvirker til at naive B-celler produsere rikelig med avkom (18).Det kobler sammen gluten, T-celle aktivering og anti-TG2 produserende plasmaceller (12).
Figur 6. TG2 danner et multimer og samler BCR, ved å kryssbinde BCR og glutenpeptider.
T-celle avhengig B-celle respons
Mye tyder på at CD4+ T-celler har en sentral rolle i å aktivere TG2-spesifikke B-celler (12).
Det er vist sterk korrelasjon mellom gluten- og HLA-avhengige TG2-spesifikke antistoffer.
Som kjent er seleksjonen under affinitetsmodningen avhengig av å presentere antigen for T- celler, der tap av affinitet hos en B-celle ender med eliminasjon (18). Tilstedeværelsen av gluten-spesifikke CD4+ T-celler er godt dokumentert hos cøliakipasienter (12). B-celler, med TG2-spesifikke BCR, prosessere og presentere gluten på HLA-DQ-molekylene, kan aktivere gluten-spesifikke T-celler (18). For å si at B-celle responsen mot TG2 er T-celler avhengig,
18
forutsetter det TG2-spesifikke B-cellers evne å ta opp og så fremvise glutenpeptider til gluten- spesifikke T-celler (12).
3.3.4 Unike trekk i immunresponsen
Undersøkelse av vevsbiopsier viser at TG2-spesifikke plasmaceller er overrepresentert, med rundt 5-25% av alle plasmacellene (5), en lokal plasmacytose med TG2-spesifikk IgA
produksjon (18). Det foregår en enorm klonal ekspansjon av enkelte kloner, der sekvensering av deres immunoglobuliner avslører to trekk, økt uttrykk av enkelte IGHV og IGKV gener og færre somatiske hypermutasjoner, som skiller seg fra andre autoimmune- og patogeninduserte responser (5).
TG2-spesifikke plasmaceller har stereotypiske gener og paring av VH og VL Det er observert en høyfrekvent bruk av enkelte IGHV- og IGKV-gener, for antistoff, sammenliknet med de ikke-spesifikke TG2 plasmacellene (5, 22). Man ser en tendens i genene for VH og VL, der enkelte sekvenser overveiende uttrykkes (22). VH:VL parene IGHV5-51:IGKV1-5 og IGHV1-69:IGKV1-17 er særlig foretrukket blant TG2-spesifikke plasmaceller (22). Analyser viser at TG2-spesifikke VH og VL genetiske sekvenser på tvers av pasienter med cøliaki ligger tett, med en større slektskap enn for ikke-spesifikk TG2 (18).
Derfor finner man blant populasjoner av TG2-spesifikke plasmaceller mindre heterogenitet enn hos ikke-TG2-spesifikke plasmaceller, det synes tyde på et begrenset repertoar (22). Det medfører en klonal ekspansjon med lite varietet. Utover antistoffenes sammensetning vil somatiske hypermutasjoner avgjør deres affinitet ved binding.
Få somatiske hypermutasjoner
Det ser ut til å være et lavere antall somatiske hypermutasjoner under affinitetsmodningen av antistoffet jamført med andre autoimmune sykdommer og patogeninduserte responser, som rotavirus og influensa (5). Samme trekk gjenfinner man i TG2-plasmaceller gener, VH og VL, sammenlignet med ikke-spesifikke TG2 plasmaceller (22). Det kan tyde på at det opprinnelig finnes en rimelig affinitet til gluten hos de med cøliaki (5), før den undergår en sparsom affinitet-drevet modning etter gluten-eksponering (18).
