Escitalopram og venlafaksin reduserer viabilitet og
GluN2B-uttrykk
Studier i PC12-, SH-SY5Y-celler og kyllingembryo
Ingliv Gjetmundsen
Masteroppgave i farmasi 45 studiepoeng Farmasøytisk Institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet
UNIVERSITETET I OSLO
Veiledere:
Professor Ragnhild Elisabeth Paulsen, Seksjon for farmakologi og farmasøytisk biovitenskap, Universitetet i Oslo
Stipendiat Denis Zosen, Seksjon for farmakologi og farmasøytisk biovitenskap, Universitetet i Oslo
Post doc Dhaksshaginy Rajalingam, Seksjon for farmakologi og farmasøytisk biovitenskap,
© Ingliv Gjetmundsen Mai 2021
Escitalopram og venlafaksin reduserer viabilitet og GluN2B-uttrykk Studier i PC12-, SH-SY5Y-celler og kyllingembryo
Ingliv Gjetmundsen http://www.duo.uio.no/
Forord
Arbeidet med masteroppgaven ble gjennomført i perioden august 2020 til mai 2021 ved Seksjon for farmakologi og farmasøytisk biovitenskap, Farmasøytisk Institutt, Universitetet i Oslo. Masteroppgaven er et prosjekt innen forskningsgruppen PharmaTox der målet er å øke kunnskapen om legemidlers effekt på human nevrotoksisitet og nevroutvikling.
En stor takk rettes til mine dyktige veiledere, Professor Ragnhild Elisabeth Paulsen, Stipendiat Denis Zosen og post doc Dhaksshaginy Rajalingam. Takk for god veiledning, konstruktive tilbakemeldinger og oppmuntring! Dere tar dere alltid god tid til å dele kunnskap og diskutere fag. Takk for all tiden du har brukt med meg på lab, Denis. Dhaksshaginy og Ragnhild, særlig takk for tett oppfølging under hele skriveprosessen.
Jeg vil takke resten av forskningsgruppen og alle på ZEB for all hjelp, oppmuntring og et hyggelig sosialt miljø. En særlig takk går til avdelingsingeniør Mona Gaarder og Stipendiat Nils Anders Labba for god opplæring og hjelp på lab. Takk for at dere alltid tar dere god tid til å svare på spørsmål. Jeg vil også takke Sigrid Bjørnstad ved Oslo Universitetssykehus for tillaging av histologiske snitt.
Oda Kristine Sølsnæs Rosseland, du er den beste labpartneren jeg kunne hatt! Takk for alle de gode samtalene på laben og kontoret det siste året. Du har virkelig vært et lyspunkt gjennom hele mastertiden! Takk til resten av gjengen for å ha hjulpet meg gjennom fem lange og fine år!
Og til slutt vil jeg takke den store familien min og min kjære Fredrik. Takk for at dere viser interesse for det jeg driver med og gjør en innsats for å prøve og skjønne det. Dere har støttet og motivert meg gjennom hele prosessen. En ekstra takk går til min bror Gunstein som fikk meg til å søke på farmasistudiet. Uten deg hadde jeg ikke vært der jeg er nå.
Oslo, mai 2021
Ingliv Gjetmundsen
Sammendrag
Hvert år fødes det ca. 900 barn i Norge som har blitt eksponert for antidepressiva under fosterutviklingen. Escitalopram og venlafaksin er eksempler på legemidler innen henholdsvis selektive serotoninreopptakshemmere (SSRI) og selektive serotonin- og
noradrenalinreopptakshemmere (SNRI), som er de hyppigst brukte antidepressive
legemiddelgruppene blant gravide. Det er stor mangel på studier av legemiddelbehandling på gravide. På bakgrunn av dette ble det ønsket å se på effekten av escitalopram og venlafaksin under nevroutviklingen.
For å kunne undersøke effekten av escitalopram og venlafaksin ble det utført viabilitetsstudier i PC12-, SH-SY5Y- og kyllingkornceller (cCGN) I tillegg ble det utført kalsiuminfluksstudier på cCGN. Eksponeringene ble utført in vitro. Genekspresjonsanalyser av viktige nevronale utviklingsmarkører knyttet til celleproliferasjon (PCNA), differensiering (Pax-6 og GluN2B) og apoptose (Bcl-2 og Bcl-XL) ble utført på lillehjerner og forhjerner hos in ovo eksponerte kyllingembryo. Lillehjernene ble også undersøkt histologisk for endringer i struktur.
Det ble vist at de høyeste dosene av escitalopram reduserer celleviabilitet i cCGN. Ingen endring ble sett for venlafaksin. SH-SY5Y-celler viste større sensitivitet for legemidlene enn PC12-celler, og det ble sett en liten reduksjon i celleviabilitet på både differensierte og udifferensierte celler. Escitalopram og venlafaksin førte til et signifikant redusert uttrykk av GluN2B, en subehenhet i N-metyl-D-aspertat-reseptoren (NMDAR), ved eksponering in ovo.
NMDAR har en kritisk rolle innen differensiering, migrasjon og apoptose. Påvirkning på NMDARs funksjon ble studert ved kalsiuminfluks-analyse i cCGN in vitro og viste ingen signifikante endringer. Ved histologiske undersøkelser ble det ikke sett noen endringer i lillehjernens struktur, cellemigrasjon, apoptotiske eller mitotiske celler.
Funnene i denne oppgaven viste at eksponering for escitalopram og venlafaksin bidrar til en signifikant reduksjon av GluN2B uttrykk i lillehjernen. Likevel observerte man at denne reduksjonen ikke påvirket hjernemorfologien under utvikling ved undersøkelser på embryonaldag 17. Videre studier for å verifisere funnene og undersøke om strukturelle endringer skjer på et senere tidspunkt er nødvendig. Det bør også foretas undersøkelser på legemidlenes påvirkning på kalsiuminfluks ved eksponering in ovo, og videre studier for å
Forkortelser
A Ampere
AARS Anti-Adherence Rinsing Solution
Ad Opp til
ADHD Hyperkinetisk forstyrrelse (Attention Deficit/Hyperactivity Disorder)
ANOVA Variansanalyse
BCA Bicinkoninsyre
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
Bcl-XL B-cell lymphoma extra large
BME Basal Medium Eagle
BSA Bovint serumalbumin
CAM Chorionallantoishinnen
cCGN Kyllingkornceller
CGN Kornceller
Cmax Maksimal konsentrasjon
CNS Sentralnervesystemet
CSV Cerebrospinalvæsken
dH2O Destillert vann
DIV Dag in vivo
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO Dimetylsulfoksid
DNA Deoksyribonukleinsyre
DNase Deoksyribonuklease
E Embryonaldag
EDTA Etylendiamintetraeddiksyre
EGL Ytre germinallag (external germinal layer)
EtOH Etanol
FDA Food and Drug Administration
FOTS Forsøksdyrsforvaltningens tilsyns- og søknadssystem
Fura-2 AM Fura-2-acetoksymetylester
H&E Hematoksylin og eosin
HCl Hydrogenklorid
IGL Indre granulærlag
Ki-67 (MKI67) Marker of proliferation Ki-67
MK-801 Dizocilipin
ML Molekylærlaget
MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid)
MQ Milli Q
nAChR Nikotinerge acetylkolinreseptorer
NADH Nikotinamid adenin dinukleotid + hydrogen
NGF Nervekstfaktor
NMDA N-metyl-D-aspertat
NMDAR N-metyl-D-aspertat-reseptor
Pax-6 Paired box 6
PBS Fosfatbufret saltvann
