Weaknesses of current study

5.7.1. Drenagem Ácida de Minas - Mina de Pirita/OP/MG

O material da DAM coletado foi analisado independente de cultivo e bem como após cultivos realizados nos meios 9K e 0K, pelas técnicas de FISH e DGGE e os resultados foram comparados. As amostras foram amplificadas e os produtos da PCR submetidos à DGGE a um gradiente desnaturante de uréia-formamida variando entre faixa 35-70% e 40-70%.

Populações diferentes representam bandas de perfil distinto ao longo do gel. Diante disso, é possível estimar pela visualização do gel de poliacrilamida que no mínimo 10 populações foram detectadas para as amostras de DAM. Algumas bandas possuíam intensidade maior que as outras, o que sugere maior abundância dessas espécies. Duas dessas (banda A e banda anterior a essa - Figura 5.7) estavam muito próximas uma da outra, pode sugerir serem espécies filogeneticamente próximas.

55 Devido ao fato de se tratar de um ambiente peculiar, pode-se dizer que a diversidade encontrada foi relativamente alta para esse ambiente extremo, que possui características particulares, como pH baixo e presença de metais dissolvidos. Ambientes ácidos não são favoráveis ao crescimento da maioria dos microrganismos e por esse fato as populações vistas não foram tão numerosas (Johnson, 1998; Johnson, 2006; Johnson e Hallberg, 2005).

Quando comparamos a DAM com as outras amostras analisadas vemos que uma das bandas contidas na drenagem e apontada como B (Figura 5.7, 3ª canaleta) também aparece nas outras amostras. Na 5a canaleta da figura 5.5 nós temos uma cepa de At. thiooxidans e na 6º uma cepa de At. ferrooxidans. Sendo assim, como microrganismos semelhantes devem migrar para posições similares em um gel, pelo perfil de bandas que encontramos é possível supor que há microrganismos pertencentes à espécie At. thiooxidans nessas amostras. No entanto, não é possível afirmar somente através da análise de um perfil eletroforético a presença de determinada espécie em uma amostra. A DGGE nos fornece informações sobre a diversidade nas amostras, mas para a identificação de uma espécie é necessário o sequenciamento das amostras (Muyzer et al., 1998).

56

Figura 5.5. Gel de DGGE corado com Sybr-Gold contendo fragmento de DNA ribossomal 16S amplificado com primers universais para Bacteria. (1) Cultivo de amostras de afloramento de enxofre em meio 0K. (2) Cultivo de amostras de pirita em meio 0K.. (3) Amostra de DAM. Bandas assinaladas correspondentes a bandas recortadas e bandas marcadas por A, B e C são as bandas que foram amplificadas com sucesso a partir dessa amostra. (4) Amostra das colunas. (5) Acidithiobacillus

thiooxidans. (6) Acidithiobacillus ferrooxidans.

A banda assinalada como B (figura 5.5), apresentou o mesmo perfil eletroforético que a banda corresponde à espécie At. thiooxidans. Essa banda é a única que coincide com as amostras das colunas de biolixiviação. A análise comparativa entre essas duas amostras revelou que esses dois sistemas são bastante diferentes no que se refere às comunidades presentes em ambos. Enquanto a DAM é um sistema naturalmente ácido, as colunas representam um sistema de biolixiviação construído para a recuperação de metais de interesse. Não foram visualizadas bandas que ocupassem uma mesma posição à representada pela banda da canaleta 6 (correspondente a At. ferrooxidans). Assim, não foi possível sugerir a presença dessa espécie na amostra da drenagem coletada pela análise dos dados de DGGE.

57 Apenas as bandas assinaladas pelas letras A, B e C foram amplificadas com sucesso. As outras bandas foram deixadas por um período de tempo maior, mas nada foi detectado pela reação de PCR.

As bandas amplificadas com êxito foram submetidas a uma nova análise por DGGE. Nessa análise foi usado um gradiente de uréia formamida de 40-70% a fim de que as bandas pudessem ser melhor separadas ao longo do gel. No entanto, a variação na concentração de desnaturante não provocou nenhuma alteração considerável na migração das bandas. As bandas A, B e C amplificadas (Figura 5.6, canaletas 7, 5 e 4, respectivamente) foram comparadas com a amostra original de DAM (canaleta 6) e apresentaram o mesmo perfil de migração no gel.