19 Anti-TG2 epitoper
Et viktig spor å følge, for å finne ut mer om aktivering, er korrelasjonen mellom bruk av VH:VL og hvilke epitoper på TG2 og gluten som gjenkjennes (5). Fire epitoper lokalisert til N- terminalen av TG2 er avdekket etter undersøkelser av biopsier (5). Det er gjennomført flere studier som ser på TG2-aktivitet i bundet form til autoantistoffet. Fra tvetydige resultater, hvor enkelte studier viste inhibisjon av enzymets aktivitet (16), har nyere studier vist bevart aktivitet for TG2 bundet til antistoff (12). Der uberørt enzymatisk aktivitet kan være en drivfaktor eller føre til selektiv aktivering av TG2-reaktive B-celler med nevnte egenskaper for sine antistoffene (5, 12).
20
3.4 Klinisk anvendelse av autoantistoffer ved cøliaki
3.4.1 Retningslinjer for diagnostisering av cøliaki
I 2012 oppdaterte European Society of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (ESPGHAN) retningslinjene for pediatrisk diagnostisering av cøliaki (2). Over flere tiår har forsking innenfor fagfeltet pågått og lansering av nye analytiske verktøy tilkommet, mens retningslinjene har stått urørt. Det ble utformet to algoritmer i form av flytskjema, hvor pasientene deles inn etter; symptomer assosiert ved cøliaki eller asymptomatiske med
genetisk risiko (2). Diagnostisering har fra tidligere basert seg på symptomer, tilstedeværelse av HLA-DQ2/DQ8, antistoffer assosiert med cøliaki og histologiske forandringer i duodenum (23). Der biopsi kunne stille diagnosen; cøliaki. Biopsi er for mange barn en belastning. For å gjennomføre biopsitakning er det for mange nødvendig og legges i narkose (19). Ny forskning har ført til utvikling av serologiske tester, rettet mot sykdomsspesifikke antistoffer for cøliaki, med høy nøyaktighet og skaper grunnlag for alternativ diagnostisering (2, 23).
Før utredning av cøliaki starter, avklares det hvilket flytskjema pasienten skal følge. Det skilles mellom personer med symptomer forenelig med cøliaki og personer med risiko for cøliaki (2). Serologisk diagnostisering dreier seg hovedsakelig om pasienter med symptomer forenelig med cøliaki. I samsvar med oppgaven vil det derfor avgrenset til denne
pasientgruppe.
Serologiske blodprøver ved cøliaki
I de senere årene har det tilkommet svært sykdomsspesifikke tester på markedet av ulike merker (19). Testene detekterer sykdomsspesifikke antistoffer. Det tas utgangspunkt i
generelle prinsipper for gjenkjennelse av IgA TG2-antistoffer, hvor metodene kalles enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) og IgA anti-endomysiumtest (EMA) (23). TG2-
antistoffene har vist spesifikt mønster gjenkjenning av TG2 i endomysium (18). EMA baserer seg på indirekte immunfluorescens, hvor ape-øsofagus eller menneske-umbilicus brukes til substrat, for å avdekke reaktive TG2-IgA i vevet (23).
21 Pediatriske pasienter med symptomer assosiert med cøliaki
Hvis barnet har gastrointestinale symptomer, som diare, konstipasjon og magesmerter, og ekstraintestinale symptomer, som failure to thrive, jernmangel, anemi, følger man
flytskjemaet for barn med symptomer (2). Se figur 7. Første steg er en blodprøve, der det testes for anti-TG2 og total IgA. Alle med positive svar sendes videre til pediatrisk
gastroenterolog. Verdier over ti ganger normalnivå tar nye blodprøver for å sjekke EMA og HLA-DQ2/HLA-DQ8 (2). Hvis EMA og HLA-DQ testene er positive, konkluderes det med diagnosen cøliaki (2, 19, 23). Med EMA-test positiv og HLA-DQ negativ må det vurderes om HLA-DQ er falsk negativ i tillegg sendes det henvising til gastroskopi med biopsi (2). En negativ EMA og HLA-DQ test kan tyde på første anti-TG2 var falsk positiv (2). Hvis Anti- TG2 er over referanseverdien, men ikke ti ganger, skal det henvises til biopsi. Ved biopsi er en Marsh 2-3 er forenelig med cøliaki (2).