PCL Purkinjecellelaget
PC12 Pheochromocytoma Cell Line 12
PCNA Proliferating cell nuclear antigen
PLL Poly-L-lysin
PI Propidiumjodid
RA Retinsyre
Rpm Omdreininger per minutt (rounds per minute)
RT Romtemperatur
SD Standardavvik
SDS Natrium dodecylsulfat
SEM Standardavvik av gjennomsnitt
SNRI Selektive serotonin- og noradrenalinreopptakshemmere
SSRI Selektive serotoninreopptakshemmere
TBS Trisbufret saltvann
TBST 1x TBS med 0,1 % Tween 20
Tris Trishydroksymetylaminometan
Tween Polyoksyetylen-sorbitan-monolaurat
V Volt
Innholdsfortegnelse
FORORD ... V SAMMENDRAG ... VII FORKORTELSER ... IX
1. INNLEDNING ... 1
1.1ANTIDEPRESSIVA ... 1
1.1.1 Escitalopram ... 1
1.1.2 Venlafaksin ... 3
1.2ANTIDEPRESSIVA OG GRAVIDITET ... 3
1.3NERVESYSTEMETS UTVIKLING ... 4
1.3.1 Lillehjernen ... 5
1.3.2 Proliferasjon ... 7
1.3.3 Differensiering ... 7
1.3.4 Apoptose ... 8
1.4VALG AV MODELLSYSTEM ... 8
1.4.1 Kyllingmodellen ... 8
1.4.2 PC12-cellelinje som modellsystem ... 9
1.4.3 SH-SY5Y-cellelinje som modellsystem ... 10
1.5HENSIKT MED STUDIEN ... 12
2. MATERIALER OG METODER ... 13
2.1PRODUKT- OG UTSTYRSLISTE ... 13
2.2PC12-CELLER OG SH-SY5Y-CELLER ... 18
2.3KYLLINGEMBRYO ... 18
2.3.1 Injisering av eggene ... 18
2.3.2 Preparering av hjernevev for Western blot ... 19
2.3.3 Preparering av korncellekultur for eksponering in vitro ... 19
2.4VIABILITETSSTUDIER MED MTT ... 19
2.5VIABILITETSSTUDIER MED REZASURIN ... 20
2.6DNA-KVANTIFISERING MED HOECHST 33342 ... 20
2.7CELLEDØDSSTUDIER MED PROPIDIUMJODID ... 20
2.8KALSIUMINFLUKS MED FURA-2AM ... 21
2.9WESTERN BLOT ... 21
2.9.1 Tillaging av prøver til Western blot ... 21
2.9.2 Proteinmåling med BCA proteinanalyse ... 21
2.9.3 SDS-polyakrylamidgelelektroforese ... 22
2.9.4 Gelelektroforese ... 22
2.9.5 Blotting av gel ... 22
2.9.6 Ponceaufarging og blokking av membran ... 23
2.9.7 Tilsetting av primære og sekundære antistoffer og fremkalling av membran ... 23
2.9.8 Stripping av membran ... 23
2.10HISTOLOGI ... 23
2.11STATISTISKE METODER ... 24
3. RESULTATER ... 25
3.1VIABILITET ... 25
3.1.1 Udifferensierte PC12-celler med MTT-analyse ... 25
3.1.2 Udifferensierte PC12-celler med resazurin-analyse ... 27
3.1.6 Differensierte SH-SY5Y-celler med resazurin-analyse ... 35
3.1.7 Aggregerte SH-SY5Y-celler med resazurin-analyse ... 37
3.1.8 Kyllingkorncellekultur med MTT-analyse ... 38
3.1.9 Kyllingkorncellekulturer med resazurin-analyse ... 40
3.1.10 DNA-kvantifisering i kornceller med Hoechst ... 42
3.2KALSIUMINFLUKS MED FURA-2AM ... 45
3.3WESTERN BLOT ... 47
3.3.1 Referanseprotein ... 47
3.3.2 Proteinmarkører for proliferasjon ... 48
3.3.3 Apoptotiske markører ... 50
3.3.4 Proteinmarkører for differensiering ... 54
3.4HISTOLOGI ... 57
3.4.1 Egg injisert på E13 ... 58
3.4.2 Egg injisert på E13 og E16 ... 60
4. DISKUSJON ... 62
4.1DISKUSJON AV METODEVALG ... 62
4.1.1 Modellsystemer ... 62
4.1.2 Målinger av viabilitet og celledød ... 65
4.1.3 Kalsiuminfluks ... 67
4.1.4 Western blot-analyser ... 68
4.1.5 Histologi ... 69
4.2DISKUSJON AV BIOLOGISKE FUNN ... 69
4.2.1 Ingen endringer sett i apoptose- eller mitoseprofiler ... 69
4.2.2 Nedregulering av GluN2B i lillehjerne ... 70
4.3VEIEN VIDERE ... 74
5. KONKLUSJON ... 75
6. LITTERATURLISTE ... 76
7. APPENDIKS A – OPPSKRIFTER ... 83
8. APPENDIKS B – PROTOKOLLER ... 89
8.1SPLITTING AV PC12-CELLER TIL NY PASSASJE ... 89
8.2SPLITTING AV PC12-CELLER TIL SKÅLER OG BRETT ... 89
8.3SPLITTING AV SH-SY5Y-CELLER TIL NY PASSASJE ... 90
8.4SPLITTING AV SH-SY5Y-CELLER TIL SKÅLER OG BRETT ... 90
8.5TILLAGING AV AGGREGERTE SH-SY5Y-CELLER ... 90
8.6INJISERING AV EGGENE ... 91
8.7KYLLINGPREPARERING FOR WESTERN BLOT ... 91
8.8PREPARERING AV KYLLINGKORNCELLESUSPENSJON FOR EKSPONERING AV LEGEMIDLER IN VITRO ... 92
8.9VIABILITETSSTUDIER MED MTT ... 93
8.10VIABILITETSSTUDIER MED REZASURIN ... 93
8.11DNA-KVANTIFISERING MED HOECHST 33342 ... 94
8.12CELLEDØDSSTUDIER MED PROPIDIUMJODID ... 94
8.13KALSIUMINFLUKS ... 94
8.14WESTERN BLOT ... 95
8.14.1 Tillaging av prøver til Western blot ... 95
8.14.2 Proteinmåling ... 95
8.14.3 SDS-polyakrylamidgelelektroforese ... 96
8.14.4 Gelelektroforese ... 96
8.14.5 Blotting av gel ... 96
8.14.6 Ponceaufarging og blokking av membran ... 97
8.14.7 Tilsetting av primære og sekundære antistoffer ... 97
8.14.8 Stripping av membran ... 98
8.15HISTOLOGI ... 98
1. Innledning
I 2012 ble det født 213 millioner barn globalt. I USA beregnes det at omtrent 50 % av gravide benytter seg av reseptbelagte legemidler (1). Før legemidler slippes ut på markedet
gjennomgår de prekliniske og kliniske studier (2). Til tross for at det er anerkjent at gravide kvinner er underrepresentert i kliniske studier og det oppfordres til endring, fortsetter ekskluderingen i de fleste studier (3). Dette skyldes at gravide kvinner regnes som en sårbar gruppe. Fysiologien endres under graviditet og skaper utfordringer når det kommer til dosering og effekt. Studiene kan utgjøre en risiko for både mor og foster. Manglende
kunnskap og erfaring på dette fører til at kliniske studier på gravide kvinner regnes som etisk betenkelig (3). En studie i USA viste at 91 % av legemidlene på markedet manglet adekvat data om sikkerhet og effekt på gravide kvinner (3). Dokumentasjon på sikkerhet og effekt av legemiddelbehandling av gravide baseres dermed på prekliniske studier og
observasjonsstudier av eksponerte barn (4). Behovet for flere studier på legemiddelbruk i gravide er stort.
1.1 Antidepressiva
Mekanismene bak depresjon er ikke fullstendig kartlagt. En av hypotesene for å beskrive patofysiologien er monoaminhypotesen. Den går ut på at det er mangel på en eller flere av monoaminene dopamin, serotonin og noradrenalin (5). Virkningsmekanismen for
antidepressiva går ut på å stimulere monoaminers funksjon. De ulike gruppene av
antidepressiva virker på ulike monoaminer, og det kan derfor være hensiktsmessig å bytte gruppe om det valgte legemidlet ikke gir tilfredsstillende effekt. Antidepressiva kan deles grovt inn i tre grupper: monoaminreopptakshemmere, monoaminoksidasehemmere og monoaminreseptorantagonister, med monoaminspesifikke undergrupper (6).
Reseptorantagonist vil si at legemidlet bindes til reseptoren og hemmer den cellefysiologiske prosessen (7). Selektiv serotoninreopptakshemmer (SSRI) og selektiv serotonin- og
noradrenalinreopptakshemmer (SNRI) hører til hovedgruppen monoaminreopptakshemmere.