As bandas A, B e C foram reamplificadas com os primers universais para Bacteria 907R e 341F sem o GC clamp, purificadas, clonadas e enviadas para sequenciamento.

Figura 5.6. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante das bandas cortadas provenientes da amostra de DAM. (1) L. ferrooxidans. (2) Cultivo de DAM em meio 0K. (3) Cultivo de DAM em meio 0K. (4) Banda C – referente à DAM. (5) Banda B – referente à DAM. (6) Drenagem Ácida de Mina. (7) Banda A – Referente à DAM. (8)

At. thiooxidans. (9) Banda referente à coluna de lixiviação. (10) Colunas de lixiviação.

(11) Cultivos das colunas em meio 9K. (12) At. ferrooxidans.

40% 70%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12

C A B

58 Os resultados do sequenciamento de 5 clones revelaram que a banda A, 5ª canaleta (Figura 5.6) possuía 98% de similaridade com o grupo filogenético Burkholderia. Alguns representantes desse grupo já foram isolados de ambientes naturais e estão relacionados à contaminação ambiental e resistência a metais. Embora algumas espécies desse grupo sejam patogênicas, outras têm sido aplicadas a tecnologias ambientais amigáveis. A viabilidade do emprego desse grupo de bactéria para a solubilização de compostos fosfatados de minerais contendo ferro e alta concentração de fósforo e para a biorremediação de arsenito foi avaliada (Delvasto et al., 2008; Duquesne et al., 2007). A habilidade deste microrganismo em mobilizar fosfato foi testado por cultivos em frascos contendo minério de ferro esmagado esterilizado e um meio de cultura líquido contendo glicose (1 g/L-1) como fonte de carbono e nenhuma fonte de fósforo, exceto o próprio minério. A remoção de fosfato do minério era determinada medindo o fosfato residual contido no mineral depois do tratamento bacteriano. Entre 5% e 20% do fósforo originalmente contido no mineral foram mobilizados em 21 dias de tratamento. Outras variáveis como Fe dissolvido, pH e contagem de células também foram monitoradas.Foi visto também o acúmulo de ácido glucônico no meio em questão (Delvasto et al., 2009). Alguns representantes desse grupo foram isolados de drenagens moderadamente ácidas de minas (Opelt et al., 2007). Valverde et al. (2006) isolaram uma linhagem bacteriana de uma mina contendo alta concentração de fosfato (Mina de Jangada, Brumadinho, MG, Brasil) que com base em caracterizações genotípicas e fenotípicas foram classificadas como uma nova espécie do gênero Burkholderia, designada Burkholderia ferrariae (Valverde et al., 2006). O papel dessas bactérias na geração de DAM requer ainda estudos futuros.

A contaminação ambiental por metais pode comprometer a saúde humana. Várias técnicas foram relatadas para a remoção de metais de sedimentos incluindo lavagem do solo, extração térmica, troca iônica, tratamento eletrocinético, recuperação por evaporação e biorremediação. As técnicas de biorremediação podem ser promissoras e economicamente viáveis comparada às técnicas de tratamento químico. Com esse objetivo, pesquisas de microrganismos que possuem estratégias de sobrevivência em habitats poluídos por metais são de grande relevância no intuito de serem aplicadas na descontaminação de áreas contaminadas.

A solubilização de minerais fosfatados por microrganismos pode ser um campo relevante para o setor agrícola devido à aplicabilidade destes em biofertilização. Além

59 disso, por suas características poderia ser economicamente viável no campo da biomineração.

No caso da Austrália, em particular, mais de 80% do minério de ferro da porção ocidental do país contém um conteúdo médio de fósforo de 0,15% inviabilizando sua exportação. Caso um minério de ferro contenha mais de 0,08% de fósforo, cada aumento de 0,001% no teor do elemento acarreta uma multa de aproximadamente U$0.75/tonelada, diminuindo as margens de lucro das empresas. Naquele país estima-se que as reservas de minério de ferro com teor de fósforo inferior a 0.05% estarão esgotadas dentro de, no máximo, 30 anos. Portanto, para o caso daquele país, o desenvolvimento de uma metodologia de defosforização do minério de ferro é importantíssimo para garantir o futuro de sua indústria mineradora de ferro (Cheng et al., 1999). No Brasil, em regiões próximas à Ouro Preto, na mina de Alegria de propriedade da Samarco Mineração, existem milhares de toneladas de estéril depositadas aguardando uma destinação (Daman, 2005).