Figur 7. Flytskjema for pasienter med symptomer assosiert med cøliaki. Publisert med tillatelse. Copyright Clearance Center’s RightsLink®service
22
Kommentarer til utredningen
Initialt starter man å teste for IgA antistoff mot TG2 serologisk, i tillegg burde det sjekkes for IgG cøliaki-antistoffer, med tanke på IgA-mangel (2). For seronegative uten klinisk mistanke, trenger det ikke utføres flere tester. Men ved persisterende alvorlige symptomer og stor klinisk mistanke om cøliaki bør det utføres HLA-test og biopsi (2, 23). Ved lite gluten i kosten, proteinmangel eller immunsuppresjon kan det forekomme et falskt negativt svar, derfor er et klinisk blikk viktig under utredningen (2). Hvis en biopsi viser enteropati, uten å være HLA-positive, må man tenke på andre sykdommer enn cøliaki (2). EMA-metoden er mer sykdomsspesifikt, da andre sykdommer kan danne anti-TG2, men de vil ikke gi utslag på EMA-testen (2). Ved biopsi skal det tas minst en vevsprøve fra bulb og fire fra 2. og 3. del av duodenum, for å sikre representativt vev og redusere falskt negativt svar (2). For
risikogruppen, ved negativ serologi, kan ny serologiske prøver tas 3-6 måneder senere (2).
3.4.2 Prospektiv evaluering av retningslinjene
En prospektiv studie tar for seg retningslinjene publisert i 2012 av ESPGHAN, der målet var å undersøke om serologiske tester, for diagnostisering av cøliaki, er presise nok med en positiv prediktiv verdi over 99% (19). En gjennomgang av data for å se hvorvidt alle med cøliaki fanges opp uten biopsi, når diagnostisering skjer serologisk. Det vil for 50% av barn med cøliaki, kun være nødvendig med en serologisk utredning og dermed eliminere endoskopi og biopsitakning (19). Uten narkose og invasivitet ved biopsitakning, slipper barn ubehaget og risikoen ved prosedyren gastroskopi (19). I tillegg vil det føre til en økonomisk gevinst ved å redusere arbeidet ved diagnostiseringen (23).
Nøyaktighet ved serologisk diagnostikk
Med et nivå på 10 ganger forhøyet IgA anti-TG2, viser serologiske tester en 98-100% PPV (19, 23). Det påpekes fare for mulig variasjon i utstyrets kvalitet og teknikernes utførelse av analysene (19). For å unngå falske positive svar, og samtidig holde nøyaktigheten høy, anbefales det å bevare en grenseverdi 10 ganger normalverdi (19). Til tross for indikasjoner om en PPV på 100% ved et lavere antistoff-nivå (19). En annen faktor som virker inn på testens nøyaktighet, er symptomer. Det ga utslag i den PPV avhengig om symptomene var spesifikke, som malabsorpsjon, eller diffuse, som magesmerter (19, 23). For pasienter med malabsorpsjon viste det en høyere PPV (19, 23).
23 Oppsummerende peker resultatene på at ELISA, av IgA anti-TG2, er en god test å bruke til screening. Den er kostnadseffektiv og gir generelt pålitelige svar (19). EMA brukes som en bekreftende prøve, til en dobbelt kontroll for å utelukke feil ved første prøvetakning (19, 23).
Det bemerkes at EMA-testen er regnet som mer spesifikk enn TGA-testen, men er igjen i større grad avhengig av personen som gjennomfører immunoflorecensen, i tillegg til å ha en høyere kostnad (19).
I befolkningen vil 40% av kaukasiere ha HLA DQ2/DQ8 (2) uten å ha eller utvikle cøliaki.
