Det Helsevitenskapelige Fakultet
En perioperativ infusjon av GLP-1 forbedrer perifer insulinsensitivitet etter kirurgi
MED-3950 MK-13
—
Stud.med. Mikal J. Hole
Master, profesjonsstudium i medisin 2018
Forord
Jeg vil rette en enorm og spesiell takk til min hovedveileder dr. Martin Hagve på
Gastrokirugisk forskningsgruppe for fantastisk veiledning, åpning av dører til forskningens verden, uendelig tålmodighed og utholdenhet, og ikke minst alle våre timer på grislaben som var preget av godt humør, smittende glede over faget og faglige diskusjoner. Hvor
samarbeidet og hans kompetente veiledning har ført meg inn på et fagfelt jeg kanskje ikke ville oppdaget på på egenhånd.
Prosjektet begynte høsten 2014 hvor vi gjennomførte forsøkene gjennom et halvt års tid med utallige spennede og interessante timer tilbragt på griselaben. Formålet var å
gjennomføre et eksperimentelt dyrestudium på postoperativ insulinresistens og potensielt klinisk rettet behandling .
Takk til Mona B. Rydningen for sitt inspirerende engasjement for kirurgi og hjelp i å introdusere meg til forskningsgruppen. Jeg vil også takke Gastrokirurgisk forskningsgruppe med professor Øivind Irtun og dr. Petter Gjessing som var bak kulissene av prosjektet med kompetanse og forskningsglede. Jeg vil også takke lab-ingeniørene Hege Hagerup, Jenny Duangtang, Victoria Steinsund og Harry Jensen for godt samarbeide og humør på griselaben.
Jeg må også takke Villa Medica, en enorm takk til min familie for støtte opp gjennom studiet, Elisabeth og Holger Hole og mine søstre Jenny og Birgitta.
Sist, en spesiell takk til min kjæreste Hanna - som gjør alt litt morsommere og lettere.
“One special advantage of the skeptical attitude of mind is that a man is never vexed to find that after all he has been in the wrong.”
– Sir William Osler, The Treatment of Disease
Mikal Jacob Hole, København juni 2018
Innholdsfortegnelse
Utvalgte forkortelser ...2
Sammendrag ...3
1. Innledning ...4
1.1 Bakgrunn ...4
1.2 Postoperativ insulinresistens ...5
1.2.1 Historisk ...5
1.2.2 Rasjonale for behandling ...6
1.2.3 Katekolaminer og glukokortikoider ...7
1.2.4 Insulins fysiologi ...7
1.2.5 «Insulin signaling pathway» ...8
1.2.6 Glukose-oksidasjon, mitokondriell metabolisme og ROS ...9
1.2.7 Lipider ...10
1.2.8 Inflammasjon ...11
1.2.9 Faste og preoperativt karbohydrat-inntak (CHO-loading) ...11
1.3 Inkretiner ...12
1.3.1 GLP-1 og dens fysiologi ...12
1.3.2 Inkretin-effekten ...14
1.3.3 GLP-1 - terapeutisk bruk ved postoperativ insulinresistens ...14
2. Materiale og metode ...15
2.1 Studiedesign og kirurgisk intervensjon ...15
2.2 Dyr, anestesering og instrumentering ...16
2.3 Tracer-infusjon og hyperinsulinemisk-euglykemisk step-clamp ...16
2.4 Hyperglykemisk clamp ...17
2.5 Hormonanalyser,frie fettsyrer (FFA) og vevs-glykogen-innhold ...17
2.6 Western Blots ...18
2.7 Inflammasjon ...18
2.8 Statistikk ...18
3. Resultater ...19
3.1 Basal glukose-omsetning og glukose-kinetikk under to-stegs-euglykemisk-clamp (HEC) 19 3.2 Insulin, glukose og regulatoriske hormoner ...19
3.3 Frie fettsyrer (FFA) ...20
3.4 Glykogen-innhold i vev ...20
3.5 Insulin-signalerende proteiner ...20
Utvalgte forkortelser
CHO - preoperative oral carbohydrate loading EGR - endogenous glucose release
ETC - electron transfer chain FFA - free fatty acids
GIP - gastro inhibitory protein GLP-1 - glucagone like peptide-1 GLUT-4 - glucose transporter 4
HEC - hyperinsulinemic-euglycemic clamp PDC - pyruvate dehydrogenase complex PDK4 - pyruvate dehydrogenase kinase 4 PI3K - phosphoinositide 3-kinase
PPAR - peroxisome proliferator-activated receptor ROS - reactive oxygen species
WGD - whole body glucose disposal UCP - uncoupling protein
3.6 Hyperglykemisk clamp ...20
3.7 Cytokiner ...21
4. Diskusjon ...21
5. Konklusjon ...24
6. Referanser ...24
7. Tabeller ...31
8. Figurer ...32
9. Nøkkelartikler ...34
Sammendrag
Bakgrunn: Postoperativ insulinresistens er assosiert med flere komplikasjoner, og behandling reduserer risiko. Inkretin-analogen GLP-1 forbedrer glykemisk kontroll, uten risiko for
skadelig hypoglykemi, og kan potensielt øke postoperativ insulinsensitivitet i perifert vev samt redusere hepatisk glukoseutskillelse. Vi ønsket å finne ut av om en perioperativ infusjon av GLP-1 forbedrer insulinsensitiviteten etter større abdominal kirurgi.
Metode: Vi randomiserte 19 griser til 3 grupper: Kirurgi/kontroll (n=7), kirurgi/GLP-1 (n=7) og narre-kirurgi/GLP-1 (n=5). Begge kirurgiske grupper undergikk abdominal chirurgia major. Whole-body glucose disposal (WGD) og endogenous glucose release (EGR), ble målt og vurdert pre- og postoperativt ved hjelp av en D-[6,6-2H2]-glukose-infusjon, sammen med en hyperinsulinemisk euglykemisk steg-clamp med merket glukose-infusat. For å måle hormon-nivåer, glykogen-innhold og insulin-signaleringsaktivitet, ble blodprøver og vevs- biopsier samlet parallelt gjennom forsøkene.
Resultater: I kirurgi/kontroll-gruppen var den perifere insulinsensitiviteten (WGD) redusert med 44 % sammenlignet med preoperative målinger, til sammenligning var nedgangen kun 9
% i kirurgi/GLP-1-gruppen (P < 0.05). Den hepatiske insulinsensitiviteten (EGR) var
uforandret i kirurgi/kontroll-gruppen, mens den derimot ble forbedret etter infusjon av GLP-1 i både kirurgi og narre-kirurgi-gruppen (40% og 104%, henholdsvis, begge P<0.05). Den intraoperative plasma-glukosen økte i kirurgi/kontroll-gruppen (~20%), mens den forble uforandret i begge gruppene som fikk GLP-1 (P < 0.05). Innhold av glykogen i
skjelettmuskulatur og insulinsignaleringsproteiner etter kirurgi ble ikke påvirket av GLP-1- infusjon.
Konklusjon: En intraoperativ infusjon av GLP-1 normaliserer postoperativ perifer
insulinresistens og forbedrer glykemisk kontroll ved større abdominal kirurgi uavhengig av insulin og uavhengig av IRS1-PI3-Akt-pathway.
1. Innledning
1.1 Bakgrunn
Elektive kirurgiske inngrep har blitt vanligere og vanligere i den utviklede delen av verden og med den raske utviklingen innenfor medisinen er det rimelig å anta at antall og forskjellige typer inngrep som blir utført blir å øke. Begrepet stress-respons er en paraply-betegnelse for de metabolske og hormonelle endringene som inntreffer ved og etter skade. Dette inkluderer en endokrin og en immunologisk respons som evolusjonært sett har utviklet seg for å øke overlevelse i forbindelse med sykdom og skade, i en premedisinsk æra uten pleie, medisiner og kirurgi. Nyttige responser kan være mekanismer for å forhindre exsanguinering:
optimalisering av cardiac output ved salt- og vannretensjon og hyperglykemi med høyere osmolaritet intravasalt. I en rekonvalesensperiode vil også katabolisme for
næringsmobilisering tenkes nyttig.
Insulin er vårt absolutt viktigste anabolske hormon, og resistens i perifer muskulatur og lever mot dens virkninger er en av de mest grunnleggende reaksjonene på stress og skade.
Ved sistenevnte oppstår en akutt respons med metabolsk stress som hurtig stanser all anabolsk aktivitet, og man får en katabolsk tilstand med mobilisering av alle næringssubstrater (fett, proteiner og karbohydrater) for konsum og byggestener til akuttfaseproteiner og andre
substrater som er behøvd. Slike responser har i moderne tid møtt akademisk motstand i lys av dagens situasjon hvor vi kan sørge for adekvat ernæring og andre tiltak i rekonvalesensen.
Likevel, er det ikke urimelig å tenke at dette kunne være en benign og nyttig respons som man ikke skal røre ved, også ved elektiv kirurgi og moderne behandling av traumer og sykdommer - hvilket har vært status quo.