1.1.1 Escitalopram
Escitalopram tilhører legemiddelgruppen SSRI og brukes mot angst, depresjon, obsessiv- kompulsiv lidelse og panikklidelse. I Norge selges det under preparatnavnet Cipralex i tillegg til generiske legemidler (8). Escitalopram er den terapeutisk aktive S-enantiomeren fra RS-
behandling for moderate til alvorlige depressive lidelser. Escitalopram har to bindingsseter på serotonintransportøren (SERT). Escitalopram har høy affinitet til hovedbindingssetet på SERT lik andre SSRI, men bindes i tillegg til et annet, allosterisk sete. Denne bindingen antas å stabilisere og forlenge legemiddelbindingen (9). SERT er ansvarlig for serotononinreopptak i terminalene og cellekroppene til serotonerge nevroner som vist i figur 1.1. Escitalopram hemmer SERT og dermed også reopptaket av serotonin. Hemmingen fører til at et høyere nivå av serotonin tilgjengelig for reseptorer (10). Det finnes også serotonin- og
noradrenalinreseptorer presynaptisk (11).
Det terapeutiske vinduet er i følge det medisinske labratoriet Fürst 0,02-0,12 µM (12).
Escitalopram metaboliseres i lever via cytokrom p450 (CYP)-enzymene 2C19, 3A4 og 2D6.
Hovedmetabolitten er S-desmetylcitalopram som metaboliseres videre til S- didesmetylcitalopram (9). Det varierer i kilder om metabolittene blir ansett som
farmakologisk aktive eller ikke. Dette kan skyldes at det er usannsynlig at de bidrar til klinisk effekt da det er vist lave konsentrasjoner in vivo og hemmingen av serotoninreopptak er svak in vitro (13).
Figur 1.1 Reopptak av serotonin og noradrenalin.
Figuren viser hvordan serotonin (5-HT) og noradrenalin frislippes presynaptisk og deretter bindes til
reseptorer for serotonin og noradrenalin postsynaptisk. Det er transportører for reopptak av både noradrenalin og serotonin i synapsen. Figuren er hentet fra (14).
1.1.2 Venlafaksin
Venlafaksin er en SNRI brukt til behandling av depresjon, angst og panikklidelse. I Norge selges det under preparatnavnene Efexor, Venlazid og Venorion i tillegg til generiske legemidler (15). Venlafaksin består av en racemisk blanding av R- og S-enantiomerer, der S- formen hovedsakelig inhiberer serotoninreopptak og R-formen inhiberer presynaptisk
reopptak av både noradrenalin og serotonin (16). Begge reopptakstransportørene er vist i figur 1.1. Venlafaksin metaboliseres hovedsakelig av CYP2D6 til den aktive metabolitten O-
desmetylvenlafaksin (OVEN). Modersubstansen er også aktiv i seg selv. I tillegg dannes en inaktiv metabolitt, N-desmetylvenlafaksin, fra CYP2C19 (17). I følge Fürst er det terapeutiske vinduet for venlafaksin og OVEN til sammen 0,4-2 µM (18).
1.2 Antidepressiva og graviditet
Depresjon påvirker inntil 20 % av kvinner i fertil alder (19), og i Norge bruker ca. 1,5 % av alle gravide antidepressiva under svangerskapet. Dette tilsvarer omtrent 900 svangerskap årlig (20). Graviditet og post partum blir ansett for å gi relativ høy risiko for depressive episoder hos kvinner, særlig hos dem med allerede eksisterende psykiske lidelser. Under disse to periodene kan det være nødvendig å starte eller fortsette antidepressiv legemiddelbehandling (21). Behandlingen er kontroversiell da det er forbundet med negative effekter for fosteret (22). Depresjon i seg selv øker risikoen for røyking, feilernæring, overvekt, hypertensjon og selvdestruktiv adferd (23). Ubehandlet depresjon kan med dette påvirke mors helse og videre øke risikoen for svangerskapsforgiftning. Uten behandling kan det i tillegg oppstå postnatal depresjon. Dette kan påvirke relasjonen mellom mor og barn negativt og ha en negativ effekt på barnets emosjonelle utvikling (22). Brå seponering av antidepressive legemidler ved graviditet er ikke anbefalt grunnet påvirkning av mors helse både prenatalt og postnatalt. Det kan i tillegg påvirke det tidlige mor-barn-forholdet (24). Klinikernes oppgave er dermed å hjelpe mødrene med å vurdere risikoen for prenatal eksponering av legemidler mot den potensielle risikoen av ubehandlet depresjon og brå seponering av farmakologisk behandling (21).
Siden 2000 har det vært et særlig fokus på sikkerhetsfarmakologi av antidepressiv behandling av gravide, spesielt SSRI. Disse studiene har gitt motstridende resultater angående risiko for blant annet alvorlige abnormaliteter, kardiovaskulære malformasjoner, nevralrørsdefekter,
være så sprikende, og dette kan skyldes at ulike studier preges av ukontrollerbare og mulig ukjente bias. Den norske mor, far og barn undersøkelsen (MoBa) gjennomførte en
kohortstudie på graviditeter i Norge mellom 2000 og 2006 på 72 993 kvinner. 1,1 % av disse kvinnene rapporterte bruk av antidepressiva under graviditeten. I denne studien ble det ikke funnet statistisk signifikante forskjeller mellom kontrollgruppen og den eksponerte gruppen på malformasjoner, premature fødsler eller lav fødselsvekt (19).
De antidepressivene som er hyppigst brukt under graviditet tilhører legemiddelgruppene SSRI og SNRI (22). I MoBa ble escitalopram/citalopram rapportert som det mest brukte
antidepressive legemidlet og venlafaksin det mest brukte utenom SSRI (19). Disse
legemiddelgruppene er ikke assosiert med økt risiko for store abnoramliteter hos fosteret, men det fokuseres nå på andre typer reproduktivitetstoksikologi som blant annet endret neonatal adferd. Food and Drug Administration (FDA) i USA har merket legemidler innenfor disse gruppene med advarsel om neonatale komplikasjoner assosiert med eksponering sent i graviditeten (25).
Fosterets eksponering for venlafaksin er høyere sammenlignet med andre antidepressiva. En studie viste at venlafaksin-konsentrasjoner er høyere i fostervann enn i mors serum.
Konsentrasjonene av både modersubstansen og den aktive metabolitten O-
desmetylvenlafaksin er farmakologisk relevante. Dette indikerer akkumulering eller redusert eliminasjon av legemiddelet (17).
1.3 Nervesystemets utvikling
Det humane sentralnervesystemet (CNS) er det mest komplekse av alle biologiske systemer.
Hjerneutviklingen begynner i svangerskapsuke tre, og består av en kompleks serie av
dynamiske og adaptive prosesser som gjennom utviklingsforløpet opererer for å fremme vekst og differensiering av nye nevronale strukturer og funksjoner. Disse komplekse prosessene innebærer proliferasjon, migrasjon, differensiering og apoptose (26). Prosessene har kritiske tidsrammer, og det er kjent at selv små endringer kan påvirke atferdsmessig utvikling (26, 27). Forløperne til cellene som utgjør hjernen og resten av sentralnervesystemet kalles nevronale stamceller. De nevronale stamcellene gjennomgår flere celledelinger mellom embryonaldag 25 (E25) og 42, og på E42 starter nevrogenesen. Stamcellene deles til både nye stamceller og differensieres til nevroblaster og glioblaster vist i figur 1.2 (26). Disse
differensieres videre til nevroner og gliaceller (28). Nevronene migrerer til ulike steder i hjernen ved hjelp av adhesjonsmolekyler og gliaceller. Nevroner er postmitotiske, som vil si at de ikke kan proliferere. Etter migrasjon differensierer nevronene og skiller ut
nevrotransmittere. Nevrotrofiske faktorer begynner å indusere dannelse av hjernens nevronale nettverk med aksoner og dendritter (26).
Figur 1.2 Prolifererasjon og differensiering av nevronale stamceller.
Figuren viser nevronale stamceller som deler seg og differensierer til nevronale progenitorer og glia progenitorer og deretter videre til nevroblaster og glioblaster. Figuren er hentet fra (29) og modifisert.