HLA-testing har blitt brukt for å ekskludere cøliaki hos risikogrupper og for en ekstra bekreftelse for pasientgruppen med symptomer (23). Resultater fra studiet viser at med to separate blodprøver, en for ELISA og en for EMA, vil ikke HLA-typing for DQ2/DQ8 tilføre større nøyaktighet (19). Flytskjemaet kan, ifølge det prospektive studiet, endres til utelukkede to blodprøver (19). Der den først utføres en TG2-test (ELISA) hos fastlegen og deretter en EMA hos en gastroenterolog for barn. HLA-testing burde kun brukes i andre-linje, som evaluering der diagnosen ikke er sikker (19, 23).
24
4 Diskusjon
4.1.1 Kommunikasjonen mellom B- og T-celler
Ifølge immunologisk teori vil aktivering av B-cellen resiprok bety at en CD4+ T-celle er aktivert og rettet mot samme antigen (3). Derfor er det ikke overraskende at hos pasienter med cøliaki finnes det både T- og B-celler rettet mot deamidert glutenpeptider (7). Målet er å se om hypotesene forklarer hvordan antistoffer mot TG2 oppstår, da det til nå ikke er funnet autoreaktive T-celler.
I de primære lymfoide vev gjennomgår TCR og BCR sentral selvtoleranse (3). Etter modning og seleksjon av antigen-reseptor, slippes naive B- og T-cellene ut i periferien. Med prinsipiell forskjell i antigengjenkjennelse synes det vanskelig å begripe hvordan T- og B-cellene
kommuniserer og responderer på samme antigen. I kommunikasjonen mellom B-celler og T- celler spiller MHC klass 2-molekylene en sentral rolle (7). B-cellen fremstiller sin aktivitet og gir mulighet for T-cellers inspeksjon (3). B-cellen binder antigen i 3D-konformasjon, endocyterer og fremviser et klasse 2 MHC-antigen-kompleks til CD4+ T-celler (7, 10).
Koblet-gjenkjenning fordrer fysisk kobling mellom epitopene som gjenkjennes av B- og T- cellene (3). Videre må peptidsekvensen, svarende til antigenet, ha affinitet til MHC-molekylet og deretter må TCR gjenkjenne peptid-MHC-komplekset (3).
Med flere restriksjoner for aktivering demonstrere det en dobbeltkontroll. Når en CD4+ T- celle stimulerer en naiv B-celle vil det normalt føre til en immunrespons (3). MHC klasse 2- molekylene binder ofte aminosyresekvenser på over 13, i motsetning til MHC klasse 1-
molekylene (3). Om differansen i lengden på aminosyrepeptidet gjør MHC klasse 2-molekylet mindre rigid, kommer ikke frem. Eller om det fasiliterer til økt antigenbinding avklares ikke.
Men sammenhengen mellom enkelte HLA-molekyler (MHC-molekyler) og autoimmune sykdommer er godt dokumentert (15). CD4+ T-celler interagerer med disse molekylene i kompleks med antigenet og stimulerer til immunrespons. Derfor kan lengre peptider i kompleks med MHC klasse 2-molekylene være av betydning for affinitet og respons.
Bredere kan det problematiseres rundt koblet-gjenkjennelse med hensyn til cøliaki og autoantigen. Epitopene kan ikke være identiske for B- og T-celler, som hhv. gjenkjenner epitopene i 3D og 2D (7). Like fullt trengs det en fysisk kobling mellom epitopene for
25 aktiverende signal skal gis (3). TG2 enzymatisk aktivitet binder gliadin med kovalentbinding (12). Kan denne sammenkoblingen være den fysiske dannelsen mellom epitopene og være et ledd i å belyse brudd på selvtoleransen?
4.1.2 Autoimmunitet, er cøliaki en autoimmun sykdom?
Autoimmunitet kjennes ved et immunforsvar reagerer mot molekyler, tilhørende kroppens vev og celler, og fører til vevsskade (14). Cøliaki beskrives som en kronisk inflammatorisk tarmsykdom. Fra starten ble cøliaki kartlagt som en fødeintoleranse, men etter oppdagelsen av de sykdomsspesifikke autoantistoffene, har dette endret seg (17). I tillegg til autoantistoffer, har cøliaki en genetikk som likner på genetikken ved andre autoimmune sykdommer som type 1 diabetes, multippel sklerose og leddgikt (15). Det er også selektiv destruksjon av bare enkelte typer celler (epitelceller) liksom ødeleggelse av betaceller i pankreas ved type 1 diabetes (15). Dette gjør at mange klassifiserer cøliaki er en autoimmun sykdom.