I denne debatten har oppmerksomheten rundt hyperglykemi og insulinresistens ved traumer og kirurgi stått sentralt, da man har vist at det er assosiert med økt morbiditet og mortalitet , og at behandling reduserer risiko . Den postoperative insulinresistensen sin 1 2 3 størrelsesorden korrelerer også med størrelsen av det kirurgiske inngrepet, og manglende følsomhet til insulin sees i større og større grad på som et mulig sine qua non for mange sentrale postoperative komplikasjoner . 4 5
Inkretinet GLP-1 har fått økt oppmerksomhet grunnet dens egenskaper i behandling av diabetes mellitus type II, og senere ved traumatisk hyperglykemi og insulinresistens da GLP-1
har den fordelen at den er strengt glukose-avhengig for å utøve sin pancreatiske effekt, og at hypoglykemi ved insulinbehandling er vist å øke dødeligheten . Det er stadig vekk mange 6 7 åpne spørsmål knyttet til virkningsmekanismer for både GLP-1 og postoperativ
insulinresistens, hvorav noen jeg vil komme nærmere inn på i oppgaven, og mange vil stå ubesvart.
1.2 Postoperativ insulinresistens 1.2.1 Historisk
Forstyrrelser i glukose-homeostasen ved sykdomstilstander og traumer har vært kjent lenge, og allerede i 1853 avdekket Reynoso glukosuri i den post-operative fasen . Drøye 20 år 8 senere kom det et studium av Bernard som viste at hunder som ble utsatt for blødning utviklet hyperglykemi . I 1932 beskrev Cuthbertson metabolske endringer hos mennesker utsatt for 9 skade på underekstremitetene, hvorpå han introduserte begrepene «ebb and flow», hvor han refererte til den initialt kortvarige økte metabolismen etter et traume med generering av næringssubstrater, og den etterfølgende mer klinisk viktige fase med katabolisme, som til sist går over i anabolisme og rekonvalesens . Hyperglykemi etter skade og sykdom er godt 10 dokumentert helt tilbake til de første dekader av 1900-tallet, og tidlig kalt for «diabetes of injury» eller «stress diabetes» . Glukose-toleranse-tester gjort tilbake i blant annet 1938 11 12 og 1932 hos henholdsvis skadde og septiske pasienter, viste redusert utnyttelse av glukose i perifert vev med hyperglykemi - hos Thomsen i 1932 kalt «traumatic diabetes» . I en 13 14 artikkel av Black fra 1982, «Mechanisms of insulin resistance following injury», diskuteres det at denne såkalte «diabetes of injury» kunne vært forklart om det faktisk forelå en
insulinmangel, dog i «flow»-fasen normaliseres β-celle-responsen til glukose, likevel med en persisterende langvarig hyperglykemi, indikativt på en manglende adekvat respons på insulin i forskjellige typer vev. Ved hjelp av hyperinsulinemisk euglykemisk clamp (HEC)
demonstrerte Black at WGD etter traume er redusert og at insulinresistensen hovedsakelig er perifert i skjelettmuskulatur ¹¹.
Postoperativ insulinresistens vil nå sin topp på det 2. postoperative døgn, og varer 2-3 uker etter kirurgi 15 16 ⁵. Den manglende sensitiviteten til insulin er initialt og primært perifert i sitt opphav, som vist av Black, men det følger også en fase med hepatisk insulinresistens . 17 18 Graden av insulinresistens samsvarer med alvorlighetsgraden av det kirurgiske traumet ⁵.
Mekanismene bak forskes stadig på, og er antagelig en kombinasjon av nevroendokrine virkninger, inflammasjon og frislipp av stresshormoner. Økte nivåer FFA og oksidativt stress er også foreslått som mulige bidragsytere.
1.2.2 Rasjonale for behandling
Ut fra samme rasjonale som gjør at vi behandler diabetes, har man tidlig tenkt at å forebygge og/eller behandle traumatisk og postoperativ insulinresistens er gunstig og kan redusere komplikasjoner og mortalitet. Furnary et al. har blant annet siden 1992 implementert streng glykemisk kontroll ved hjertekirurgi, og i et stort arbeide vist redusert forekomst av sternale sårinfeksjoner . I et annen stort studium som så på data mellom 1990 og 1996 ble det vist at 19 postoperativ insulinresistens er sterkt assosiert med varighet av innleggelse ⁵. I det større bildet, har insulinresistens hos kritisk skadde vært et hett tema, særlig siden van den Berghe i 2001 publiserte et prospektiv randomisert-kontrollert studium med 1548 pasienter på en kirurgisk intensivavdeling, hvor man enten fikk aggressiv insulinbehandling med opprettholdelse av glukose < 6.1mmol/L eller konservativ behandling der man kun
intervenerte dersom glukose > 12.0 mmol/L. Blant resultatene var en redusert mortalitet på 40
% samt færre komplikasjoner som dialyse-krevende nyresvikt og sepsis . Dette medførte en 20 global dreining mot å i større grad behandle hyperglykemi aggressivt hos kritisk syke
pasienter.
I 2002 utkom et studium hvor man viste en assosiasjon mellom hyperglykemi ved innleggelse og outcome hos pasienter også ved andre avdelinger enn intensivavdelinger , et 21 viktig bidrag i forståelsen av at insulinresistens ikke er noe som begrenser seg kun til kritisk syke og operative pasienter. I en viktig prospektiv kohorte fra 2010 av Sato et al. med 273 inkluderte pasienter, ble det vist at dårlig glykemisk kontroll og intraoperativ insulinresistens ved hjertekirurgi øker forekomsten av alvorlige komplikasjoner (sepsis, hjertesvikt,
sårinfeksjoner, nyresvikt m.m.); de viste blant annet at et fall i insulinsensitivitet med 50 % øker sjansen for alvorlige komplikasjoner 5-6 ganger, og sjansen for alvorlig infeksjon opptil 10 ganger . Studien er kanskje den første som ga indirekte bevis for at forhindring av 22 postoperativ insulinresistens kan ha en direkte og drastisk forbedring av outcome. Videre, er det vist at å holde tilnærmet normoglykemi intraoperativt, faktisk bedrer insulinsensitiviteten i
seg selv, dette var en RCT fra 2012 med hepatektomerte pasienter og insulinsensitiviten ble målt med gull-standarden hyperinsulinemisk euglykemisk clamp både pre- og postoperativt . 23 I lys av evidens som støtter rasjonale for behandling av postoperativ insulinresistens samt insulins sentrale stilling som anabolsk hormon med virkninger på alle næringssubstrater, er det økende støtte for at tilstanden har en sentral posisjon i utvikling av mange postoperative komplikasjoner som påvirker outcome.
1.2.3 Katekolaminer og glukokortikoider
Kirurgi er definitorisk sett en planlagt traume, og enhver skade mot kroppens vev vil utløse en stress-respons med immunologiske og endokrinologiske reaksjoner. «Fight or flight»-
mekanismen aktiverer hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen som gir utskillelse av
corticotropin-releasing hormone som aktiverer corticotropin (ACTH) fra adenohypofysen som igjen stimulerer binyre-cortex og gir frislipp av kortisol. Videre forekommer det utskillelse av adrenalin fra binyrene samt noradrenalin fra presynaptiske nerveterminaler. Katekolaminene er opphavet til de kardiovaskulære responsene ved stress - tachycardi og hypertensjon.
Katekolaminene utøver også flere virkninger på metabolismen. Adrenalin øker
glukoneogenesen, lipolysen og pancreatisk sekresjon av insulin, og nivåene av katekolaminer stiger umiddelbart etter skade, men er normaliserte lenge før insulinsensitiviteten 24⁵.
Kortisol er anerkjent som en induktor av insulinresistens, og i en studie fra 1997 ble det vist at ved glukokortikoid-overskudd blir translokasjon av GLUT-4 i skjelettmuskulatur redusert, sekundært til en redusert hemmende effekt av glukose-6-fosfat på hexokinase- enzymet. De viste også at glukose-oksidasjon og glykogensyntesen ble redusert, sistenevnte via regulering av glykogen-syntase-kinase-3-aktivitet . Kortisol virker også på 25
transkripsjonsnivå ved å øke ekspresjonen av PDK4 (se avsnitt 1.2.6 for detaljer). Imidlertid, er kortisol og katekolaminer økt umiddelbart etter kirurgi, men faller raskt og anses ikke som en sannsynlig årsak til den persisterende insulinresistensen som kan vedvare i flere uker ¹⁶ ⁵, selv om de umiddelbart bidrar til redusert WGD.
1.2.4 Insulins fysiologi
Insulin er det primære anabolske hormon endelig isolert i 1921 i det berømte forsøk av kirurg Banting, medisinerstudent Best og professor McLeod, som medførte en behandling for
diabetes og ikke overraskende Nobelprisen. Insulin virker på alle våre hovedbyggeklosser - proteiner, fettsyrer og karbohydrater. Insulin syntetiseres og secerneres fra β-cellen i pancreas i respons til vagal stimuli (cephalisk fase), glukose, inkretinhormer og aminosyrer i tarm.
Glukose entrer β-celler i pancreas via GLUT-2, hvor via glykolysen og Krebs syklus det dannes ATP som binder en ATP-sensitiv kalium-kanal som skaper en depolarisering og et aksjonspotensiale som aktiverer spenningsstyrte kalsium-kanaler, dette gir influx av kalsium som påvirker insulin-fylte granuler til å secernere insulin ut i blodet.