Nervesystemet er ekstremt sensitivt for faktorer som kan påvirke embryoutviklingen (30).
Nevrotransmittere spiller en kritisk rolle i utviklingen av hjernen (31). Serotonins rolle innen nevroutviklingen er ikke fullstendig kartlagt, men studier viser at serotonin er involvert i dendrittvekst og dannelse og stabilisering av synapser i lillehjernen (32). Det antas at
serotonin spiller en rolle ved celleproliferasjon, migrasjon og differensiering, og dermed også hjernemorfologien (33). Feilfunksjon i det serotonerge systemet er forbundet med schizofreni og autisme (32). Noradrenalin er med på å forme og danne forbindelser i CNS under kritiske perioder i utviklingen. Endringer i nivå av noradrenalin under disse periodene kan føre til abnormal adferd postnatalt (31).
1.3.1 Lillehjernen
Lillehjernen ligger på den bakre undersiden av bakhodelappen av storehjernen (34).
lillehjernen er assosiert med kognisjon (35). I tillegg anses lillehjernen som en god modell for å se på generell utvikling i CNS (36). Lillehjernen hos mennesker er omtrent 10 % av
hjernens vekt, men er estimert til å inneholde mer enn halvparten av alle nevronene i CNS (37). Over 90 % av nevronene i lillehjernen er kornceller (CGN), noe som utgjør den største homogene nevronale populasjonen i den humane hjernen (38). Under utvikling er lillehjernen bygget opp av det ytre germinallag (EGL), molekylærcellelaget (ML), purkinjecellelaget (PCL) og det indre granulære laget (IGL). Innenfor IGL ligger hvit substans. De ulike lagene er vist i figur 1.3. Gjennom utviklingen vil CGN i EGL migrere til IGL, helt frem til EGL forsvinner totalt etter det første leveåret (39). Lillehjernen er en veletablert modell for eksperimentelle studier på CNS grunnet den veldefinerte cytoarkitekturen og veiene i lillehjernens cellemigrasjon under nevrogenese (37). Andre hjernestrukturer, f.eks.
storehjernen er ikke like godt konservert mellom arter. Hos menneske domineres hjernestrukturen av en seks-lags hjernebark, mens hos kylling består den av nukleære strukturer (40).
Figur 1.3 Cellelagene i lillehjernen under utvikling.
Figuren viser de ulike cellelagene i lillehjernen. Ytterst i lillehjernen er ytre germinallag, etterfulgt av molekylærcellelaget, purkinjecellelaget, indre granulærlag og hvit substans.
Figuren er modifisert og hentet fra (41).
1.3.2 Proliferasjon
For at en populasjon av celler skal øke, må cellene proliferes (dele seg). Dette skjer ved at cellen går gjennom en cellesyklus og gradvis forbereder seg til mitose. Cellesyklusen består av fire faser; G1, S, G2 og M (figur 1.4). I G-fasene vokser cellen, i S-fasen dupliseres genomet og i M-fasen skjer selve mitosen; det dannes to datterceller (42). PCNA
(Proliferating cell nuclear antigen) spiller en viktig rolle for reparering og replikasjon av DNA. Uttrykk av PCNA er til stede gjennom hele cellesyklusen, men øker i G1- og S-fasen.
Ki-67 (Marker of proliferation Ki-67) uttrykkes fra sen G1-fase og til og med M-fase og kan dermed brukes som markør for celleproliferasjon (43).
Figur 1.4 Cellesyklusen.
Figuren viser de ulike fasene i cellesyklusen; vekstfasene (G1 og G2), DNA-syntesefasen (S) og celledelingsfasen (M). Figuren er hentet fra (44).
1.3.3 Differensiering
Differensiering er en del av de strengt regulerte, komplekse prosessene under
hjerneutviklingen hvor cellene spesialiseres slik at nevronpopulasjonen utvikler et mangfold av nevroner. Under differensieringen vokser det aksoner og dendritter ut fra cellene (26). N- metyl-D-aspartat-reseptoren (NMDAR) har en kritisk rolle i utviklingsmekanismer innen nevronal differensiering, synaptogenese (dannelse av synpaser), nevrittvekst, nevronal migrasjon, apoptotisk og eksitotoksisk nevrondød (45, 46). NMDAR er en glutamatreseptor med ligandstyrte ionekanaler med høy permeabilitet for Ca2+. Den består av flere subenheter der uttrykket av disse endres gjennom utviklingen av hjernen (45). Andelen av GluN2B- subenheten (NMDAR subtype 2B) er høy rundt fødsel og avtar de første postnatale
(46). I gnagere har det blitt vist at mangel på GluN2A kan gi redusert motorikk. I en studie ble det vist at ved oppregulering av GluN2B, ble GluN2A noe redusert i de første tre
levemånedene og betydelig redusert etter fjerde måned. Det antas at grunnen kan være at pågående uttrykk av GluN2B kan føre til avtagende uttrykk av GluN2A (47).
Transkripsjonsfaktorer regulerer genekspresjon (48) og bidrar til å gjøre differensieringen effektiv og uniform. Transkripsjonsfaktoren Pax-6 (Paired box 6) er kritisk for normal lillehjerneutvikling og har er høyt uttrykt i migrerende nevroner. Den er en viktig regulator for differensiering av CGN og migrering av nevroner fra EGL til IGL (49).
1.3.4 Apoptose
Apoptose er en regulert form for celledød og har lenge blitt ansett som kritisk for normal utvikling. I løpet av hjerneutviklingen er det mye celleproliferasjon, som blir etterfulgt av apoptose av celler som ikke har etablert passende synaptisk tilkobling eller er overflødige.
Bcl-2-familien (B-cell lymphoma 2) inneholder både pro-apoptotiske og anti-apoptotiske proteiner som inngår i apoptotiske signalveier. Bcl-2 og Bcl-XL (B-cell lymphoma extra large) i Bcl-2-familien er anti-apoptotiske regulatorer (50). Bcl-XL knock-out førte til død av embryo grunnet massivt celletap i CNS under utvikling (51). Dette løfter frem hvor viktig reguleringen av apoptose er i utviklingsstadiet.
1.4 Valg av modellsystem
1.4.1 Kyllingmodellen
Sikkerhetsfarmakologi i foster er utfordrende å gjennomføre og har tidligere blitt neglisjert i de fleste studier da det ikke er etisk forsvarlig å gjennomføre kliniske studier på gravide kvinner (36). Dyremodeller brukes mye i prekliniske studier, men kan by på etiske
utfordringer i tillegg til at det kan være vanskelig å vite i hvor stor grad disse modellene kan overføres til mennesker. Innen problemstillingen antidepressiva under graviditet har de fleste studiene blitt utført på rotte. For å kunne avdekke artsforskjeller trengs det flere studier på andre dyrearter (1).
Kyllingmodellen er en veletablert modell for teratologi og utviklingsstudier (36), og den har også vært nyttig innen forskning på kreft og det kardiovaskulære systemet (52). CNS og
kyllingmodellen har et stort potensial i slike studier (36).
Humane svangerskap har en varighet på ca. ni måneder, mens tilsvarende for kylling er det 21 dager. Hos kylling har lillehjernen en vekstspurt fra E13 til E17, mens hos menneske er veksten av lillehjernen størst helt mot slutten av svangerskapet. Dette betyr at selv om lillehjernen hos kylling har lignende stadier av utvikling til menneske, har den ved fødsel høyere morfologisk modenhet, som vist i figur 1.5 (36).
Figur 1.5 Embryonal utvikling hos kylling og menneske.
Vekstspurten i lillehjerne hos kylling skjer tidligere enn hos menneske, og dette resulterer i at kyllingen har en mer moden hjerne ved klekking enn menneske har ved fødsel. Figuren er modifisert og hentet fra (36).
1.4.2 PC12-cellelinje som modellsystem
Det er mange egenskaper som gjør cellelinjer attraktive som in vitro modeller: de er homogene, lette å dyrke, deler seg raskt og cellene kan overleve lenge ved splitting (53).