Fravær av TG2-spesifikke CD4+ T-celler gjør sykdommen særskilt i sin autoimmunitet.
Fjerning av gluten fra kosten er tilstrekkelig til å stanse produksjonen av autoantistoffer og til å holde den autoimmune sykdommen i sjakk (5). Om det er overførbart til andre autoimmune sykdommer avdekkes ikke fra innhentet litteratur. Men hvis det finnes mulighet for å
eliminere drivfaktor for andre sykdommer, vil det være en milepæl innenfor medisin.
Fra resultatene påpekes interessante trekk ved immunresponsen hos cøliakipasienter. Naive B-celler besitter affinitet til TG2 (18), og ved stimulering til plasmaceller ses økt ekspresjon av enkelte IGHV og IGKV gener og færre somatiske hypermutasjoner sammenlignet med normal immunrespons (22). Betydningen av disse trekkene viser ifølge resultatene et
konsentrert repertoar og en iboende affinitet (18, 22). Dette presenteres som unike trekk ved immunresponsen for cøliaki (18, 22), det ville være interessant å se etter lignende kjennetegn på tvers av autoimmune sykdommer.
4.1.3 Autoantistoffproduksjon mot TG2
Hos cøliakipasienter er det bekreftet immunrespons ved inntak av gluten (4). Toksiske glutenpeptider kan fremprovosere skade og således frigjøre TG2 fra cytosol inn i det ekstracellulære rom (3, 17). Det sannsynliggjør TG2 sin tilstedeværelse ekstracellulært i tarmmukosa hos cøliakipasienter. TG2s normalrespons ved skade er å kryssbinde substrater i
26
ekstracellulær matrisk, for å forhindre videre skade på omkringliggende vev (16, 17). Gliadin er et godt substrat for TG2 (17) og argumenterer for hypotesen om TG2 sin rolle i å danne tverrbindinger og deamidere gliadin. HLA-DQ binder særlig godt peptider med aminosyrer med negativ ladete sidekjeder (glutamat og aspartat) (17), og her omdannes glutamin til glutamat (deamidering) (16). Den deamideringen er avgjørende for at glutenpeptider binder HLA-DQ-molekylene (17, 24). Det taler sterkt for slutningen om at TG2s deamidering av gliadin finner sted.
Videre er TG2s rolle i kryssbinding avgjørende. Fra resultatene synes TG2s aktivitet, i det ekstracellulære rom, å kryssbinde sine substrat kvantitativt, gliadin til gliadin og gliadin til TG2 (12, 17). På bakgrunn av kryssbinding, utført av TG2, muliggjøres dannelsen av TG2- gliadin kompleks. Et kompleks av TG2 og gliadin er utgangspunktet for hapten-bærer- modellen. Hapten-bærer mekanismen kan sammenlignes med metoden for Haemophilus influensa type B vaksinering (3). For å stimulere hhv. både B og T-cellene linkes
polysakkarid fra kapsel kjemisk til tetanustoksin (3). Her blir TG2 tilsvarende polysakkaridet og gliadin svarende til toksinet. Det illustrerer avhengighet av korrekt antigen-gjenkjennelse, med affinitet for B- og T-celler, for å resultere i produksjon av TG2-autoantistoff.