Insulin-secernering er bifasisk, og ved intravenøs bolus av glukose inntrer første
«hurtige» fase etter 1 minutt som når toppen etter 3-4 minutter og avtar etter 10 minutter. Den andre «trege» fasen inntrer kort tid etter glukose-bolus, og er ikke målbar etter 10 minutter . 26
Insulin øker glykogensyntesen ved å defosforylere glykogensyntase som omdanner glukose til glykogen, og hemmer glykogenolysen ved defosforylering av glykogenfosforylase kinase som omdanner glykogen til glukose-1-fosfat. Videre promoterer insulin
proteinsyntesen i en rekke vev ved påvirkning av transkripsjon. Insulin hemmer eksempelvis mRNA-transkripsjon for karbamoyl fosfat-syntetase, et nøkkelenzym i urea-syklusen, og dermed bidragende til økt proteinanabolisme. Insulin vil også stimulere fettsyresyntese i adipocytter, brystkjertelvev og lever ved å aktivere og øke fosforylering av acetyl-Coa- karboxylase som er nøkkelenzymet for dannelse av malonyl-CoA som substrat for fettsyredannelse. Fett-oksidasjonen reduseres ved å hemme karnitin-acyltransferase, triglycerid-syntesen stimuleres ved esterifisering av glycerolfosfat, mens
triglyceridnedbrytning hemmes ved defosforylering av hormonsensitiv lipase.
Kolesterolsyntesen økes, og proteinkatabolismen og lipolysen hemmes, og via sistenevnte reduserte mengder frie fettsyrer (FFA) i blod²⁶ ²⁴.
1.2.5 «Insulin signaling pathway»
I muskulatur binder insulin til et ekstracellulært domene på insulin-reseptoren, som intracellulært katalyserer fosforyleringen av insulin reseptor-substrat-1 (IRS1). Dette medfører at fosfoinositid-3-kinase (PI3K) fosforylerer og katalyserer omdannelsen av fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP₂) til fosfatidylinositol 3,4,5-trisfosfat (PIP₃). Dette
initierer en kaskade av kinaser som til sist aktiverer protein-kinase B (Akt). Dette medfører at
vesikler med GLUT4 translokeres til cellemembranen og dermed fremmes intracellulært glukose-opptak.
Perifert glukoseopptak står for kvantitativt ∼ 80 % av total glukose-oksidasjon i kroppen. Det er vist redusert aktivering av IRS1-PI3K-Akt-pathway etter kirurgi , som da vil 27 kunne gi redusert translokering av GLUT-4 til cellemembranen, men også observert normalt uttrykt IRS1-PI3K-Akt og GLUT-4 postoperativt , det er dermed uavklart og mindre 28 sannsynlig at IRS1-PI3K-Akt-pathway har en stor eller direkte effekt på postoperativ insulinresistens.
1.2.6 Glukose-oksidasjon, mitokondriell metabolisme og ROS
Intracellulær glukose vil enten omdannes til glykogen via glukose-6-fosfat eller inngå i glykolysen med dannelse av pyruvat som fraktes inn i mitokondrium via
pyruvatdehydrogenasekomplekset (PDC) hvor det omdannes til acetyl-Coa. PDC er
bindeleddet mellom glykolysen og Krebs syklus. PDC dekarboxylerer pyruvat til acetyl-CoA som inngår i Krebs syklus med reduksjon av NAD⁺ til NADH som oksideres i kompleks I i elektrontransportkjeden (ETC) og dermed gir elektroner til den. Videre, succinat-oksidasjon i Krebs syklus reduserer FAD⁺ til FADH₂ som oksideres i kompleks II i ETC og elektroner passerer ETC helt til kompleks IV hvor det dannes H₂O. Denne prosessen overfører protoner fra matrix i mitokondrium til intermembranrommet, dermed dannes et mitokondrielt
membranpotensial ∆𝜓m, hvor denne energien fosforylerer ADP til ATP via en ATPase (kompleks V) slik at protoner pumpes tilbake til matrix i mitokondrium og ∆𝜓m reduseres.
All oksidativ fosforylering fører til dannelse av reaktive oksygenradikaler (ROS) på grunn av elektrontap som danner superoxid (O₂⁻). I kompleks I dannes O₂⁻ på matrix-siden av den indre mitokondrielle membranen, mens i kompleks III dannes O₂⁻ på begge sider.
Umiddelbart etter får man H₂O₂ ved superoxid-dismutase (SOD) . ROS er vist å kunne 29 indusere insulinresistens ved aktivering av diverse stress-kinsaser som direkte virker i IRS1- PI3K-Akt-pathway, det er også studier som viser økte nivåer av ROS i DM-II. 30 31 32 33 34 35
. Dette har konsekvens da postoperativ insulinresistens blant annet gir økt cellulær forsyning
36
av metabolske substrater, hvilket øker mitokondriell metabolisme og dermed økte nivåer av
ROS. Foreløpig er det mangler på studier innenfor postoperativ insulinresistens og betydningen av ROS.
PDC inaktiveres ved økt fosforylering av pyruvat dehydrogenase kinase-4 (PDK4) i skjelettmuskulatur, og dermed reduseres mitokondriell utnyttelse av glukose og i siste instans insulins effekt på WGD . PDK-4 er dermed en sentral regulator for glukoseutnyttelse, og 37 38 er målgenet for blant annet peroxisom proliferator aktivert reseptor (familie av
transkripsjonsfaktorer som øker genekspresjon) (PPAR) som er vist å aktiveres av FFA og medfølgende økt PDK-4-aktivitet hos overvektige³⁸ 39 40 41 42 , og dermed reduseres glukose- oksidasjonen. I en studie er det også vist at det er en «forkhead transcription factor» (FOXO1) lokalisert nedstrøms i «insulin signaling pathway» som får økt ekspresjon under faste, og mer interessant så man en stor økning i ekspresjon av PDK-4, ved at FOXO1 binder til
promotoren for genet . Det er med andre ord en direkte forbindelse mellom en katabolsk 43 tilstand, hemming av PDC via PDK-4 og dermed glukose-oksidasjon. Det er også vist at binding av kortisol til promotoren til PDK-4 øker ekspresjonen . 44
1.2.7 Lipider
Som diskutert tidligere hemmer insulin lipolysen ved å defosforylere hormon-sensitiv lipase mens katekolaminer og glukagon har motsatt effekt og gir økte nivåer av FFA. Man har gjort forsøk med lipidinfusjoner som øker FFA i plasma, hvor man har sett en reduksjon i
insulinstimulert WGD hos mennesker . Ved hjelp av HEC har man i disse studiene sett 45 46 47 at insulinsensitiviteten reduseres bare 3-5 timer etter elevasjon i plasma-FFA. Randle et al. har også vist at FFA konkurrerer med glukose i å bli oksidert i muskulatur , følgelig har det vært 48 spekulert i om bakgrunnen for insulinresistensen er en økt fett-oksidasjon. Fra dette ble det teoretifisert at man ville få en økning i mitokondrielt acetyl-Coa:CoA- og NADH:NAD⁺-ratio og medfølgende inaktivering av pyruvatdehydrogenase, hvilket videre ville gi en økning i intracellulære citrat-nivåer og inhibering av fosfofruktokinase og glukose-6-fosfat-
akkumulering. Da glukose-6-fosfat hemmer hexokinase-aktivitet ville dette medføre økt intracellulært glukose og redusert glukoseopptak. Dessverre viste studier at glukose-6-fosfat ikke ble økt, men redusert ved økte plasma-FFA, at glukose-oksidasjon og glykogensyntese var 50-60 % lavere ved FFA-infusjon, og at konsentrasjonen av glukose-6-fosfat intracellulært
var redusert med ∼90 %. Dette impliserte at effekten var på selve GLUT-4, og man fant at IRS-1 og PI3-kinase også var reduserte 49⁴⁵. Som diskutert i avsnitt 1.2.6 er FFA vist å aktivere PPAR som blant annet regulerer PDK-4-ekspresjon, samt å promotere ROS- produksjon som påvirker insulinsignalering³⁰ ³¹ ³² ³³ ³⁴³⁵ ³⁶ . Når det gjelder postoperativ 50 insulinresistens og FFA, er det vist reduserte nivåer av plasma-FFA ved CHO-loading og forbedret insulinsensitivitet postoperativt , samt et studium av brannskadde hvor man fant 51 økte nivåer av plasma-FFA og et skifte mot FFA-metabolisme . Likevel, er det ikke enighet 52 og fortsatt mange ubesvarte spørsmål knyttet til FFA og postoperativ insulinresistens.
1.2.8 Inflammasjon
I 1876 demonstrerte Ebstein at behandling med natrium-salicylat (effekt som NSAIDs) ved mild diabetes reduserte glukosuri . Senere i 1957 ble det oppdaget at diabetikere behandlet 53 med acetylsalisylsyre ikke krevde daglige insulininjeksjoner, og at fastende blod-glukose ble dramatisk redusert . I siste halvdel av 80-tallet ble det vist at cytokinet IL-6 er økt etter 54 elektiv cholecystektomi , og endelig i 1993 ble det vist at nøytralisering av TNF-α (fra 55 adipocytter) ga økt perifert insulin-betinget glukoseopptak , hvilket etablerte den 56 patofysiologiske koblingen mellom inflammasjon og insulinresistens - sistenevnte kardinaltrekket ved DM-II.