PC12 (Pheochromocytoma Cell Line 12) er en klonet cellelinje som har sin opprinnelse i en tumor (feocromocytom) i binyremargen hos rotte. Cellene i binyremargen har sin opprinnelse fra nevroektrodermceller. Disse nevroektodermcellene er også, gjennom differensiering,
biokjemisk, mens under dyrkning i nærvær av nervevekstfaktor (NGF), differensieres cellene til å ligne sympatiske nevroner både morfologisk og funksjonelt. Evnen til å differensiere under enkle dyrkningsbetingelser gjør den til en gunstig cellemodell for å sammenligne effekter i differensierte og udifferensierte celler. Forholdene kan tilpasses slik at cellene skiller ut dopamin, noradrenalin eller acetylkolin, og i tillegg få Na-, K- og Ca-kanaler og andre membranreseptorer (55), blant annet SERT (56) og noradrenalinreopptakshemmer (NET) (57). Differensierte celler prolifererer ikke og celletallet vil dermed holde seg konstant (58).
1.4.3 SH-SY5Y-cellelinje som modellsystem
SH-SY5Y er en cellelinje som opprinnelig kommer fra en human metastatisk nevroblastoma (svulst) i bein, og uttrykker derfor flere humanspesifikke proteiner (59). Nevroblastoma kjennetegnes av nevroblastiske kreftceller som ligner embryonale sympatiske nevroblaster (60). Både udifferensierte og differensierte SH-SY5Y-celler kan uttrykke flere dopaminerge nevronalmarkører i tillegg til dopamintransporteren (DAT) og dopaminreseptor 2 og 3 (DR2 og DR3) (59). Det er også funnet SERT (61). De udifferensierte cellene ligner nevroblaster morfologisk, og prolifererer raskt (59). I nærvær av retinsyre (RA) vil cellene differensiere og proliferasjonen stoppes slik at celletallet holdes konstant (62). Ved differensiering er det vist økt uttrykk av DAT, DR2, DR3 og tyrosin hydroksylase (TH). TH er et viktig enzym i dannelsen av dopamin og indirekte for noradrenalin og adrenalin som vist i figur 1.6. I medium med ulike betingelser, kan cellene differensiere til ulike nevronale fenotyper inkludert kolinerge, adrenerge og dopaminerge (59).
Figur 1.6: Syntesevei for dopamin og noradrenalin.
Tyrosin hydroksylase (TH) et enzym som bidrar til syntese av L- DOPA fra L-tyrosin. L-DOPA syntetiseres videre til dopamin som igjen syntetiseres til noradrenalin. Figuren er hentet fra (63).
1.5 Hensikt med studien
Det er stor mangel på kliniske studier på sikkerhet og effekt av legemidler for gravide da de oftest ekskluderes fra studiene på grunn av etiske betenkeligheter. Det fører til at nytte- og risikovurdering hovedsakelig må baseres på prekliniske studier i dyr og retrospektive
observasjonsstudier. De fleste dyrestudiene på bruk av antidepressiva under svangerskapet er gjort på rotter, og bruk av flere dyrearter trengs for å avdekke eventuelle relevante
artsforskjeller.
Depresjon rammer inntil en femtedel av kvinner i fertil alder, og i Norge fødes det hvert år rundt 900 barn som har blitt eksponert for antidepressiva under svangerskapet. SNRI og SSRI er de vanligste legemiddelgruppene brukt i behandling av svangerskapsdepresjon. Av disse legemiddelgruppene er escitalopram og venlafaksin hyppigst brukt.
På bakgrunn av dette ble det formulert en hypotese om at escitalopram og venlafaksin endrer uttrykk for proteiner som er involvert i nevronal utvikling hos eksponerte celler og embryo, og at lillehjernens struktur endres. Cellelinjene PC12 og SH-SY5Y brukt som forsøksmodell i tillegg til kyllingembryo.
Delmål:
1. Undersøke om escitalopram og venlafaksin påvirker viabilitet i PC12-celler, SH- SY5Y-celler og kornceller. I tillegg se om legemidlene påvirker kalsiuminfluks i kornceller.
2. Undersøke om escitalopram og venlafaksin påvirker proteinuttrykk av biologiske markører knyttet til celledifferensiering i kyllinghjerne (lillehjerne og forhjerne), herunder Pax-6 og GluN2B. Måle proteinuttrykk av PCNA, Bcl-2 og Bcl-XL i kyllinghjerne som indikator på endring i henholdsvis celleproliferasjon og apoptose.
3. Undersøke om escitalopram og venlafaksin påvirker nevronal modning ved
histologiske undersøkelser ved bruk av lillehjerne som modellsystem i kyllinghjernen.
2. Materialer og metoder
2.1 Produkt- og utstyrsliste
Tabell 2.1 Oversikt over kjemikalier og biologiske produkter
Produkt Leverandør
Albumin Standard Thermo Scientific, Rockford, USA
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies, Vancouver, Canada Antistoffer (se tabell 2.2)
AraC Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Basal Medium Eagle (BME), Gibco™ Thermo Fischer Scientific, Rockford, USA BioWhittaker’sâ DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium)
Lonza Bioscience, Basel, Sveits
Blokkebuffer, Interceptä Li-COR Biosciences, Lincoln, USA
Bromfenolblå Merck KGaA Darmstadt, Tyskland
BSA, HyCloneä, fraksjon V GE Healthcare Life Sciences, Utah, USA Deokyribonuklease I fra kalvepankreas
Type IV, lyofilisert pulver
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O)
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
DMSO (dimetyl sulfoksid) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Escitalopram oksalat Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Elfobuffer TGS (Tris/Glycin/SDS) 10x Bio-Rad Labratories Inc., Hercules, USA Etanol (absolutt alkohol) Antibac, Oslo, Norge
Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) VWR Life Science, Radnor, USA
Føtalt kalveserum, Gibco™ Thermo Fischer Scientific, Rockford, USA
Glukose Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland
Glutamin Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
H-transferrin Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Hesteserum, Gibco™ Thermo Fischer Scientific, Rockford, USA
Hoechst 33342 Invitrogen, Carlsbad, USA
Insulin Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Kaliumklorid (KCl) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Kalsiumklorid dihydrat Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Kobbersulfat pentahydrat (CuSO4 x 5H2O) Merck KgaA, Darmstadt, Tyskland
Kyllingserum, Gibco™ Thermo Fischer Scientific, Rockford, USA
L-Glutamine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Magnesiumsulfat Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
2-Merkaptoetanol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Na3VO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Natriumdihydrogenfosfat monohydrat (NaH2PO4H2O)
VWR Life Science, Radnor, USA
Natriumhydroksid (NaOH) Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland Natriumdeoksylat monohydrat Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Natriumdodecylsulfat (SDS) Shelton Scientific (Sigma-Aldrich, USA) Natriumklorid (NaCl) VWR Life Science, Radnor, USA
Natriumpyruvat Thermo Fischer Scientific, Rockford, USA
Natriumselentitt (Na2SeO3) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Nervevekstfaktor (NGF) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Penicillin-Streptomycin Invitrogen, Carlsbad, USA
Pepstatin A Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Poly-L-Lysine hydrobromid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Ponceau S Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
PMSF (fenylmetansulfonylfluorid) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Precision Plus ProteinÔ All Blue Standard Bio-Rad Labratories Inc., Hercules, USA
Propidiumjodid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Putrecin dihydroklorid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Resazurin natriumsalt Alfa Aesar (Thermo Fischer Scientific, UK)
Retinsyre (RA) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Sitronsyre (AnalaR) BDH Chemicals l.td., Poole, UK Strippebuffer (NewBlotÔ Nitro) Li-COR Biosciences, Lincoln, USA Trans-Blotâ TurboÔ 5x Bio-Rad Labratories Inc., Hercules, USA Tri-jodid-L-tyronin-natriumsalt (T3) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Triton X-100 Sigma Aldrich, St. Louis, USA