A companhia Vale é a maior exportadora de minério de ferro do mundo (80,2 milhões de toneladas em 1999). Em vista do aumento da demanda de minério de ferro, principalmente devido ao crescimento da indústria siderúrgica de países como o Japão, China e Rússia, até 2010 haverá uma demanda de acréscimo na oferta de minério de ferro da ordem de 57 milhões de toneladas. Empresas como a Vale e a MBR têm aumentado seus investimentos a fim de atender essa nova demanda futura.

O mecanismo de solubilização de minerais fosfatados se dá pela acidificação do meio. Os microrganismos produzem ácidos orgânicos através da oxidação de ácido glucônico, que é o principal ácido orgânico produzido pela maioria das bactérias do solo, incluindo Burkholderia sp. A diversidade de bactérias cultiváveis solubilizadoras de fosfato presentes em minerais contendo ferro é relativamente baixa, portanto se torna importante estudar esses microrganismos (Park et al., 2008). Esse ácido gerado biologicamente pode ser consumido na solubilização do fosfato contido no minério de ferro, promovendo a redução nos seus teores de sulfato. De acordo com Johnson (1998), alguns procariotos heterótrofos podem contribuir para a dissolução mineral através da formação de associações comensais com ferro e enxofre-oxidantes, onde eles utilizam compostos orgânicos (células lisadas) provenientes da produção primária realizada pelos autótrofos, “desintoxicando” o ambiente para o grupo mais sensível a esses compostos. A solubilização de minerais fosfatados vem sendo feita por algumas bactérias, que, além disso, estão sendo usadas com sucesso como soluções para várias atividades humanas, como agricultura e mineração. Quando inoculadas artificialmente em um ambiente em particular, microrganismos nativos, como regra geral,

60 competem melhor em termos de adaptação e causam menores distorções do que microrganismos exógenos. Esses fenômenos naturais podem ser otimizados e utilizados com finalidades industriais, mas para isso é necessário acumular conhecimentos sobre a fisiologia desses microrganismos.

Inicialmente, a metodologia empregada seria a biolixiviação do mineral em frascos agitados, vislumbrando no futuro, a aplicação desse método para a lixiviação do mineral em pilhas.

Com relação à banda B, figura 5.8, canaleta 4, a análise por BLAST do sequenciamento apresentou 99% de similaridade com as espécies At. thiooxidans e At. ferrooxidans. As amostras de DAM e seus sedimentos hibridizaram com a sonda ATT223 (Figura 5.9 a 5.12), correspondente ao microrganismo At. thiooxidans, confirmando a presença desses nas amostras relacionadas à DAM. A possibilidade dos clones pertencerem a espécie At. ferrooxidans foi excluída, pois não houve crescimento dessas amostras em meio 9K e além disso, essas amostras foram submetidas à hibridação com sondas moleculares específicas para essa espécie (sonda TF539) e os resultados foram negativos.

A ausência de Acidithiobacillus ferrooxidans nessas amostras é de chamar atenção, pois esse organismo é relatado na literatura como um dos mais frequentes em sistemas ácidos. Nessa drenagem, a ausência dessa bactéria pode estar relacionada ao pH moderadamente ácido (4,3) da amostra original, o que provavelmente provocou a precipitação do ferro férrico e a adsorção dos microrganismos ferro-oxidantes na superfície desses sólidos. O elevado pH pode estar relacionado ainda com a diluição da drenagem em período de chuvas. No mesmo material não foi encontrado também o microrganismo Leptospirillum ferrooxidans relacionado frequentemente à oxidação de Fe+2.

O outro clone sequenciado proveniente da banda marcada como C, 3ª canaleta, Figura 5.8, apresentou apenas 94% de similaridade com um clone DX59 do gene 16S ribosomal RNA inserido no Gen Bank. Esse clone é proveniente de uma bactéria isolada de uma amostra ambiental.

Um dendograma foi construído a partir dos resultados obtidos no sequenciamento e está representado na figura 5.7

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Figura 5.7. Dendograma das amostras sequenciadas a partir do material da DAM.