Man tenker at økte nivåer av cytokiner ved kirurgi kan indusere insulinresistens på to måter: Å direkte (TNF-α og IL-1β) aktivere IκB-kinase-β/NF-κB-aksen, som hemmer IRS1- PI3K-Akt-pathway . Den andre mekanismen som er studert er ved at cytokiner som tidligere 57 diskutert øker lipolytisk aktivitet og dermed FFA i blod, hvilket induserer insulinresistens som diskutert.
1.2.9 Faste og preoperativt karbohydrat-inntak (CHO-loading)
Siden introduksjonen av generell anestesi har det vært standard retningslinjer å faste pasienter fra midnatt og fram til kirurgi for å unngå pulmonal aspirasjon. Fasting fører til en alvorlig katabolsk tilstand med bare et mulig utfall, og dens mulige uheldige potensiale ved elektiv kirurgi har og er gjenstand for forskning. Preoperativ faste gir økt metabolsk stress og selv kortvarig faste er vist i HEC-studier å redusere insulinsensitiviteten . Retningslinjer for 58
forebygging av dette er inntak av en glukose-rik-væske (CHO-loading) før midnatt og 2-3 timer før kirurgi . Dette reduserer preoperativt stress, angst, sult, tørst og reduserer 59 insulinresistens . Man har dog vist at CHO-loading øker aktiveringen av IRS1-PI3K-60 61 62 Akt-pathway, samt senker nivåene av katekolaminer og cytokiner²⁷⁵¹ . Om CHO-loading 63 faktisk kan påvirke outcome ved en isolert effekt, er omdiskutert, selv om den bedrer insulinsensitiviteten.
1.3 Inkretiner
1.3.1 GLP-1 og dens fysiologi
I 1923 oppdaget man et hormon fra pancreatiske extrakter med en hyperglykemisk effekt, glukagon. Det var også mistenkt at tarmen inneholdt substanser med hyperglykemiske
effekter utskilt fra endokrine epiteliale celler som lignet på α-celler i pancreas, L-celler i colon og distale ileum. I 1948 ble det foreslått av Sutherland og DeDuve at extrakter fra
ventrikkelen kunne inneholde glukagon . Oppfinnelsen av radioimmunoassay for glukagon 64 var et av de første utviklede radioimmunoassay, hvilket kunne bekrefte at tarmen inneholdt stoffer med glukagon-immunoreaktivitet. Man oppdaget precursoren for glukagon, glicentin, men også at det i pancreas ble dannet et annet molekyl, «the major proglucagone
fragment» (MPGF), som ikke inneholdt sekvensen for glukagon, men to andre sekvenser for to peptider, GLP-1 og GLP-2. Disse ble utskilt parallelt med glukagon fra pancreas, men med en fysiologisk effekt som skilte seg fra glukagons. Videre ble det klart at L-celler i tarm skiller ut GLP-1 og GLP-2 fra MPGF, mens glicentin ikke ble kløyvet videre. GLP-1 inaktiveres hurtig intravasalt av dipeptidyl peptidase 4 (DPP 4) og har en t₁/₂ på < 2 minutter . 65
GLP-1 sine primære fysiologiske effekter er økt insulinsekresjon, redusert
glukagonsekresjon og dermed totalt sett motvirkning av postprandiale glukose-stigninger.
Utover dens insulinotrope effekt, stimulerer den også β-celle-proliferasjon, motvirker β-celle- apoptose, hemmer glukagon-secernering fra pancreatiske α-celler og ventrikkel-tømning samt fremmer metthetsfølelse 66 67 68⁶⁵. For å studere effekten på glukagon, er det infusert GLP-1 i pasienter med DM-I og ingen β-celle-restfunksjon, hvor man så påvirkning av EGR ved redusert fastende blod-glukose, antatt via redusert glukagonsekresjon . At GLP-1 reduserer 69 EGR har dermed vært antatt at dreier seg om regulering av pancreatisk hormonutskillelse.
Dog, det er senere vist at GLP-1 kan redusere EGR hos fastende subjekter uavhengig av pancreatiske hormoner , mens andre studier ikke viser noen påvirkning av hverken EGR 70 71 eller WGD hos friske individer . D’Alessio et al. har vist forbedret perifert 72 73 74
glukoseopptak ved GLP-1-infusjon hos friske individer uavhengig av insulin , men 75 76 metoden har vært noe kritisert da det har vært tvil om i hvor stor grad man har lyktes i å supprimere pancreatisk hormonsekresjon.
Studier av GLP-1-reseptoren i myocytter på knock-out mus har foreslått at GLP-1 har en direkte virkning i perifer muskulatur, ved å direkte øke glykogensyntase-aktiviteten, samt virkning i IRS1-PI3K-Akt-kaskaden og dermed økt glukose-forbruk . Dette er 77 78 79
omdiskutert da man som nevnt har motsigende resultater fra glukose-clamp-studier på friske personer.
Stimuli for sekresjon av GLP-1 er antatt å være næringssubstrater i tarmsystemet, men man har begrenset kunnskap om hvilke virkningsmekanismer som er i spill mellom
næringssubstratene og L-cellene⁶⁵ ⁷². GLP-1 virker på pancreatiske β-celler ved å binde til en G-protein-koblet reseptor, GLP-1-reseptoren. De fleste effektene av denne bindingen er så langt man vet sekundære til aktivering av cAMP, og GLP-1 sin insulinotrope effekt er strengt glukose-avhengig. Under en grense på ∼ 8 mmol/L vil selv farmakologiske doser av GLP-1 ikke ha noen effekt på fastende blod-glukose . Kalium-kanalen i β-cellene er sensitiv for 80 ATP, og dermed glukoseforbrenning, men også for protein-kinase A (PKA) som aktiveres av GLP-1. ATP og PKA virker således synergistisk på kanalen og skaper et membranpotensiale som aktiver kalsium-kanalene og dermed insulin-secernering. Ytterligere mekanismer for GLP-1 sin effekt er også diskutert i litteraturen⁶⁵.
GLP-1-reseptoren er identifisert i flere typer vev enn pancreas, blant annet myocytter, lever, hjerte, endotelium og adipocytter⁶⁵. Videre, er GLP-1 vist å ha flere gunstige ekstra- pancreatiske effekter, som å redusere ischemisk skade i myokard , økt ejeksjonsfraksjon hos 81 pasienter med hjertesvikt og det er vist nevrotrope effekter der den er foreslått som 82
medikamentell behandling av morbus Alzheimer . GLP-1 har en vasodilaterende effekt på 83 mikrosirkulasjonen antagelig grunnet frislipp av nitrogenoksid . GLP-1 er også vist å ha 84 antiinflammatorisk og antioksidativ effekt i et studium fra 2014, hvor blant annet IL-6- nivåene ble redusert ved GLP-1-infusjon hos type-II-diabetikere . 85 86
I et studium fra 2002 er den vist å redusere insulinresistens hos type-II-diabetikere, og i et annet lignende studium fra 2003 med like samme resultater . Fysiologien bak dette er 87 88 ikke avdekket, og som tidligere nevnt er det usikkert om den forbedrer insulinresistens via en forbedret glykemisk kontroll, ved en direkte effekt i perifert vev på myocyttene, eller ved regulering av inflammasjon.
1.3.2 Inkretin-effekten
Inkretin-effekten har sin plass i et større bilde i den medisinske historie. Fram til 1900-tallet var den regjerende oppfatning at kroppens biologiske funksjon utelukkende var regulert av nerver, men i første dekade av det 20. århundre ble dette utfordret av Bayliss og Starling hvor det ble spekulert i om tractus gastrointestinalis kunne kommunisere med pancreas via
substanser i blodet . Med begrepet inkretin-effekten, viser man til at insulin-responsen fra 89 90 pancreas er større ved et peroralt inntak av glukose, enn ved intravenøs administrering, på grunn av intestinale hormoner som virker i pancreas, hvorav GLP-1 regnes som det mest betydningsfulle. Ved et peroralt inntak av glukose har man sett at insulinresponsen øker 2-3 ganger sammenlignet med samme dose gitt intravenøst, som en følge av inkretiners
amplifiserende effekt . 91
1.3.3 GLP-1 - terapeutisk bruk ved postoperativ insulinresistens
Tilbake i 1986 viste Nauck et al. at inkretin-effekten var markant redusert ved langtkommen DM-II, mens GLP-1 sin insulinotrope effekt var bevart . Dette katalyserte den 92
farmakologiske satsningen på GLP-analoger som behandling for DM-II. Hos kritisk syke pasienter burde man tilstrebe glukose < 10 mmol/L (den eksakte grensen er omdiskutert), og flere studier har vist at ved intensiv insulinterapi er det økt forekomst av alvorlig
hypoglykemi som er assosiert med økt mortalitet⁶ ⁷. Dette er sterke indisier på at behandlings- indusert-hypoglykemi burde unngås. GLP-1 hemmer glukagon- og stimulerer
insulinsekresjonen i en strengt glukose-avhengig mekanisme, sammens med tidligere nevnte gunstige ekstra-pancreatiske effekter (se 1.3.1 for detaljer). Kontinuerlig insulin-terapi krever også store ressurser og opplæring av personale, med hyppige glukose-målinger og
insulinintervensjon som øker sjansen for feilbehandling. Oppsummert, er GLP-1 foreslått som
en attraktiv kandidat for behandling av insulinresistens hos kirurgiske og kritisk syke pasienter, uten risiko for alvorlig hypoglykemi som ved insulinbehandling.