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Tris-HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fischer Scientific, Rockford, USA Trypsinhemmer (soyabønne) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Tweenâ 20 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Venlafaksin hydroklorid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Tabell 2.2 Oversikt over antistoff
Produkt Leverandør
b-aktin (Ms) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Bcl-2 (Ms) Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA
Bcl-XL (Rb) Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA
GAPDH (Ms) Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA
Ki-67 (Rb) Cell Signaling Technology, Danvers, USA
NR2B (Rb) (antistoff til GluN2B) Abcam, Cambridge, UK
Pax-6 (Rb) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
PCNA (Ms) Dako, Berlin, Tyskland
Donkey, anti-Mouse IgG-HPR Li-COR Biosciences, Lincoln, USA Donkey, anti-Rabbit IgG-HPR Li-COR Biosciences, Lincoln, USA
Tabell 2.3 Oversikt over utstyr og apparatur
Produkt Leverandør
Alcohol Pads B. Braun Medical, Melsungen, Tyskland
Blottemaskin (Trans-Blotâ TurboÔ Transfer System)
Bio-Rad Labratories Inc., USA
Blotteutstyr (Trans-Blotâ TurboÔ RTA Transfer Kit)
Bio-Rad Labratories Inc., USA
Brett, 96 brønner, gjennomsiktige (NuncTM) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Brett, 96 brønner, svarte med glassbunn Corning Inc., Corning, USA
Cellekulturskåler (NuncTM) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA
Elektroforeseapparat (BioRad Power Pac 300)
Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, USA
Elektroforesekar Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, USA Engangsskalpell Swann-Morton Ltd., Sheffield, England
Engangssprøyter B. Braun Medical, Melsungen, Tyskland
Eppendorfrør Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland
Kanyler (sterile) B. Braun Medical, Melsungen, Tyskland Kjølesentrifuge (Heraeus Fresco 21) Thermo Fischer Scientific, Rockford, USA LAF-benk (Holten LaminAir, modell 1.2) Eco Holten AS, Danmark
Magnetrører (RCT basic) IKA®, Staufen, Tyskland Mikroskop (Nikon Inverted Microscope
Eclipse TE300)
Nikon Corporation, Tokyo, Japan
Mikroskop (Leica DM LS) Leica, Wetzlar, Tyskland Mini-PROTEAN® TGXTM Gels med 4-20
% gradient, 15 brønner
Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, USA
Odyssey-CLx Imaging System Li-COR Biosciences, Lincoln, USA
Pasteurpipette Thermo Fischer Scientific, Rockford, USA
Petriskåler (polysteren) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Pipetter (sterile) Corning Inc., Corning, USA
Pipettespisser Sartorius Biohit, Finland
Plateleser (CLARIOstar®) BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland Rugeskap (OvaEasy 380 Advance EXII) Brinsea, Weston-super-Mare, UK Pierceâ BCA Protein Kit Thermo Scientific, Rockford, USA Rulle (Stuart Rollermixer SRT9) VWR Life Science, Radnor, USA
Sterilfilter (0,2 µm) Whatman, Maidstone, UK
Tellekammer (Neubauer 0.100 mm Tiefe Depth Profondeur)
Marienfeld Superior, Lauda-Königshofen, Tyskland
Vannbad (Sub Aqua 12) Grant Instruments, Royston, UK Vekt: Finvekt (CP225D) Sartorius AG, Tyskland
Vekt: Grovvekt (Valor 3000 XtremeW) Ohaus, Sveits
Whirlmikser Terumo Lab AS, Leuven, Belgia
2.2 PC12-celler og SH-SY5Y-celler
PC12 er en klonet cellelinje som kommer fra en tumor i adrenal medulla i rotte (55). SH- SY5Y er en klonet cellelinje som har opprinnelse i en human metastatisk beinsvulst (59). Ved hver cellesplitting dannes en ny passasje og ved økende antall passasjer kan det oppstå
variabilitet i fenotype grunnet genetisk ustabilitet (53). Under splitting brukes trypsin for å dele opp bindinger mellom cellene, og serumholdig medium tilsettes for å stoppe trypsins nedbrytningsprosess av cellene (64). Cellene splittes to ganger i uken ved at 20 % av cellene overføres til nye skåler. Ved splitting til skåler og brett til forsøk, telles cellene i neubauer hemocytometer for å beregne den ønskede celletettheten (7 x 104 celler/mL). For å
differensiere cellene ble det tilsatt nervevekstfaktor (NGF) og retinoidsyre (RA) i mediet til henholdsvis PC12- og SH-SY5Y-cellene. Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.1-5.
Legemiddelkonsentrasjonene som ble brukt var escitalopram 0,02-100 µM og venlafaksin 0,4-400 µM fra stockløsninger på 100 mM løst i vann.
2.3 Kyllingembryo
De befruktede eggene tilhører arten Gallus gallus domesticus av stammen Ross 308, og ble levert av Nortura Samvirkekylling (Våler, Norge). Eggene ble inkubert ved 37,5 °C med fuktighet på 45 % i OvaEasy 380 Advance EXII inkubator. De ble plassert i stativer med automatisk eggvending for å etterligne ruging. Kjønnsbestemmelse ble ikke utført, så
resultatene tar ikke høyde for eventuelle kjønnsforskjeller. Kyllingembryo defineres som dyr etter E14, så alle prosedyrer er gjort i samsvar med norsk lov om dyrevelferd (FOTS-ID:
13896) og EU direktivet 2010/63/EU.
2.3.1 Injisering av eggene
Eggene gjennomlyses for å sjekke om de inneholder kyllingembryo, og deretter veies de. Vekten brukes for å regne ut volumet av løsning som skulle injiseres. Løsningen er ekvivalent til 1 µL løsning per gram egg.
Eggene injiseres i allantoishulrommet med 0,3 mM escitalopram og 1,5 mM venlafaksin løst i fysiologisk saltvann på E13 eller E13 og E16.
Dette er illustrert i figur 2.1. Dette tilsvarer 97 µg/kg escitalopram og
416 µg/kg venlafaksin. Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.6. Figur 2.1 Illustrasjon av injisering i egget.
2.3.2 Preparering av hjernevev for Western blot
Injiserte egg ble tas ut av rugemaskinen på E17 og legges på is for å bedøve kyllingfostrene. Deretter åpnes eggeskallet, og lillehjerne og en
forhjernehalvdel (venstre del ble brukt, figur 2.2) isoleres for senere Western- analyser (2.9.1). Da cellene lyseres i løpet av prosessen, er det ikke
nødvendig å utføre isoleringen av lillehjerne og forhjerne i sterilt miljø.
Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.7.
2.3.3 Preparering av korncellekultur for eksponering in vitro
cCGN fra lillehjernen kan dyrkes i kultur etter at cellene er dissosiert mekanisk og
enzymatisk. Trypsin er et enzym som bryter opp bindinger mellom proteiner, og brukes for å bryte ned vevet av lillehjernen slik at man får en jevn cellesuspensjon (64). Trypsininhibitor er nødvendig for å forhindre videre degradering av proteinene. I tillegg trengs DNAse 1 for å bryte opp DNA for å forhindre aggregering av cellene (65). Krebs Ringer løsning og Mg2+ i løsning 1 er viktig for å opprettholde pH og cellefunksjon (66). Poly-L-lysin (PLL) brukes til å forbehandle platene og skålene slik at kyllingkorncellene festes til bunnen. PLL adsorberes sterkt til overflaten og gir kationiske bindingsseter for celleoverflatene som har anioniske deler. Cellene festes bedre til bunnen av platene og er godt egnet for videre prosesser som fiksering (67).
Det ble dyrket kulturer av cCGN fra lillehjernen. Disse isoleres på E17, og dyrkes på brett og skåler tildekket med PLL. Celletettheten beregnes ved telling i hemocytometer og justert til 1,7-1,9 x 106 celler/mL. Cellene sås ut i et platemedium med serum, og etter 24 timer byttes dette ut med et definert, serumfritt medium. Det tilsettes 5 µM cytosin b-d-arabinofuranosid (AraC). AraC er en selektiv inhibitor av DNA-syntese som tilsettes cellekulturer for å hemme proliferering av fibroblaster og gliaceller (68).
Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.8.
2.4 Viabilitetsstudier med MTT
MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid) er et stoff som kan brukes til en kvantitativ og sensitiv analysemetode for å måle cellenes viabilitet i en cellekultur. Celler med aktiv metabolisme vil resultere i en fargeendring fra gul til lilla når MTT reduseres til
Figur 2.2 Kyllinghjerne på E17.
Venstre hjernehalvdel av forhjernen er markert i rødt og lillehjernen er markert i gult.
adenin dinukleotid + hydrogen) eller lignende reduserende molekyler som utfører en
elektronoverføring til MTT. Formazan løses opp i DMSO før absorbansen kan avleses (69).
