A parede celular está relacionada à resistência de agentes estressores e drogas quimioterápicas em A. fumigatus [30]. Assim, as linhagens selvagem, mutante e complementante foram expostas a alguns destes agentes e drogas com o intuito de entender a função de RlmA na manutenção da integridade da parede celular neste patógeno. Os testes foram realizados em placas de Petri contendo meio completo sólido YG na presença e ausência dos agentes testados. Uma das drogas testadas foi a cafeína (CAFF). A cafeína ainda não possui um mecanismo de ação completamente elucidado, porém acredita-se que esta droga tem como alvo o complexo de proteínas TOR quinases, cuja
inibição em S. cerevisiae acidentalmente ativa a cascata Pkc1-Mpk1, e induz uma rápida fosforilação do Mpk1 acompanhada por uma ativação do fator de transcrição Rlm1 [161]. Esta droga foi testada em diversas concentrações, onde foi possível observar que a linhagem mutante apresentou pequena sensibilidade equiparada à linhagem selvagem (figura 11A). Agentes classicamente usados para identificar a sensibilidade de mutantes com alteração na via da integridade da parede celular são o CFW e o CR. Ambos compostos possuem dois grupos de ácido sulfônico, de tal forma que exercem sua atividade somente quando estão solubilizados em condições ligeiramente básicas ou neutras, quando um dos seus grupos de ácido sulfônico se torna negativamente carregado [162]. Em fungos CFW e CR se ligam preferencialmente às cadeias de quitinas, interferindo na montagem da parede celular. Estes, ao se ligarem às quitinas impedem a ligação de β(1,3) glucana e β(1,6) glucana. Como resultado, a parede celular se torna enfraquecida. A presença de CFW ou CR também resulta em entumescimento ou lise da extremidade de hifas dos fungos filamentosos, como A. niger, resultando no enfraquecimento da parede e alteração da pressão interna de turgor [163]. Na figura 11A observa-se o aumento da susceptibilidade da linhagem ∆rlmA a estes agentes. Menores concentrações de CR e CFW também foram testadas e indicaram que a diminuição da tolerância da linhagem ΔrlmA para CFW e CR ocorreu quando as concentrações eram tão baixas quanto 25 μg/mL e 30 μg/mL, respectivamente (APÊNDICE A, figura A1).
O dodecil sulfato de sódio (SDS) é um detergente aniônico, sua ação na célula fúngica se dá possivelmente pela ação direta na membrana plasmática e pela desnaturação local de proteínas da membrana e da parede celular, porém, sabe-se que mutantes com deficiência da formação de parede celular apresentam maior sensibilidade a este agente [30]. Um aumento da susceptibilidade a este agente na linhagem mutada ∆rlmA pode ser observado na figura 11A.
As equinocandinas semissintéticas (por exemplo, caspofungina e anidulafungina) possuem como alvo a parede celular fúngica, através da inibição da síntese de β(1,3) glucana pela inibição não competitiva da enzima -1,3 glucana sintase (Fks1). Essas drogas induzem alterações morfológicas e
de crescimento devido à formação deficiente da parede celular, e demonstraram potentes valores de CIM em ensaios epidemiológicos [21], embora clinicamente as equinocandinas são drogas de segunda escolha para tratamento da aspergilose pulmonar invasiva. As linhagens tiveram sua sensibilidade avaliada às equinocandinas anidulanfungina (AF) e caspofungina (CASP) tendo sido observado aumento da sensibilidade a estas drogas no mutante rlmA como pode ser observado na figura 11A.
A limitação de nutrientes é um dos estresses mais significativos encontrados por microrganismos na natureza [164]. Para determinar se RlmA estaria relacionado à proteção de A. fumigatus das consequências deletérias da depleção de cátions divalentes, realizou-se o teste de crescimento das linhagens selvagem, mutante ΔrlmA e complementante na presença do EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), um agente quelante de cálcio e magnésio, e foi possível observar que a linhagem ΔrlmA foi mais sensível à privação de metal causada pelo agente quelante EDTA (1 mM) (figura 11A).