Det er begrensede data på bruk av GLP-1 hos kirurgiske pasienter, men Galiatsatos et al. viste i 2014 at ved ha GLP-1 som adjuvant behandling til insulin hos kritisk syke
kirurgiske pasienter, bedret man glykemisk kontroll . Til vår kjennskap er det ikke 93
gjennomført studier som evaluerer hepatisk og perifer insulinsensitivitet hos postoperative pasienter behandlet med en perioperativ infusjon av GLP-1. Vi har brukt gullstandarden for beregning av perifer og hepatisk insulinsensitivtet (hyperinsulinemisk euglykemisk clamp) . 94 For å kunne si noe om endogen glukoseproduksjon er metoden kombinert med merket glukose - glukose-tracer.
Vi ønsket å evaluere hepatisk og perifer insulinsensitivitet hos elektive kirurgiske studiesubjekter behandlet med en perioperativ GLP-1-infusjon. Videre evaluere glykemisk kontroll, nivåer av stress-hormoner, muskulært glykogeninnhold, «insulin signaling pathway»
og pancreatisk insulin-sekresjon.
Om GLP-1-terapi reduserer mortalitet og morbiditet hos kirurgiske pasienter gjenstår å se, og omfattes ikke av dette studium.
2. Materiale og metode
2.1 Studiedesign og kirurgisk intervensjon
19 griser ble undersøkt med 2 etterfølgende forsøk på forskjellige dager. På dag 1 ble grisene anestesert og vi målte preoperativ basal glukoseomsetning, deretter ble intraoperativ perifer og hepatisk insulinsensitivitet målt ved hjelp av 2-stegs-hyperinsulinemisk euglykemisk clamp (HEC). Pancreatisk insulin-secernering ble målt ved hjelp av hyperglykemisk clamp.
Etterfølgende ble dyrene tillatt 5 dagers hvile, før de ble randomisert til: Kirurgi/GLP-1 (10 pmol/min/kg, n=7), kirurgi/kontroll (n=7) eller narre-kirurgi/GLP-1 (n=5). Dyrene eksponert for kirurgi gjennomgikk en midtlinje-laparatomi med reseksjon av 1,5 m tynntarm, primær anastomose 1,5 m proximalt for valva ileocaecalis (varighet ~ 2 timer). Man lukket og målte postoperativ basal glukoseomsetning, insulinsensitivitet (HEC) og insulin-sekresjonskapasitet
(hyperglykemisk clamp), like etter kirurgisk traume. Både pre- intra- og postoperative blodprøver, lever- og muskelbiopsier ble tatt underveis i forsøkene.
2.2 Dyr, anestesering og instrumentering
Protokollen var godkjent av Mattilsynet og utført i henhold til nasjonale og lokale retningslinjer samt «National Institute of Health» (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [Dept of Health and Human Services (NIH) 85-23, revidert 1985].
Yorkshire/Landrace hybrid-griser med vekt på cirka 29 kg ble akklimatisert i en
forskningsavdeling for dyr én uke før forsøkene. Grisene hadde en 12:12-timers lys-mørke- syklus, standardisert diett og ad libitium tilgang til vann. De ble fastet 12 timer før forsøkene, som ble gjennomført mellom klokken 07:00 og 20:00.
Dyrene ble først sedert intramuskulært med 15 mg/kg ketamin, 1 mg/kg midazolam og 1 mg atropin. Deretter ble de vasket og veide. Anestesi foregikk med 4 % isofluran-gass blandet med 100 % O₂. Dyrene ble deretter orotrachealt intubert, med videre gassanestesi blandet med nitrogenoxid og oksygen (40/60 %) og en mimimal alveolær konsentrasjon (MAC) mellom 0,5-1,5 %. Dyp anestesi ble gjort ved i.v. bolus 0,01 mg/kg fentanyl og opprettholdt med i.v. infusjon 0,02 mg/kg/t fentanyl og 0,3 mg/kg/t midazolam. Grunnet isoflurans kjente pancreatiske påvirkning ble den seponert under hyperglykemisk clamp, hvor dyp sedasjon ble opprettholdt med 0,9 mg/kg/t midazolam og 0,02 mg/kg fentanyl.
Respirasjonen ble monitorert med Capnomac-instrument (Datex, Tewksbury, MA, USA) og anestesi ble justert ved hjelp av blodgasser (ABL 800 FLEX; Radiometer, Copenhagen, Denmark) og snute-reflekser. Alle dyrene hadde arterie-kran og invasiv
blodtrykksmonitorering, sammen med måling av hjertefrekvens og temperatur. Varmetepper eller is ble brukt for å opprettholde normal kjernetemperatur for gris på 38,5 C°.
2.3 Tracer-infusjon og hyperinsulinemisk-euglykemisk step-clamp
Gullstandarden for å evaluere perifer insulinsensitivitet er hyperinsulinemisk euglykemisk clamp⁹¹ Ved en konstant insulin-infusjon (hyperinsulinemisk) vil man supprimere hepatisk glukoseproduksjon og endokrin pancreas (vist ved måling av c-peptid). Mengden infundert glukose som opprettholder euglykemi vil dermed fortelle oss kroppens totale forbruk av
fullstendig supprimert, og det vil være en residualproduksjon som frigjøres i sirkulasjonen.
Derfor kombinerer man HEC med merket glukose (tracer), slik at man kan differensiere mellom endogen og eksogen glukose, og følgelig kan man måle både perifert glukoseopptak og hepatisk glukosefrigjøring . 95 96
To-stegs hyperinsulinemisk euglykemisk clamp, refererer til at man utfører HEC med lav og høy insulininfusjon. Rasjonale bak dette er at clamp på for høy insulinkonsentrasjonen vil nærmest totalt supprimere EGR og man potensielt vil kunne skjule GLP-1 sin effekt på hepatisk glukoseproduksjon. Ved høy insulininfusjon er det ønskelig å supprimere EGR og endokrin pancreas for å evaluere WGD. Insulin ble dermed gitt med hastighet 0,4 mU/kgU/
min (HEC 1) og 1,2 mU/kg/min (HEC 2).
Basal glukose-omsetning ble målt under de siste 30 minuttene av en 90 minutter lang (6 mg/kg kontinuerlig 0,12 mg/kg/min) infusjon av D-[6,6-2H2]glukose (basalperioden).
Etterfølgende målte man perifer og hepatisk insulinsensitivitet ved to 120 minutter lange hyperinuslinemiske euglykemiske clamper (~4.5 mmol/L) med merket glukose-infusat (2.1 %
«atom percent enrichment» APE%). Glukose-tracer i arterielt blod ble målt ved hjelp av væske kromatografi med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) (31). WGD og EGR ble kalkulert ved en modifisert versjon av Steeles-ligning.
2.4 Hyperglykemisk clamp
Hyperglykemisk clamp tar mål å på å evaluere pancreatisk insulin-secernering ved å administrere en glukose-bolus (300 mg/kg) over 45 sekunder. Deretter clampet vi i 120 minutter på omtrent 15 mmol/L glukose. Dette gjør at man kan evaluere pancreatisk endokrin funksjon. Vi målte insulin hvert 2 minutt i de første 10 minuttene, og deretter hvert 10 minutt.
1. og 2. fase insulin-secernering ble kalkulert som areal under kurven (AUC) i de første 10 minuttene (AUC0-10) og for restansen av clampen( AUC10-120), henholdsvis.
2.5 Hormonanalyser,frie fettsyrer (FFA) og vevs-glykogen-innhold
Vi målte serum-insulin og plasma-glukagon med RIA-metoder (Linco research, Inc., St.
Charles, MO, USA). Videre målte vi c-peptid med svin-ELISA-kit (Mercodia, Uppsala, Sweden). S-kortisol målte vi med electrochemiluminescence immunoassay (Roche
Diagnostics, Basel, Switzerland). Plasma-FFA ble bestemt ved hjelp av kolorometrisk assay- kit (Wako Diagnostics, Richmond, VA, USA). Innhold av glykogen i muskel og lever ble bestemt som glukose-enheter etter hydrolyserende makroglykogen og syre-uløselige proglykogen, ved hjelp av en hexokinase reagens-kit (Horiba ABX, Montpellier, France).
2.6 Western Blots
Skjelett-muskulatur (⁓30 mg) ble blandet i en RIPA-buffer, som inneholdt fosfatase- og protease-inhibitorer (Roche, Basel, Switserland). Vi målte protein-konsentrasjonene med DC protein-assay (Bio-rad, Hercules, CA, USA) med antistoffer mot total AKT (#9272), p-AKT (Ser473) (#9271), PI3K p85 (#4292). Det sekundære antistoff, anti-kanin (#7074), ble skaffet fra Cell Signaling (Beverly, MA, USA). Anti-Actin (#A2006, Sigma, Saint Louis, MO, USA) ble brukt som loading kontroll. Videre ble det kvantifisert ved hjelp av Image Studio (LI- COR, Lincoln Neb, USA) og uttrykt som «fold-change» fra preoperative verdier.