As amostras de DAM e seus sedimentos hibridizaram com a sonda ATT223, correspondente ao microrganismo At. thiooxidans, indicando a presença desse na amostra. As Figuras 5.8 a 5.11 ilustram a reação de hibridação.

Acidithiobacillus ferrooxidans GD1- 3 Acidithiobacillus thiooxidans BY-0506

Acidithiobacillus thiooxidans BY-03

Acidithiobacillus thiooxidans YP-2

Acidithiobacillus thiooxidans DX-3

Acidithiobacillus thiooxidans B-53 Uncultured Bacterium clone DSJB11 Uncultured Bacterium clone DSJB69

Banda B - DAM Banda C - DAM

Uncultured Bacterium Clone DBS 41 Uncultured bacterium clone DX59 Uncultured Bacterium Clone GXDC-34 Burkholderia sp U1-4 (FJ560474)

Iron-reducing Bacterium enrichment culture clone HN100

Burkholderia sp. GP25-8 (DQ465451) Burkholderia sp. GP A6.2 (AF247491) Burkholderia sp. ny10 (FJ603036) Burkholderiaceae Bacterium KV1894-01 (DQ490299) Banda A - DAM Burkholderiaceae Bacterium KVD 1894-10 (DQ490307) Burkholderia ferrariae Acidithiobacillus caldus (FM955616) 0,2

62

Figura 5.8 - Microscopia de Epifluorescência – Coloração com DAPI –Cultivo da

DAM em meio 0K.

Figura 5.9 - Microscopia de Epifluorescência - Sonda ATT223 – Hibridação de

cultivo da DAM em meio 0K com sonda correspondente a Acidithiobacillus

63

Figura 5.10 - Microscopia de Epifluorescência - Coloração com DAPI –Cultivo dos

sedimentos da DAM em meio 0K.

Figura 5.11- Microscopia de Epifluorescência - Sonda ATT223 – Hibridação de

cultivos de sedimento da DAM em meio 0K com sonda correspondente a

64

5.7.2. Pirita, Pirita Oxidada e Afloramento de Enxofre - Mina de Pirita/OP/MG

Sabe-se que os microrganismos estão presentes não apenas na fração líquida, mas também na superfície sólida das partículas minerais (Coram-Uliana et al., 2006; Schippers et al., 1996). No presente trabalho, lamentavelmente, não foi possível analisar a diversidade presente nesses minerais. O DNA das amostras de pirita, pirita oxidada e afloramento de enxofre não cultivadas não foi amplificado com sucesso e, dessa forma, foi necessário utilizar os cultivos desse material em meio 0K. Tal fato pode ser explicado pelas dificuldades no desprendimento das células aderida à superfície do mineral e pelas diversas lavagens e centrifugações realizadas, que pode ter acarretado na perda de células.

Analisando-se os cultivos de pirita, pirita oxidada e afloramento de enxofre por DGGE, obteve-se apenas uma banda (Figura 5.12) indicativa de apenas uma única população microbiana. Entretanto, pelo fato de ter sido empregado o meio 0K pode ter havido seleção de espécies. A banda originada dessas amostras apresentou perfil compatível com a cepa At. thiooxidans. As bandas foram recortadas, eluídas no tampão da TaqPolimerase a concentração 1X, re-amplificadas e submetidas a uma nova DGGE afim de comparação confirmando o mesmo perfil de corrida. Os fragmentos do gene RNAr 6S foram amplificados, purificados e clonados. Os clones seqüenciados a partir da banda de pirita foram sequenciados indicando que a banda era 99 % similar à espécie At. thiooxidans. As amostras de pirita foram também hibridizadas com sonda ATT223 e apresentaram fluorescência com essa sonda, confirmando a presença desses microrganismos nessas amostras (figuras 5.13 e 5.14).

É importante ressaltar que a população foi selecionada pelo fato de terem sido empregados cultivos e, portanto, ressaltando a importância das técnicas independentes de cultivo para manter a diversidade natural das amostras.

As bandas provenientes das amostras de pirita oxidada e afloramento de enxofre não foram clonadas porque não obteve-se ampplificação. Mas ambas apresentaram perfil de corrida semelhante à At. thiooxidans e hibridizaram com a sonda ATT223, correspondente à presença dessa cepa (Figuras 5.15 a 5.18).

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Figura 5.12. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante das amostras de pirita proveniente da mina de pirita/OP/MG. (1) Pirita. (2) Afloramento de Enxofre. (3) Pirita Oxidada. (4) Pirita. (5) At. Thiooxidans.