Det ble brukt blanke 96-brønnsplater med cellesuspensjon av PC12-celler, SH-SY5Y-celler og kyllingkornceller (cCGN) som var eksponert for escitalopram og venlafaksin. Cellene ble inkuberes i tre timer med MTT før platene avleses på 570 nm i plateleser. Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.9.
2.5 Viabilitetsstudier med rezasurin
Resazurin (7‐hydroxy‐3H‐phenoxazin‐3‐one 10‐oxide), også kalt Alamar Blue, er et blått, ikke-fluorescerende stoff som gjennom celleaktivitet blir redusert til resorufin. Resorufin er rosa og gir fluorescens. Dette er en rask og enkel test for å måle celleproliferasjon og viabilitet, og dermed få infomrasjon om toksisitet. Det antas at reduksjonen av resazurin skyldes en reaksjon med enzymet diaforase (70). Metoden ble utført i blanke 96-brønnsplater med cellesuspensjon av PC12-celler, SH-SY5Y-celler og cCGN som var eksponert for
escitalopram og venlafaksin. Cellene inkuberes med resazurin i fire timer før platene avleses i plateleser (570/600 ex/em). Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.10.
2.6 DNA-kvantifisering med Hoechst 33342
Hoechst-farging er en av de mest brukte fluoroforene for DNA-farging for både levende og døde celler. Affiniteten og spesifisiteten til DNA sikrer god farging. Hoechst 33342 bindes til adenin-tymin-rike områder i DNA og fluorescensen øker betydelig med binding til
dobbelttrådig DNA. Hoechst 33342 har en høyere cellepermeabilitet enn de andre typene Hoechst grunnet en lipofil etylgruppe (71). Forsøkene ble utført på brett med cCGN der viabiliteten allerede var blitt målt ved hjelp av resazurin-analyse. Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.11.
2.7 Celledødsstudier med propidiumjodid
Propidiumjoidid (PI fra engelske Propidium Iodide) er et polart, fluorescerende stoff. Ved binding til dobbelttrådig DNA øker intensiteten av fluorescensensen med 20-30 ganger. På grunn av sin polaritet, vil PI kun penetrere cellemembraner som ikke er intakte, og metoden kan derfor brukes til å merke døde celler i cellekulturer (72). Forsøkene ble utført i
udifferensierte PC12-celler i blanke 96-brønnsplater. Det tilsettes PI løst i PBS (5 mg/mL) i
brønnene. Deretter inkuberes platene i 20 minutter og avleses i plateleser (485/650 ex/em) og undersøkes i fluorescensmikroskop. Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.12.
2.8 Kalsiuminfluks med Fura-2 AM
Kalsiuminfluks er en metode for å undersøke endringer av kalsiuminfluks i cellene under ulike eksponeringer. Fura-2 AM (Fura-2-acetoksymetylester) er den cellepermeable
esterformen av Fura-2. Denne deestrifiseres i cellene og fanges der. Fura-2 er en chelator og en fluorescerende Ca2+-indikator som brukes til å monitorere cytoplasmiske kalsiumnivåer.
Prinsippet bak Fura-2 er basert på endringen av fluorescenseksiteringsspekteret mot en kortere bølgelengde ved binding til Ca2+. Fluorescensen måles på 340/510 ex/em (bundet til Ca2+) og 380/510 ex/em (ubundet). Ratioen av 340/380 er proporsjonal med nivåene av intracellulært Ca2+ (73). Ved å bruke Mg2+ og MK-801 (dizocilipin) som blokkere og NMDA/glysin som stimulering for NMDAR, kan det vises om legemidlene påvirker kalsiuminfluks ved hjelp av NMDAR. cCGN sås ut i svarte brett med glassbunn, behandles med legemiddel på DIV1 og måles i plateleser i 15-90 minutter. Bakgrunnen måles først i nærvær av magnesium, hvoretter behandlingen gjøres i buffer uten magnesium. Til slutt tilsettes stimulerende buffer inneholdende NMDA og glysin. Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.13.
2.9 Western blot
2.9.1 Tillaging av prøver til Western blot
Lillehjerner og venstre halvdel av forhjernen fra kylling injisert med escitalopram (97 µg/kg) eller venlafaksin (416 µg/kg) på E13 eller E13 og E16 ble brukt til å lage prøvene (2.4.2).
Lyserende buffer med tilsatte protease- og fosfataseinhibitorer nedkjøles til 4 °C på forhånd.
Hjernedelene homogeniseres i lyserende buffer. Alle prøvene skal stå på is hele tiden for å hindre degradering av proteinene. Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.14.1.
2.9.2 Proteinmåling med BCA proteinanalyse
Denne metoden bruker bicinkoninsyre (BCA) for å detektere Cu1+. Proteiner reduserer Cu2+
til Cu+1, og ved å bruke BCA kan Cu+1 detekteres kolorimetrisk og med høy sensitivitet.
BCA reagerer med Cu1+ og danner et chelatkompleks som har en sterk lineær absorbans på
brønn i Western-analysen. Lysatene analyseres i duplikat. Fluorescensen leses av og proteinkonsentrasjonen beregnes ved hjelp av en standardkurve av BSA.
Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.14.2.
2.9.3 SDS-polyakrylamidgelelektroforese
Laemmli-buffer inneholder SDS (natrium dodecylsulfat), 2-merkaptoetanol, glyserol, tris og bromfenolblått. Ved tilsetting av SDS, en anionisk surfaktant, vil alle proteinene få en negativ nettoladning. De vil dermed vandre mot positiv pol når elektrodene settes på karet og
separeres på bakgrunn av størrelse (75). Tiolforbindelser vil sammen med SDS «brette ut»
proteinene. Glyserol gir prøvene høy tetthet, så de synker ned i brønnene. Tris-HCl brukes til å stabilisere pH og inhiberer også enzymatiske reaksjoner. En pH på 6,8 virker stabiliserende på proteinene ved oppbevaring i frysen og enzymhemmingen forhindrer degradering av proteaser (76). Prøvene (2.9.2) kokes og tilsettes laemmli-buffer i forholdet 1:4. Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.14.3.
2.9.4 Gelelektroforese
Det ble benyttet ferdigstøpte geler av typen Mini-PROTEANâ TGXÔ med 4-20 % gradient fra Bio-Rad. Gradienten sikrer god seperasjon av proteiner med et bredt spekter av
molekylstørrelse (77). Beregnet volum av prøvene (2.9.3) tilsvarende 25 µg protein tilsettes brønnene i gelen. Gelen settes i et gelelektroforesekar fylt med elfobuffer på 150 V i ca. en time. Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.14.4.
2.9.5 Blotting av gel
Proteinene på gelen overføres til nitrocellulosemembran ved hjelp av et elektrisk felt satt perpendikulært på overflaten av gelen slik at proteinene flyttes fra gelen til membranen (75).
Trans-Blotâ TurboÔ Transfer System fra Bio-Rad ble benyttet. Filteret fuktes for at
proteinene skal overføres fullstendig til nitrocellulosemembranen og beskytter også gelen og membranen i transblotapparatet (75). Blottingen settes på i 15 minutter ved 25 V og 2,5 A.
Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.14.5.
2.9.6 Ponceaufarging og blokking av membran
Ponceau S-løsning farger proteinene på membranen røde slik at det er mulig med visuell bekreftelse av overføringen. Blokkingen skal forhindre uspesifikk binding av antistoff og dermed redusere bakgrunnsstøy og falske positive resultat, og gi et klarere resultat (78).
Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.14.6.
2.9.7 Tilsetting av primære og sekundære antistoffer og fremkalling av membran
Primærantistoffene bindes selektivt til tilhørende protein, og velges ut fra hvilket protein man ønsker å detektere. Fluorescerende sekundærantistoffer vil bindes selektivt til
primærantistoffene og emittere lys som kan avleses. Fremkallingen utføres på Odyssey-CLx Imaging system. Membranene plasseres med proteinsiden ned mot scanneren. Kvantifisering av båndstyrkene utføres ved hjelp av programmet ImageStudioLite. Detaljert protokoll for tilsetting av antistoff finnes i appendiks B 8.14.7.