2.7 Inflammasjon
Plasmaprøver ble analysert ved hjelp av multiplex cytokin assay (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) som analyserte TNFα, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL1β, IFNα og IFNγ på en Multiplex analysator (Bio-Rad Laboratories) i henhold til produsentens instruksjoner.
2.8 Statistikk
Alle verdiene er vist som gjennomsnitt ± SEM. Pre- til postoperative endringer innen samme gruppe ble analysert med Students avhengige t-test. Relative endringer fra preoperative verdier ble kalkulert, og en-veis-ANOVA ble brukt for å bestemme forskjell mellom gruppene, etterfulgt av Dunnets post-hoc-test. For å sammenligne repeterte målinger intraoperativt av hormoner og glukose, og for FFA-profiler, ble det brukt to-veis repeterte målinger ANOVA, multiple sammenligninger, sammen med Dunnets post-hoc test.
Forskjeller ble ansett signifikante dersom P < 0.05
3. Resultater
3.1 Basal glukose-omsetning og glukose-kinetikk under to-stegs-euglykemisk- clamp (HEC)
Pre- og postoperative verdier for EGR og WGD i basalperiodene kan sees i tabell 1. I kirurgi/
kontroll-gruppen fant vi en reduksjon av både GIR (33%, P < 0.01) og insulin-stimulert WGD (44%, P < 0.01) under HEC 2, som tydelig viser perifer insulinresistens, mens i kirurgi/
GLP-1-gruppen under HEC 2 så vi en nærmest normalisering av både den totale og den perifere insulinsensitiviteten. Verdier for EGR og WGD under HEC kan sees i tabell 2, og insulinrespons i figur 1. I narre-kirurgi/GLP-1-gruppen var GIR og WGD uforandret. Under HEC 1 (lav insulin-dose) i kirurgi/kontroll-gruppen, fant vi at insulin-stimulert suppresjon av EGR var uforandret fra preoperative verdier, men signifikant mer supprimert i kirurgi/GLP-1- gruppen (40%, P < 0.05); i tillegg var den i enda større grad supprimert i narre-kirurgi/GLP-1- gruppen (104%, P < 0.05). I HEC 2 (høy insulin-dose) var EGR mer supprimert i kirurgi/
GLP-1-gruppen (31%, P < 0.05), men vi fant ingen forskjell i EGR-suppresjon i narre-kirurgi/
GLP-1-gruppen. Til sist sammenlignet vi gruppe-forskjeller i total og perifer
insulinsensitivitet, som viste at GIR og WGD i kirurgi/kontroll-gruppen var signifikant mer redusert enn de to GLP-1-gruppene (P < 0.05, figur 2).
3.2 Insulin, glukose og regulatoriske hormoner
Intraoperative nivåer av glukose, insulin, glukagon og kortisol er vist i figur 3. I kirurgi/
kontroll-gruppen økte glukose med ~20 %, mens den var signifikant lavere i gruppene som fikk GLP-1 (P < 0.05). I kirurgi/kontroll-gruppen var insulin uforandret, mens det var en signifikant økning av insulin-nivåene i kirurgi/GLP-1-gruppen (P < 0.05). I narre-kirurgi/
GLP-1-gruppen fant vi ingen gruppe-forskjell, dog økte insulin innad i gruppen mellom 30-60 minutter etter start av GLP-1-infusjon (P < 0.05). Ser vi på kortisol, var den ikke påvirket av GLP-1, dog hadde kirurgi-gruppene høyere kortisol-nivåer enn narre-kirurgi/GLP-1-gruppen (P < 0.05). Videre, fant vi at de intraoperative nivåene av glukagon var uforandret i alle gruppene. Pre- og post-operative nivåer av insulin, glukose og glukagon under basalperioden er vist i tabell 1. Selv om det intraoperative nivået av insulin økte under GLP-1-infusjon, var nivåene like postoperative innad og mellom gruppene. I kirurgi/kontroll-gruppen fant vi også en postoperativ økning i glukagon-nivåene (3.3 ganger økning, P < 0.05), dog en lignende
endring var ikke å finne i GLP-gruppene. Insulin og glukagon var like under HEC, hvilket bekrefter stabile forhold under clamp.
3.3 Frie fettsyrer (FFA)
Konsentrasjonen av FFA i plasma var innenfor samme område i alle tre gruppene i den postoperative basale perioden (kirurgi/kontroll 285±51; kirurgi/GLP-1 295±41; narre-kirurgi/
GLP-1 178±39 µmol/L), videre så vi at konsentrasjonene var senket like mye i de tre gruppene under HEC 1 (kirurgi/kontroll 94±24; kirurgi/GLP-1 85±26; narre-kirurgi/GLP-1 114±30 µmol/L), samt HEC 2 (kirurgi/kontroll 49±45; kirurgi/GLP-1 48±23; narre-kirurgi/
GLP-1 23±10 µmol/L).
3.4 Glykogen-innhold i vev
Glykogen-innhold i vev er vist i tabell 3. Akkurat som forventet ledet kirurgi til at
glykogenlagrene i lever ble tømt (82% reduksjon i begge kirurgi-gruppene, P < 0.05), dog så vi ingen påvirkning fra GLP-1 på glykogenlagrene. De hepatiske nivåene av glykogen var lett økte under HEC i kirurgi/kontroll-gruppen (26 %, P < 0.05), med en lignende trend i kirurgi/
GLP-1-gruppen (P < 0.14). Videre fant vi ingen endringer i noen av gruppene i skjelettmuskulatur sine nivåer av glykogen, hverken i respons til kirurgi eller GLP-1.
3.5 Insulin-signalerende proteiner
Fosforylert Akt (p-Akt) og PI3K-p85 protein-ekspresjon er vist i figur 4. Som forventet fant vi at Akt-fosforylering var økt i respons til insulin-infusjon under clampene. Videre, så vi ingen effekt av GLP-1 på Akt-fosforylering. GLP-1 påvirket heller ikke PI3K-p85-ekspresjon i kirurgi/kontroll- eller kirurgi/GLP-1-gruppen, derimot så vi en signifikant økning i insulin- stimulert PI3K-p85 i narre-kirurgi/GLP-1-gruppen (P < 0.05), med en lignende trend i non- insulin-stimulert ekspresjon (P=0.06).
3.6 Hyperglykemisk clamp
Vi fant ingen forskjell i 1. fase insulin-secernering i preoperative eller postoperative clamper, i hverken kirurgi/kontroll-gruppen (172±52 vs. 129±12 µU/min/mL), kirurgi/GLP-1-gruppen (232±56 vs. 197±43 µU/min/mL) eller narre-kirurgi/GLP-1-gruppen (156±25 vs. 126±47 µU/
min/mL). Videre fant vi heller ingen forskjell mellom gruppene. GLP-1 påvirket heller ikke 2.
fase insulin-secernering. Vi fant dog høyere nivåer av sirkulerende insulin etter kirurgi i kirurgi-gruppene, men ikke i narre-kirurgi-gruppen. Mest sannsynlig forårsaket av reduksjon av insulin-clearance i den umiddelbare postoperative fasen hos griser.
3.7 Cytokiner
Vi fant at IFNα var signifikant redusert sammenlignet med preoperative målinger i kirurgi/
GLP-1-gruppen (1.74±0.87 vs. 0.64±0.36 pg/mL, P < 0.05), mens nivået var uforandret i kirurgi/kontroll-gruppen (0.97±0.55 vs. 0.98±0.78 pg/mL) og narre-kirurgi/GLP-1-gruppen (0.47±0.20 vs. 0.43±0.24 pg/mL). Vi fant en postoperativ økning i IL-6, men som kun var målbar i halvparten av grisene som undergikk kirurgi, videre var det ingen forskjell mellom gruppene. Vi fant ingen forskjell i IL-12-nivåer innad eller mellom gruppene. TNFα, IL-10, IL-4, IL1β og IFNγ var ikke målbare i noen av gruppene.
4. Diskusjon
I studien viser vi at ved abdominal chirurgia major, forbedres perifer og hepatisk
insulinsensitivitet ved en perioperativ infusjon av GLP-1, uavhengig av IRS1-PI3K-Akt- pathway, i den umiddelbare fasen etter inngrepet.
Hyperglykemi hos kritisk syke er assosiert med økt mortalitet, og insulinbehandling reduserer den³. Forbedring av glykemisk kontroll hos kirurgiske pasienter reduserer
postoperativ insulinresistens²³ og intraoperativ insulinresistens fører til markant økt forekomst av alvorlige komplikasjoner¹ ². Studier på inkretinbehandlede kritisk syke pasienter på
intensivavdelinger har vist gode resultater i å redusere hyperglykemi 97⁹³ 98, også hos kirurgisk pasienter . En av baksidene med blant annet sistenevnte studium er at man kun evaluerte 99 glykemisk kontroll, og ikke anvendte HEC for å si noe om perifer og hepatisk
insulinsensitivitet.