A presença de At. thiooxidans era esperada nesse mineral, visto se tratar de um mineral sulfetado. Tais microrganismos vem sendo isolados rotineiramente de minerais sulfetados e aplicados em processos de biorremediação para minerais de baixo teor.

Em nosso trabalho não foi possível obter uma cultura pura de At. thiooxidans, pois não foi possível obter o crescimento desses nos meios sólidos que empregamos.

66

Figura 5.13 - Microscopia de Epifluorescência - Coloração com DAPI – Cultivo dos cultivos de pirita em meio 0K.

Figura 5.14 - Microscopia de Epifluorescência - Sonda ATT223 – Hibridação de

cultivos de pirita em meio 0K com sonda correspondente a Acidithiobacillus

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Figura 5.15 - Microscopia de Epifluorescência - Coloração com DAPI – Cultivo de

pirita oxidada em meio 0K.

Figura 5.16 - Microscopia de Epifluorescência - Sonda ATT223 – Hibridação de

cultivos de pirita oxidada em meio 0K com sonda correspondente a Acidithiobacillus

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Figura 5.17 - Microscopia de Epifluorescência - Coloração com DAPI – Cultivo de

afloramento de enxofre em meio 0K.

Figura 5.18 - Microscopia de Epifluorescência - Sonda ATT223 – Hibridação de

cultivos de afloramento de enxofre em meio 0K com sonda correspondente a

69

5.7.3. Colunas de lixiviação

O material bruto recolhido das colunas e seus cultivos foram, após a extração de DNA total e amplificação de fragmentos de DNAr 16S, analisados por DGGE. A presença de At. ferrooxidans e At. thiooxidans foi confirmada pela análise do sequenciamento dos clones obtidos a partir das bandas visualizadas no gel de poliacrilamida (Figura 5.1 – canaleta 4). A análise do sequenciamento realizado a partir da banda D mostrou 100% de similaridade dessa sequência com a espécie At. ferrooxidans. A presença de outros microrganismos também pôde ser vista na DGGE do material das colunas independente de um cultivo prévio que mostrou a presença de bandas distintas às cepas correspondentes à At. thiooxidans, At. ferrooxidans e L. ferrooxidans (Figura 5.19). O cultivo do material das colunas em meios 9K e OK também mostrou a presença de bactérias ferro-oxidantes e enxofre-oxidantes no material.

Os cultivos em meio 9K apresentaram hibridação com as sonda TF539 reafirmando a presença de At. ferrooxidans nesse sistema (Figura 5.20 e 5.21). Os cultivos desse mesmo material em meio 0K hibridizaram com a sonda ATT223 indicando a presença de At. thiooxidans (Figura 5.26 e 5.27). Este resultado coincide com o que foi obtido através da DGGE dessa amostra quando se compararam o padrão de bandas da cepa pura de At. ferroxidans e At. thiooxidans com o apresentando por essa amostra indicando a presença destas espécies. Em experimentos posteriores, o material da coluna foi também fixado e hibridizado contra as 3 cepas partindo-se da amostra original sem o cultivo em meio 9K (Figura 5.22 a 5.25). Viu-se a grande abundância de At. ferrooxidans, o que deve estar relacionado com a baixa quantidade dessa espécie na amostra. É relevante ressaltar o fato de o pH de saída do material das colunas (1,98) ser extremamente favorável ao crescimento de At. ferrooxidans nesse material.

Nas colunas de lixiviação, uma combinação de bactérias ferro e enxofre oxidantes está presente em cada amostra, o que reforça o conceito que a oxidação mineral é otimizada na presença de um consórcio microbiano mais do que em culturas puras. A bactéria At. ferrooxidans foi detectada somente em ambientes com temperaturas entre 20- 35ºC, fato este que é consistente com a faixa de temperatura de crescimento desses microrganimos (Nemati et al., 1998). Atualmente é sabido que o crescimento de At. ferrooxidans não é favorecido em processos onde a concentração de ferro férrico excede, em muito, a concentração de ferro ferroso (alto potencial redox).

70 Vasquez e Espejo (1997) encontraram At. thiooxidans como população dominante quando analisaram populações bacterianas de uma planta de biolixiviação de cobre comercial (Vásquez e Espejo, 1997).