2.9.8 Stripping av membran
Ved å strippe membranen for antistoffer blir det mulig å tilsette nye primær- og sekundærantistoffer på membranene. Detaljert protokoll finnes i appendiks B 8.14.8.
2.10 Histologi
Tillaging av histologiske snitt ble utført av Sigrid Bjørnstad, spesialist i patologi og overlege ved OUS. Snittene farges med hematoksylin og eosin (H&E) og scannes deretter digitalt.
H&E-farging farger cellekjernen blå, og cytoplasma og ekstraellulær matriks rosa. Dette skyldes at det oksiderte produktet av hematoxylin, hematein, gir en kationisk, basisk farge.
Metalliske salter tilsettes fargen for å sikre binding til vevet. Eosin er et anionisk, surt fargestoff. De fleste cellulære organeller, ekstracellulære komponenter og ekstracellulære matriks har affinitet for eosin og vil dermed farges rosa. (79, 80). Eggene brukt i denne studien ble injisert i allantoishulrommet med escitalopram (97 µg/kg) oppløst i 0,9 % NaCl, venlafaksin (416 µg/kg) oppløst i 0,9 % NaCl eller tilsvarende volum av 0,9 % NaCl på E13 eller E13 og E16. Deretter ble lillehjernene høstet på E17. Kyllingembryoene med lavest og høyest vekt innen hver eksponeringsgruppe ble ekskludert fra studien for å redusere
Det lages to snitt av hver lillehjerne, og tykkelsen på de ulike lagene i lillehjernen og antall migrerende nevroner ble måles/telles ved hjelp av 3DHistechs Slide og Caseviewer
(Budapest, Ungarn). Figur 2.3 viser bilde av et histologisk snitt og inndelingen av de ulike lagene. EGL, IGL, hvit substans, hjernebark, ML og PCL ble målt på ni ulike steder på snittet av kyllinglillehjernen. For migrerende nevroner ble det gjort seks tellinger på hvert snitt i 385 µm-vinduer. Apoptotiske og mitotiske celler ble talt på mikroskop (Leica DM LS) med 100x objektiv. Det ble utført telling på seks ulike steder på snittene.
Figur 2.3 Histologisk snitt av lillehjerne hos kylling.
Det er vist utsnitt fra H&E-farget lillehjerne hos kylling. Målestokkene tilsvarer henholdsvis 1000, 200 og 50 µm. Lagene som måles er markert med stiplede, gule linjer; hvit substans (WM), indre granulærlag (IGL) og ytre germinallag (EGL). Purkinjecellelaget (PCL) og molekylærlaget (ML) måles sammen.
2.11 Statistiske metoder
Resultater med tekniske replikater fra flere biologiske forsøk er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnitt (SEM) Resultater basert med kun tekniske replikater fra et biologisk forsøk er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistiske analyser ble utført gjennom GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc). Sammenligninger ble testet ved one way analysis of variance (One Way ANOVA) etterfulgt av Dunnett’s post hoc test. P- verdi < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Ekskludering av uteliggere ble utført med ROUT (Q =1).
3. Resultater
3.1 Viabilitet
3.1.1 Udifferensierte PC12-celler med MTT-analyse
Viabiliteten til PC12-celler ble undersøkt ved MTT-analyse. Cellene ble eksponert for escitalopram (0,02-100 µM) og venlafaksin (0,4-100 µM) dagen etter utplating. 24, 48 og 72 timer etter eksponering ble MTT tilsatt og platene ble avlest etter tre timer ved 570 nm. Det ble ikke funnet noen tydelige trender på endringer i viabilitet for verken escitalopram eller venlafaksin (figur 3.1).
Figur 3.1 Viabiliteten til udifferensierte PC12-celler endres ikke ved eksponering for escitalopram og venlafaksin.
Cellekulturer med udifferensierte PC12-celler ble eksponert for escitalopram (0,02-100 µM) og venlafaksin (0,4-100 µM) dagen etter utplating. 24, 48 og 72 timer etter eksponering ble celleviabilitet avlest på plateleser ved hjelp av MTT-analyse. Ubehandlede celler ble benyttet som kontroller i forsøkene. Resultatene baserer seg på gjennomsnittet av tre (A) og seks (B,C,D,E) tekniske replikater ± SD fra et forsøk normalisert mot kontroll. To uteliggere ble fjernet fra D ved ROUT (Q = 1).
Kntrl 0,02 0,2 1,6 3,13 6,25
12,5 25 50 100 0
50 100
Eksponering iµM
Celleviabilitet
Escitalopram, 48t A
Kntrl 0,02 0,2 1,6 3,13 6,25
12,5 25 50 100 0
50 100
Eksponering iµM
Celleviabilitet
Escitalopram, 72t B
Kntrl 0,4 0,8 1,6 3,1 6,25
12,5 25 50 100 0
50 100 150
Eksponering iµM
Celleviabilitet
Venlafaksin, 24t C
Kntrl 0,4 0,8 1,6 3,1 6,25
12,5 25 50 100 0
50 100 150
Eksponering iµM
Celleviabilitet
Venlafaksin, 48t D
Kntrl 0,4 0,8 1,6 3,1 6,25
12,5 25 50 100 0
50 100 150
Venlafaksin, 72t
Eksponering iµM
Celleviabilitet
E
3.1.2 Udifferensierte PC12-celler med resazurin-analyse
Grunnet ujevne trender i viabilitetsstudiene med MTT, ble det valgt å prøve ut resazurin- analyse for videre viabilitetsstudier. Cellene ble eksponert for escitalopram (12,5-100 µM) og venlafaksin (50-400 µM dagen etter utplating. 24 og 48 timer etter eksponering ble resazurin tilsatt og platene ble avlest etter fire timer. Det ble undersøkt om løsemidlet hadde en effekt på celleviabiliteten i seg selv. Verken legemidlene eller løsemidlet i seg selv påvirket celleviabiliteten (figur 3.2).
Figur 3.2 Viabiliteten til udifferensierte PC12-celler endres ikke av løsemidlet, escitalopram eller venlafaksin.
Cellekulturer med udifferensierte PC12-celler ble eksponert for escitalopram (12,5-100 µM), venlafaksin (50- 400 µM) løst i dH2O eller løsemidlet (dH2O) dagen etter utplating. 24 og 48 timer etter eksponering ble celleviabilitet avlest på plateleser ved hjelp av resazurin-analyse. Ubehandlede celler ble benyttet som kontroller i forsøkene. Resultatene baserer seg på gjennomsnittet av seks tekniske replikater ± SD per tidspunkt fra tre (A), fire (B) og syv (C) uavhengige forsøk normalisert mot kontroll. Statistiske analyser ble utført med One Way ANOVA, n = 3-7 En uteligger ble fjernet fra B og C ved ROUT (Q = 1).
Kntrl 24 48 0
50 100
Celleviabilitet
H2O
Eksponeringstid (t) A
Kntrl
12,5 25 50 100 50 100 200
400 0
50 100
24t
Celleviabilitet
Eksponering iµM B
Kntrl
12,5 25 50 100
50 100 200
400 0
50 100
Celleviabilitet
48t
Eksponering iµM C
3.1.3 Differensierte PC12-celler med resazurin-analyse
For å undersøke om effekten av legemidlene endres ved differensiering ble det utført forsøk i PC12-celler som var differensiert i en, tre og syv dager. Mediet i PC12-celler ble byttet ut med medium med lavt serumnivå (1 % føtalt kalveserum og 0,5 % hesteserum) og tilsatt NGF med sluttkonsentrasjon på 50 ng/mL. Da PC12 cellene hadde differensiert i ønsket antall dager ble de eksponert for escitalopram (12,5-100 µM) og venlafaksin (50-400 µM). 24 og 48 timer etter eksponering ble celleviabilitet avlest på plateleser som en del av resazurin-analyse.
For PC12-cellene som hadde differensiert i en og tre dager, ble det ikke funnet noe endring i viabilitet etter eksponering for verken escitalopram eller venlafaksin. Løsemidlet påvirket ikke viabiliteten hos PC12-celler differensiert i tre dager (figur 3.3). Avlesningene hos PC12- celler som hadde differensiert i syv dager og deretter ble eksponert for legemidlene (24 og 48 timer), gav negative verdier ved plateavlesning og er derfor ikke presentert.