Videre viser IgD (og IgM), tilsvarende BCR på naive B-cellers overflate, seg egnet som substrat for TG2 (12). På bakgrunn av immunologisk teori kan man slutte følgende;
kryssbindinger av BCR vil senke terskel for aktivering av B-cellen (3, 12). Utover
kryssbinding av BCR, fremskyndes dannelsen av et multimer bestående av TG2 og gliadin aktivering ved å senke terskelen ytterligere (18). Kan dette da gjøres uten noen innvirkning fra CD4+ T-celler, som et superantigen (3)? Rent teoretisk for isotypeskifte, beskrives hjelp fra T-celler som elementær, og taler mot en aktivering uten. Om det i midlertidig finnes mekanismer for isotypeskifte i tarmmuksoa, kommer ikke det frem i gjennomgang av litteraturen i oppgaven, men kan være av interesse å se videre på.
Det kan tenkes at flere av disse hypotesene sammen muliggjør autoantistoff dannelsen. Med immunologisk teori som referanse er flere av hypotesene mulige og ingen ekskluderer nødvendigvis den andre. Et moment fra resultatene hvor man kan sette et spørsmålstegn er mulighet for aktivering uten hjelp av CD4+ T-celler. Det kan være en medvirkende faktor, ved å kryssbinde BCR, glutenpeptider og TG2, og senke terskel, men står ikke alene for isotypeskifte. Det behøves CD4+ T-celler eller annen aktiverende stimuli som p.d.d. ikke er kjent.
27 Jeg kommer frem til at alle mekanismene belyst i denne oppgaven beskriver samme resultat;
kommunikasjonen mellom T- og B-celler føre til autoreaktive B-celler og gluten-spesifikke T-hjelpeceller. Aktiverte B-celler som sekrerer antistoff mot TG2. Kan dette skje uten at B- cellen endocyterer et kompleks? Det mangler det grunnlag for å si, da samtlige hypoteser forutsetter det. Likevel er tarmens immunforsvar ikke fullt avdekket og kan være en komponent av interesse å se videre på.
4.1.4 Klinisk anvendelse
Basert på resultatene er dannelsen av autoantistoffer ikke enstydige, men anti-TG2 sin tilstedeværelse er grundig bekreftet (17). Det har medført allmenn aksept for autoantistoffets spesifisitet for cøliaki (19). I 2012 innførte ESPGHAG nye retningslinjer for diagnostisering av barn, der grunnlaget for diagnostikk baserer seg på anti-TG2 blodnivåer for serologiske prøver å detektere (2).
Rent praktisk har det betydning for de pediatriske pasientene. Det fører til færre biopsier, estimert reduksjon på 50% (19). Det betyr mindre smerte, ubehag og komplikasjoner for pasientene. En økning i serologisk diagnostikk vil unektelig redusere kostnader. Der reduksjon av arbeidskraft, mtp. gjennomførelse av biopsitakning og videre analyse av den, limiteres til en blodprøve (19).
I studiene kommenteres ikke analysene utover referanseverdier til IgA anti-TG2.
Retningslinjer for behandling av materialet etter blodprøvetaking blir ikke videre
problematisert, utover at de tar høyde for ulikheter mellom laboratoriene. Det gjøres ved å sette en referanseverdi høyt for å utelukke feil. Det kan diskuteres om hvorfor nivået ble værende så høyt, da det kom frem at screeningprøven holdt god nøyaktighet ved lavere nivåer (23). Det synes være en enkel måte å ikke ta stilling til mulige feilkilder som; hvilke merker som finnes på markedet og deres kvalitetssikring. Ved EMA påpekes erfaring som et
problematisk punkt (19), men heller ikke her tas det videre forsiktighetsregler i de lanserte retningslinjene.
Det kommer ikke tydelig frem om diagnosen cøliaki detekteres først med serologi eller ved biopsi. Et godt verktøy ville være å fremstille en korrelasjon mellom blodverdier og
histologiske forandringer. Om det er mulig eller ikke vet jeg ikke, men det ville vært et supplement til bedre forståelse i patogenesen og hvor i sykdomsutviklingen pasienten er.
28
Derfor er det fortsatt viktig med klinisk skjønn, utrede videre der det er mistanke, selv om serologien er negativ.