Figura 5.19. Gel de acrilamida bis-acrilamida corado com SYBR-Gold – Gradiente 35 -70% - Amostras: (1) Cultivo de Pirita Oxidada; (2) Cultivo de Afloramento de enxofre; (3) DAM; (4) Colunas de lixiviação; (5) Acidithiobacillus thiooxidans; (6)

Acidithiobacillus ferrooxidans.

35%

70%

1 2 3 4 5 6

D E

71

Figura 5.20 - Microscopia de Epifluorescência - DAPI - Cultivo das colunas em meio 9K e hibridação com sonda para Acidithiobacillus ferrooxidans.

Figura 5.21 - Microscopia de Epifluorescência - Sonda TF539 - Cultivo das colunas em meio 9K e hibridação com sonda para Acidithiobacillus ferrooxidans.

72

Figura 5.22 - Microscopia de Epifluorescência - DAPI – Material das Colunas em

meio e hibridação com sonda para Acidithiobacillus ferrooxidans.

Figura 5.23 - Microscopia de Epifluorescência - Sonda TF539 – Material das Colunas

73

Figura 5.24 - Microscopia de Epifluorescência - DAPI - Cultivo das colunas em meio 9K e hibridação com sonda para Acidithiobacillus ferrooxidans.

Figura 5.25 - Microscopia de Epifluorescência - Sonda TF539 - Cultivo das colunas em meio 9K e hibridação com sonda para Acidithiobacillus ferrooxidans.

74

Figura 5.26 - Microscopia de Epifluorescência - DAPI – Hibridação de cultivo das

colunas de lixiviação mantidas em meio 0K com sonda correspondente a

Acidithiobacillus thiooxidans.

Figura 5.27 - Microscopia de Epifluorescência - Sonda ATT223 – Hibridação de

cultivo das colunas de lixiviação mantidas em meio 0K com sonda correspondente a

Acidithiobacillus thiooxidans

75

5.7.4. Reator contínuo

Os produtos da PCR obtidos a partir do DNA total das amostras do reator contínuo de lixiviação de zinco apresentaram, na análise do gel de poliacrilamida, bandas condizentes com os perfis característicos de At. ferroxidans (Banda F - Figura 5.28), At. thiooxidans (Banda G - Figura 5.28) e L. ferrooxidans . Não foi possível, entretanto confirmar a presença dessas espécies devido ao fato que as bandas recortadas no gel (Figura 5.28) não foram amplificadas com sucesso. Quando se compara o perfil eletroforético apresentado pelas amostras das colunas de lixiviação com essa amostra, vemos que há diferença entre as duas, embora se saiba que o inóculo utilizado no início de operação dos dois sistemas tenha sido o mesmo, proveniente de uma mesma mina de sulfeto. As condições particulares, como a lixiviação de sulfetos de natureza distinta em cada um dos sistemas de biolixiviação exerceram ou podem ter exercido pressão seletiva sobre o inóculo inicial, causando as diferenças aqui observadas. Esse material, não hibridizou com as sondas TF539, LF665 e ATT223 (Figura 5.29 e 5.30), não sendo possível confirmar a presença das espécies At. ferrooxidans, L. ferrooxidans e At. thiooxidans, fato que pode ser devido ao número insuficiente de células.

76

Figura 5.28. Gel de acrilamida bis-acrilamida corado com SYBR-Gold – Gradiente 35 -70% - (1) Cultivo das colunas em meio 0K. (2) At. thiooxidans. (3) At. thiooxidans. (4) Cultivo de DAM em meio 0K. (5) At. ferrooxidans. (6) Colunas de lixiviação. (7) Colunas de lixiviação. (8) At. thiooxidans. (9) Reator contínuo (10) Reator contínuo.

Figura 5.29 – Microscopia de Epifluorescência – DAPI - Colunas de lixiviação sem

cultivo prévio.

Figura 5.30 – Microscopia de Epifluorescência – Sonda TF539 - Colunas de lixiviação sem cultivo prévio.

77 A tabela 5.5 resume os resultados obtidos na análise da diversidade microbiana das amostras coletadas nos diferentes ambientes por meio de diferentes técnicas.

Tabela 5.5. Microrganismos identificados nas amostras coletadas. Colunas de

In document Code-switching in The Wire (sider 113-0)