Initialt har det vært tenkt at GLP-1 kun kan øke WGD ved en insulinavhengig mekanisme 100⁷², og studier på depancreatiserte hunder viste økt insulinstimulert glukoseopptak . Når man co-infunderte somatotropin release-inhibiting factor for å 101
supprimere GLP-1 sin effekt på insulin og og glukagon, fant man således ingen endring i WGD⁷³. Prigeon et al. har på den andre side vist at fastende glukose-nivåer og EGR ble redusert med ∼ 20 % når man infunderte en høy dose GLP-1 (med supprimering av endokrin pancreas) over 60 minutter, av metodologiske årsaker kunne man i den studien ikke
konkludere fullstendig om effekten var økt WGD, redusert EGR eller begge⁷⁰. Andres studier har sett økt WGD også uavhengig av insulin⁷⁵ ⁷⁶ og det er foreslått direkte effekter på
myocytter og glukoseopptak uavhengig av pancreas⁷⁷ ⁷⁸ ⁷⁹. Uansett, HEC-studier viser en effekt på perifert glukoseopptak hos individer med preeksisterende redusert insulinsensitivitet som ved DM-II, overvekt eller traumer, når man supprimerer endokrin pancreas⁸⁴ ⁸⁸. Meneilly et al. viste en ∼ 15 % økning i WGD hos diabetikere ved infusjon av GLP-1, uavhengig av insulin , og tilsvarende studier som ikke har vist dette er kritisert for å ha clampet på for 102 høye insulinkonsentrasjoner, hatt for lave glukosenivåer og/eller for lav dose GLP-1.
I kirurgi/kontroll-gruppen ble glukose-infusjonsraten redusert med 33 % og
insulinstimulert perifert glukoseopptak (WGD) med 44 %, som ikke overraskende indikerte dramatisk tapt insulinsensitivitet ved kirurgi. Mens grisene behandlet med GLP-1-infusjon nærmest normaliserte det perifere opptaket av glukose og den totale insulinfølsomheten.
Under HEC-2 (høy insulin) så man ingen effekt på WGD eller GIR i kontroll/GLP-1-gruppen, som sammenfaller med studier som heller ikke viser noen effekt av GLP-1 på studiesubjekter med ukompromittert insulinsensitivitet. Det er antatt at GLP-1 sin effekt på WGD er en direkte virkning på glukoseopptak og økt glykogenlagring i myocytter via IR1-PI3-Akt- pathway, som man har sett på i in vitro-studier av GLP-1-reseptoren fra knock-out-mus, men som diskutert har man i in vivo-studier ikke funnet økt glykogenlagring eller effekter av GLP-1 på friske individer . Vi fant at også at operativt traume tømmer glykogenlagrene i 103 lever som tidligere etablert , men vi så ingen økt lagring av glykogen i muskulatur i kirurgi/104 GLP-1-gruppen. Videre, så vi økt Akt-fosforylering under insulinstimulering som forventet, men ingen effekt på Akt ved GLP-1-infusjon. Det var heller ingen påvirkning av PI3K p85- ekspressjon i hverken kirurgi/kontroll- eller kirurgi/GLP-1-gruppen. Våre resultater gir derfor ikke støtte til at GLP-1 via en direkte effekt på myocytter øker perifert glukoseopptak,
hverken via økt ekspresjon og aktivitet av «insulin signaling pathway» eller økt
glykogenlagring, men antagelig via andre hittil ukjente mekanismer for glukoseopptak og glukosemetabolisme. Som et addendum kan nevnes at vi fant signifikant økning av
insulinstimulert PI3K-p85-ekspresjon i narrekirurgi/GLP-1-gruppen, som antyder en mulig direkte effekt av GLP-1 på «insulin signaling pathway», uten at det virker å kunne forklare forbedret WGD.
Som diskutert i avsnitt 1.3.1 er det vist at GLP-1 kan redusere EGR uavhengig av pancreatisk hormonutskillelse⁷⁰ ⁷¹, mens andre studier konkluderer med det motsatte ⁷² ⁷⁴ ¹⁰⁰. Motstridende resultater kan tenkes å skyldes at det har vært clampet med for høye
insulinkonsentrasjoner, og dermed maskert en hepatisk effekt på grunn av total suppresjon av EGR. Dette kan løses ved å utføre to-stegs-HEC slik vår gruppe gjorde. Og ikke overraskende var forskjellen i EGR i narrekirurgi/GLP-1-gruppen kun synlig ved HEC 1 (lav insulin), hvor det var signifikant suppresjon av EGR i kirugi/GLP-1-gruppen, og ytterligere suppresjon i narrekirurgi/GLP-1-gruppen. Glukagon-nivåene var moderat økte postoperativt, og ble normalisert av GLP-1-behandling, hvilket kan forklare at EGR ble supprimert i kirurgi/
GLP-1-gruppen, men da det ikke var noen endringer i glukagon-nivåer i narrekirurgi/GLP-1- gruppen samtidig med at suppresjon av EGR var i større grad enn i narrekirurgi/GLP-1- gruppen, taler for en mulig direkte effekt av GLP-1 på leveren uavhengig av endokrin pancreas.
Insulinnivåene var signifikant økte i kirurgi/GLP-1-gruppen, og forbedret glykemisk kontroll i GLP-1-behandlede griser må sannsynligvis tilskrives dette. Som tidligere diskutert forbedrer GLP-1 mikrosirkulasjonen⁸⁴, hvilket kan være en del av forklaringen på forbedret glykemisk kontroll da man vil oppnå et større perifert muskelareal for opptak. Som vist hos Blixt et al. forbedrer glykemisk kontroll i seg selv insulinsensitiviteten, hvilket også kan være en mulig mekanisme i våre resultater.
Inflammasjon er vist å kunne indusere insulinresistens ved at cytokiner som TNF-α og IL-1β virker på «insulin signaling pathway», eller ved å øke lipolytisk aktivitet og FFA i blod⁴⁵ ⁴⁶ ⁴⁷ ⁵⁷. Videre er også GLP-1 vist å kunne redusere inflammasjon og oksidativt stress⁸⁵. Vi fant ingen store reduksjoner i cytokin-nivåene, med unntak av en lett reduksjon i nivåer av IFNα i kirurgi/GLP-1-gruppen. Dette kan tolkes som en mulig effekt på inflammasjon i en operativ populasjon, men det er ikke entydige nok resultater til å konkludere med noe. Det har vært diskutert om GLP-1 kan modulere sirkulerende FFA og dermed motvirke
insulinresistens, men vi fant ingen effekt av GLP-1 på FFA, støttet av et annet studium som
heller ikke kunne vise noen effekt . Det er heller ingen klar konsensus av hvilke nivåer 105 sirkulerende FFA har i postoperativ fase og videre studier på postoperativ lipidmetabolisme er ønskelig.
5. Konklusjon
Oppsummert viser studien vår at en intraoperativ infusjon av GLP-1 nærmest normaliserer postoperativ perifer insulinresistens uavhengig av insulin, samt forbedrer glykemisk kontroll, ved en insulinuavhengig mekanisme. Vi fant ikke støtte for at det foregår via regulering av IRS1-PI3K-Akt-pathway eller økt glykogenlagring i muskulatur eller lever. Resultatene taler for at behandling med GLP-1 er favorabelt og potensielt kan redusere varighet av innleggelse, morbiditet og mortalitet hos operative pasienter, uten risiko for hypoglykemi. Ytterligere studier er behøvd for å utforske GLP-1 sine virkningsmekanismer, outcome, samt humane kliniske studier som ser på hvordan insulinsensitiviteten påvirkes i et lengre postoperativt perspektiv.
6. Referanser
Kotagal M, Symons RG, Hirsch IB, Umpierrez GE, Dellinger EP, Farrokhi ET, et al. Perioperative
1
hyperglycemia and risk of adverse events among patients with and without diabetes. Ann Surg.
2015;261(1):97–103
Sato H, Carvalho G, Sato T, Lattermann R, Matsukawa T, Schricker T. The association of
2
preoperative glycemic control, intraoperative insulin sensitivity, and outcomes after cardiac surgery. J Clin Endocrinol Metab. 2010 Sep;95(9):4338–44
van den Berghe G, Wouters P, Weekers F, Verwaest C, Bruyninckx F, Schetz M, et al. Intensive
3
insulin therapy in critically ill patients. N Engl J Med. 2001;345(19):1359–67
Ljungqvist O, Nygren J, Soop M, Thorell A. Metabolic perioperative management: novel concepts.