4.1.5 Begrensninger ved prosjektoppgaven
En problemstilling i selv begrenser. Her med hensikt om å gjøre det mulig å lage et
immunologisk teoretisk kart, hvor cøliaki brukes som en modellsykdom for å belyse brudd på selvtoleransen. Tap av selvtoleransen presenteres gjennom mulige mekanismer for dannelsen av autoantistoffet anti-TG2 og videre klinisk bruk av autoantistoffet i diagnostisering av cøliaki. Det fører til en prosjektoppgave med bredde og som griper inn i basalteori, forskning og klinisk diagnostikk. Det ble derfor nødvendig å sette begrensinger ved
litteraturinnhentning. Dette er naturligvis en svakhet, men for én person i et avgrenset tidsperiode ble det en avveining opp mot ressursene til rådighet.
Det finnes en mulig for at ikke alle artiklene svarende til inklusjonskriteriene er med, siden det bare ble kun søkt i en database, PubMed. Likevel er PubMed den største og burde ha de fleste relevante artiklene innenfor mitt søk. For søket ble det gjort en tidsbegrensning svarende til 2009. Det viste seg å eliminere sentrale artikler fra feltet. Derfor ble enkelte artikler eldre enn 10 år inkludert, artikler fra veileder og fra referanser til min primærlitteratur.
Språk ble begrenset til engelsk og kan ha ført til at man ikke har fått med seg all eksisterende litteratur. Men for å publisere i anerkjente tidsskrifter gjøres det i hovedregel på engelsk.
4.1.6 Konklusjon
Målet med oppgaven var å bruke basal teori for å sammenligne dagens hypoteser om mulige mekanismer for dannelse av autoantistoffet rettet mot transglutaminase 2. Med immunologien som et kart, ses de kliniske symptomene forklart gjennom molekylære prosesser. For
autoimmunitet er kommunikasjon mellom B- og T-cellen sentral for å starte immunresponsen (3). Reseptorene gjenkjenner antigen prinsipielt ulikt, men betinger en fysiske tilhørighet mellom epitopene for å kunne stimulerer til aktivering. Autoimmunitet hos cøliakipasienter kan forklares ved dannelsen av komplekset gliadin-TG2 katalysert av TG2 (17). Hvor komplekset internaliseres ved reseptor mediert endocytose. Her fordrer det iboende affinitet til TG2 for B-cellen (18), i tillegg til HLA-DQ2/DQ8 for å kunne fremvise gliadin(gluten) til CD4+ T-celle (4). CD4+ T-cellen trenger rett affinitet til MHC-gliadin-komplekset for å signalisere respons (3). De allerede kjente forutsetninger poengteres, genetikk og inntak av
29 gluten, og medfører sammen brudd på selvtoleransen. Videre åpnes det opp for attribuerende komponenter, som TG2 kryssbinding kan senke terskel og øke sannsynligheten for
immunrespons (12, 18).
Autoantistoffenes kliniske funksjon har siden 2012 hatt diagnostiskbetydning for barn (2).
Med høy nøyaktighet har serologisk diagnostikk tatt over for biopsi (19, 23). Det medfører at, for pasienter under 18 år med cøliaki assosierte symptomer og en 10 ganger forhøyet
serologisk IgA anti-TG2, diagnose kan settes serologisk (19). Det er likevel viktig å legge vekt på klinisk blikk. Det er kun retningslinjer og muligheten for andre årsaker til
symptomene må vurderes.
30
5 Litteraturliste
1. Olsen TK. Immunterapi I Store medisinske leksikon. 2018, 7. desember.
2. Husby S, Koletzko S, Korponay-Szabo IR, Mearin ML, Phillips A, Shamir R, et al.
European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition guidelines for the diagnosis of coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2012;54(1):136-60.
3. Murphy KW, Casey. Janeways Immunobiology: Garland Publishing Inc.; 2016.
4. Sollid LM. Coeliac disease: dissecting a complex inflammatory disorder. Nat Rev Immunol. 2002;2(9):647-55.
5. Stamnaes J, Sollid LM. Celiac disease: Autoimmunity in response to food antigen.
Semin Immunol. 2015;27(5):343-52.