A nikomicina Z é uma droga que promove a inibição da síntese de quitina atuando como análogo competitivo do substrato UDP-N-acetilglucosamina no sítio catalítico [165]. A quitina é um importante componente para a formação da parede celular em Aspergillus ssp. [12]. Como um teste inicial para verificarmos se a deleção de rlmA estaria levando a redução da síntese de quitina na parede celular e portanto causando uma maior sensibilidade a esta drogas, linhagens foram cultivadas na presença deste agente onde foi possível verificar que a deleção de rlmA promoveu um aumento da sensibilidade de A. fumigatus a nikomicina Z (figura 11B) podendo desta forma relacionar RlmA como sendo um dos ativadores das enzimas de biossíntese de quitina em A. fumigatus.
Figura 11: Teste de sensibilidade do mutante ∆rlmA a diferentes drogas que causam estresse de parede celular. (A) A determinação da sensibilidade às drogas estressoras foi realizada através da técnica de drop-out. Diluições seriadas da suspensão de conídios de cada linhagem foram inoculadas em placa de Petri contendo meio completo sólido YG com as concentrações das drogas determinadas. As placas foram incubadas a 37 ºC por 24 horas. Observa-se que a linhagem ∆rlmA possui uma maior sensibilidade a ação destes agentes.
(B) 1×105 conídios das linhagens foram inoculados em placa de 24 poços contendo meio sólido
completo YG na presença das concentrações indicadas de nikomicina Z a 37 ºC por 48 horas. Observa-se que a linhagem ∆rlmA possui uma maior sensibilidade a ação deste agente.
Como mostrado CR e CFW evidenciam os efeitos fenotípicos mais pronunciados sobre o mutante ∆rlmA. O fenótipo de aumento da sensibilidade a estes agentes e também à cafeína pode ser parcialmente resgatado em meio mínimo contendo o estabilizador osmótico D-sorbitol (1,2 M) (figura 12), o que sugere um possível defeito da parede celular na linhagem mutante ΔrlmA. Entretanto não foi possível observar fenótipos de lise no mutante ΔrlmA na
presença de dano da parede celular causado por CR ou CFW em análises microscópicas (dados não mostrados).
Figura 12: A sensibilidade às drogas que causam estresse de parede é parcialmente revertida na presença do estabilizador osmótico D-sorbitol. Diluições seriadas da suspensão de conídios de cada linhagem foram inoculadas em placa de Petri contendo meio mínimo glicose 1 % e meio mínimo glicose 1 % acrescido de sorbitol 1,2 M, ambos com as concentrações de drogas determinadas. As placas foram incubadas a 37 ºC por 48 horas.
A remoção enzimática da parede celular leva à formação de protoplastos esféricos e à perda do crescimento polarizado. Entretanto, se houver nova deposição de parede celular o eixo polarizado se restabelece [166]. A indução do estado de protoplastos nestes germinantes é um evento necessário, utilizado para as transformações em A. fumigatus. A alteração na formação da parede celular em A. fumigatus pode alterar a capacidade de remoção enzimática da parede celular neste patógeno. Assim, como uma abordagem indireta para investigar a composição e a arquitetura da parede celular na linhagem ΔrlmA, hifas das linhagens ΔrlmA, selvagem e complementante ΔrlmA::rlmA+foram submetidas à digestão enzimática por Lallzyme MMX™, um
mix enzimático composto por glucanases e pectinases de Trichoderma sp. e A. niger. Uma alíquota da reação de protoplastização foi retirada a cada 2 horas em um intervalo de 6 horas de incubação, e os protoplastos obtidos em
cada linhagem testada neste intervalo foram quantificados em câmara de Neubauer. Desta forma foi possível observar que a linhagem mutante ∆rlmA possui uma capacidade de 79,1 % e 81,3 % de protoplastização maior que a linhagem selvagem após 4 e 6 horas de reação, respectivamente, como pode ser observado na figura 13A, indicando que a parede celular do mutante ΔrlmA era muito mais susceptível à degradação enzimática. Este resultado sugere que a linhagem mutante possuía uma composição de carboidratos modificados, o que levaria a uma maior acessibilidade à digestão por via enzimática.