4
Curr Opin Crit Care. 2005; 11(4):295–99
Thorell A, Nygren J, Ljungqvist O, Insulin resistance: a marker of surgical stress. Curr Opin Clin
5
Nutr Metab Care 1999; 2(1):69-78
Finfer S, Chittock DR, Su SYS et al., Intensive versus conventional glucose control in critically ill
6
patients. N Engl J Med 2009; 360:1283-1297
Egi M, Bellomo R, Stachowski E, French CJ, Hart GK, Taori G, Hegarty C, Bailey M:
7
Hypoglycemia and outcome in critically ill patients. Mayo Clin Proc 2010, 85:217–24 Reynoso A, Présence du sucre Dans les urines. Seanc Soc Biol 1853; 1-40
8
Bernard C. Leçons sur le diabete et la glycogénèse animale. Baillère Paris 1877; 210
9
Cuthbertson DP, Observations on the disturbance of metabolisme produced by injury to the limbs. Q
10
J Med 1932; 1:233-46
Black PR, Brooks DC, Bessey PQ, Wolfe RR, Wilmore DW. Mechanisms of insulin resistance
11
following injury. Ann Surg 1982; 196:420-35
Little RA, Henderson A, Frayn KN, Galasko CSB, White RH. The disposal of intravenous glucose
12
studied using glucose and insulin clamp techniques in sepsis and trauma in man. Acta Anaest Belg 1987; 38:275-79
Thomsen V. Studies in trauma and carbohydrate metabolism with special reference to the existence
13
of traumatic diabetes. Acta Med Scand. 1938;96(Suppl; 91): 1-416
Williams JL, Dick GF. Decreased dextrose tolerance in acute infectious disease. Arch Intern Med
14
1932; 50:801-818
Thorell A, Loftenius A, Andersson B et al., Postoperative insulin resistance and circulating
15
concentrations of stress hormones and cytokines. Clin Nutr 1996; 15:75-79
Thorell A Efendic S, Gutniak M et al., Insulin resistance after abdominal surgery. Br J Surg 1994;
16
81:59-63
Nygren J, Soop M, Thorell A et al., Preoperative oral carbohydrate administration reduces
17
postoperative insulin resistance. Clin Nutr 1998; 17:65-71
Soop M, Nygren J, Thorell A et al., Preoperative oral carbohydrate treatment attenuates endogenous
18
glucose release 3 days after surgery. Clin Nutr 2004; 23:733-41
Furnary AP, Zerr KJ, Grunkemeier GL, Starr A. Continuous intravenous insulin infusion reduces the
19
incidence of deep sternal wound infection in diabetic patients after cardiac surgical procedures. Ann Thorac Surg 1999; 67(2):352-60
van den Berghe G, Wouters P, Weekers F, Verwaest C, Bruyninckx F, Schetz M, et al. Intensive
20
insulin therapy in critically ill patients. N Engl J Med. 2001;345(19):1359–67
Umpierrez GE, Isaacs SD, Bazargan N, You X, Thaler LM, Kitabchi AE. Hyperglycemia: an
21
independent marker of in-hospital mortality in patients with undiagnosed diabetes. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87(3):978-82
Sato H, Carvalho G, Sato T et al., The association of preoperative glycemic control, intraoperative
22
insulin sensitivity, and outcomes after cardiac surgery. J Clin Endocrinol Metab 2010; 95:4338-4344 Blixt C, Ahlstedt C, Ljungqvist O et al., The effect of perioperative glucose Control on
23
postoperative insulin resistance. Clin Nutr 2012; 31:676-681
Desborough JP, The stress response to trauma and surgery. Br J Anaesth 2000;85:109-117
24
Dimitriadis G, Leighton B, Parry-Billings M, Sasson S, Young M, Krause U et al., Effects of
25
glucocorticoid excess on the sensitivity of glucose transport and metabolism to insulin in rat skeletal muscle. Biochem J 1997;321:707–12
Wilcox G, Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 2005; 26(2): 19–39
26
Wang ZG, Wang Q, Wang WJ et al., Randomized clinical trial to compare the effects of preoperative
27
oral carbohydrate versus placebo on insulin resistance after colorectal surgery. Br J Surg 2010;
97:317-327
Witasp A, Nordfors L, Schalling M et al., Increased expression of inflammatory pathway genes in
28
skeletal muscle during surgery. Clin Nutr 2009; 28:291-298
Valko M, Leibfritz D, and Moncol J, Free radicals and antioxidants in normal physiological
29
functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39:44-84
Evans J, Goldfine I, Maddux B et al., Oxidative Stress and Stress-Activated Signaling Pathways: A
30
Unifying Hypothesis of Type 2 Diabetes. Endocr Rev 2002;23:599-622
Evans J, Maddux B, and Goldfine I, The molecular basis for oxidative stress-induced insulin
31
resistance. Antioxid Redox Signal 2005; 7:1040-1052
Murrow BA and Hoehn KL, Mitochondrial regulation of insulin action. Int J Biochem Cell Biol
32
2010: 42:1936-1999
Cheng Z, Tseng Y and White MF, Insulin signaling meets mitochondria in metabolism. Trends
33
Endocrinol Metab 2010; 21:1-10
Chang YC and Chuang LM, The role of oxidative stress in the pathogenesis of type 2 diabetes: from
34
molecular mechanism to clinical implication. Am J Transl Res 2010;2:316-331
Rains J and Jain S, Oxidative stress, insulin signaling, and diabetes. Free Radic Biol Med 2011;
35
50:567-575
Szendroedi J, Phielix E and Roden M, The role of mitochondria in insulin resistance and type 2
36
diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol 2012;8:92-103
Wieland OH, The mammalian pyruvat dehydrogenase complex: structure and regulation. Rev
37
Physiol Biochem Pharmacol 1983;96:123-170
Rosa G, Di Rocco P, Manco M et al., Reduced PDK4 expression associates with increased insulin
38
sensitivity in postobese patients. Obes Res 2003;11:176-82
Wu P, Peters JM, Harris RA, Adaptive increase in pyruvate dehydrogenase kinase 4 during
39
starvation is mediated by peroxisome proliferator-activated receptor alpha. Biochem Biophys Res Commun 2001;287:391-96
Constantin D, Constantin-Teodosiu D, Layfield R et al., PPARdelta agonism induces a change in
40
fuel metabolism and activation of an atrophy programme, but does not impair mitochondrial function in rat skeletal muscle. J Physiol 2007; 583:381-90
Degenhardt T, Saramäki A, Malinen M et al., Three members of the human pyruvate dehydrogenase
41
kinase gene family are direct targets of the peroxisome proliferator-activated receptor βδ. J Mol Biol 2007; 372:341-55
Abbot E, McCormak J, Reynet C et al., Diverging regulation of pyruvate dehydrogenase kinase
42
isoform gene expression in cultured human muscle cells. FEBS J 2005;272:3004-3014
Furuyama T, Kitayama K, Yamashita H et al., Forkead transcription factor FOXO1 (FKHR)-
43
dependent induction of PDK4 gene expression in skeletal muscle during energy deprivation. Biochem J 2003;375:365-71
Connaughton S, Chowdhury F, Attia RR et al., Regulation of pyruvate dehydrogenase kinase
44
isoform 4 (PDK4) gene expression by glucocorticoids and insulin. Mol Cell Endocrinol 2010;315:159-67
Boden G. Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resistance and NIDDM. Diabetes.
45
1997;46:3–10
Kelley DE, Mokan M, Simoneau JA, Mandarino LJ. Interaction between glucose and free fatty acid
46
metabolism in human skeletal muscle. J Clin Invest 1993;92:91–98
Roden M, Price TB, Perseghin G, Petersen KF, Rothman DL, Cline GW, Shulman GI. Mechanism
47
of free fatty acid-induced insulin resistance in humans. J Clin Invest 1996;97:2859–2865
Randle PJ, Garland PB, Hales CN, Newsholme EA. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin
48
sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet 1963;1:785–789
Dresner A, Laurent D, Marcucci M, Griffin ME, Dufour S, Cline GW, et al., Effects of free fatty
49
acids on glucose transport and IRS-1-associated phosphatidylinositol 3-kinase activity. J Clin Invest 1999;103:253–59
Savage DB, Petersen KF, and Schulman GI, Disordered Lipid Metabolism and the Pathogenesis of
50
Insulin Resistance. Physiol Rev 2007; 87:507-520
Soop M, Nygren J, Myrenfors P et al., Preoperative oral carbohydrate treatment attenuates
51
immediate postoperative insulin resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001;280:E576-E583 Martini W, Irtun O, Chinkes D et al., Alteration of hepatic fatty acid metabolism after burn injury in
52
pigs. J Parenter Enter Nutr 2001;25:310-316
Ebstein W. Zur therapie des Diabetes mellitus, insbesondere über die Anwendung des salicylsauren
53
Natron bei demselben. Berliner Klinische Wochenschrift 1876;13:337–340
Reid J, Macdougall AI, Andrews MM, On the efficacy of salicylate in treating diabetes mellitus. Br
54
Med J 1957;2:1071–1074
Shenkin A, Fraser WD, Series J et al., The serum interleukin 6 response to elective surgery.
55
Lymphokine Res 1989; 8:123-127
Hotamisligil GS, Shargill NS, Spiegelman BM, Adipose expression of tumor necrosis factor-α:
56
direct role in obesity-linked insulin resistance. Science 1993;259:87–91
Shoelson SE, Lee J, and Goldfine AB, Inflammation and insulin resistance. Diabetes
57
2006;116:1793-1801
Nygren J, The metabolic effects of fasting and surgery. Best Pract Res Clin Anaesthesiol 2006;20
58
(3)429- 438
Lassen K, Soop M, Nygren J, Cox BW, Hendry PO, Spies C, et al. Consensus review of optimal
59
perioperative care in colorectal surgery. Arch Surg. 2009;144(10):961–9
Brady M, Kinn S, Stuart P, Preoperative fasting for adults to prevent perioperative
60
complications. Cochrane Database Syst Rev 2003; (4)
Hausel J, Nygren J, Lagerkranser M et al., A carbohydrate-rich drink reduces preoperative
61
discomfort in elective surgery patients. Anesth Analg 2001;93(5):1344-1350
Gjessing PF, Constantin-Teodosiu D, Hagve M et al., Preoperative carbohydrate supplementation
62
attenuates post-surgery insulin resistance via reduced inflammatory inhibition of the insulin-mediated restraint on muscle pyruvate dehydrogenase kinase 4 expression. Clin Nutr 2015; 86:1177-1183