6. M. Fleur du Pré JB, Alisa E. Dewan, Jorunn Stamnaes, Chakravarthi Kanduri, Geir Kjetil Sandve, Marie K. Johannesen, Kathrin Hnida, Lars Fugger, Gerry Melino, Shuo-Wang Qiao and Ludvig M. Sollid. B-cell tolerance and antibody production to the celiac disease autoantigen transglutaminase 2. Unpublished/manuscript. 2019:33.
7. du Pre MF, Sollid LM. T-cell and B-cell immunity in celiac disease. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2015;29(3):413-23.
8. Pelanda R, Torres RM. Central B-cell tolerance: where selection begins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012;4(4):a007146.
9. Harboe M. Epitop. I Store medisinske leksikon. 2009, 13. februar
10. Xing Y, Hogquist KA. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012;4(6).
11. Tiegs SL, Russell DM, Nemazee D. Receptor editing in self-reactive bone marrow B cells. J Exp Med. 1993;177(4):1009-20.
12. Iversen R, Fleur du Pre M, Di Niro R, Sollid LM. Igs as Substrates for
Transglutaminase 2: Implications for Autoantibody Production in Celiac Disease. J Immunol.
2015;195(11):5159-68.
13. Nemazee DA, Burki K. Clonal deletion of B lymphocytes in a transgenic mouse bearing anti-MHC class I antibody genes. Nature. 1989;337(6207):562-6.
14. Harboe M. Autoimmunitet. I Store medisinske leksikon.
15. Sollid LM, Jabri B. Triggers and drivers of autoimmunity: lessons from coeliac disease. Nat Rev Immunol. 2013;13(4):294-302.
16. Martucciello S, Paolella G, Esposito C, Lepretti M, Caputo I. Anti-type 2
transglutaminase antibodies as modulators of type 2 transglutaminase functions: a possible pathological role in celiac disease. Cell Mol Life Sci. 2018;75(22):4107-24.
17. Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, Donner P, Volta U, Riecken EO, et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nat Med. 1997;3(7):797-801.
18. Di Niro R, Mesin L, Zheng NY, Stamnaes J, Morrissey M, Lee JH, et al. High abundance of plasma cells secreting transglutaminase 2-specific IgA autoantibodies with limited somatic hypermutation in celiac disease intestinal lesions. Nat Med. 2012;18(3):441- 5.
31 19. Werkstetter KJ, Korponay-Szabo IR, Popp A, Villanacci V, Salemme M, Heilig G, et al. Accuracy in Diagnosis of Celiac Disease Without Biopsies in Clinical Practice.
Gastroenterology. 2017.
20. Lindfors K, Maki M, Kaukinen K. Transglutaminase 2-targeted autoantibodies in celiac disease: Pathogenetic players in addition to diagnostic tools? Autoimmunity reviews.
2010;9(11):744-9.
21. Jabri B, Sollid LM. T Cells in Celiac Disease. J Immunol. 2017;198(8):3005-14.
22. Roy B, Neumann RS, Snir O, Iversen R, Sandve GK, Lundin KEA, et al. High- Throughput Single-Cell Analysis of B Cell Receptor Usage among Autoantigen-Specific Plasma Cells in Celiac Disease. J Immunol. 2017;199(2):782-91.
23. Husby S, Murray JA, Katzka DA. AGA Clinical Practice Update on Diagnosis and Monitoring of Celiac Disease: Changing Utility of Serology and Histologic Measures: Expert Review. Gastroenterology. 2018.
24. Chen X, Hnida K, Graewert MA, Andersen JT, Iversen R, Tuukkanen A, et al.
Structural Basis for Antigen Recognition by Transglutaminase 2-specific Autoantibodies in Celiac Disease. J Biol Chem. 2015;290(35):21365-75.