Devido a este resultado e aos testes fenotípicos que demonstraram que rlmA está relacionado à resistência a agentes agressores da parede celular como CR e CFW (figura 11), tornou-se interessante continuar os estudos analisando a composição e a morfologia da parede celular no mutante ΔrlmA. Para investigar se era a modificação da organização dos carboidratos que estaria afetando a formação da parede celular em A. fumigatus, o conteúdo de β(1,3) glucana e quitina foram avaliados na linhagem mutante ΔrlmA, na linhagem selvagem e na complementante ΔrlmA::rlmA+ através da ligação de
dectina-1 solúvel e CFW, respectivamente. A intensidade de marcação com dectina-1 e coloração CFW por área fúngica foi, respectivamente, 91,8 % e 43,5 % mais elevado no mutante ΔrlmA do que na linhagem selvagem e complementante (figura 13B-C).
O biofilme se trata de uma comunidade de microrganismos associados e firmemente aderidos a uma superfície por meio de uma matriz extracelular de polímeros (substâncias de cadeia longa). Esta matriz é permeada por canais os quais permitem a passagem de substâncias, colocando os microrganismos ali presentes em contato com o ambiente mais externo. Uma das vantagens dos biofilmes é conferir maior resistência a estresses biológicos, químicos e físicos dos microrganismos. Uma consequência disso é o baixo sucesso no uso de antibióticos e biocidas contra microrganismos infecciosos organizados na forma de biofilme [167].
Embora os padrões de formação de biofilmes por diferentes organismos sejam similares, em fungos filamentosos o padrão da formação deste ainda é desconhecido. Fanning and Mitchell [168] propuseram um modelo da formação de biofilme nestes microrganismos que é divido em 6 estágios que vão da formação inicial de biofilme que compreende a adesão dos esporos ou fragmentos de hifas em uma superfície, até o estágio de dispersão, no qual são liberados esporos ou fragmentos do biofilme, que atuariam como novos propágulos, podendo dar origem a novos biofilmes. A parede conidial é pigmentada por hidrofobinas denominadas rodlets, estas estão relacionadas à adesão em A. fumigatus [168].
Sendo a parede celular o suporte para estas moléculas relacionadas à adesão em A. fumigatus [24, 169] buscou-se investigar se a perda da função de RlmA poderia causar alguma alteração na adesão de A. fumigatus. Para isto, a capacidade da formação inicial de biofilme nas linhagens foi quantificada pelo ensaio de adesão em placas de poliestireno. Foi observada uma redução da capacidade de formação de biofilme na linhagem ∆rlmA como mostrado na figura 13D.
Figura 13: A perda da função de RlmA causa aumento da hidrólise enzimática da parede celular, maior detecção de β(1,3) glucana e quitina, e diminuição da formação de biofilme. (A) 100 mg de micélio foram incubados em 50 mL da mistura de digestão contendo Lallzyme MMX™ nos tempos de incubação indicados. Os protoplastos foram quantificados em uma câmara de Neubauer (*p ≤ 0,01). Os conídios de A. fumigatus foram cultivados em meio líquido para o estágio de hifas, estas foram fixadas por UV e coradas com dectina-1 solúvel ou CFW para detectar o conteúdo de β(1,3) glucana exposta (B) ou de quitina (C). A intensidade de coloração foi calculada pela média da quantidade de coloração relativa à área total de cada célula fúngica utilizando o software ImageJ®. Os experimentos foram realizados em triplicata, e
os resultados são exibidos como valores da média ± desvio padrão (* p ≤ 0,05). (D) A formação de biofilme foi avaliada por absorbância do cristal violeta a 570 nm e expressa como a porcentagem de adesão considerando 100 % para a linhagem selvagem. Os experimentos foram realizados em quintuplicata e os resultados são as médias ± desvio padrão (*p ≤ 0,05).
Subsequentemente, investigou-se também a organização da parede celular no mutante ΔrlmA por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os germinantes da linhagem ΔrlmA possuíam a parede celular cerca de duas vezes mais espessa do que a parede celular observada na linhagem selvagem e na linhagem complementante (figura 14).
Figura 14: Germinantes da linhagem ΔrlmA apresentam parede celular mais espessa. (A) A linhagem selvagem, mutante ΔrlmA e complementante ΔrlmA::ΔrlmA+ foram cultivadas
em meio completo YG e preparados para análise de TEM. Barras = 200 nm. (B) Medida da espessura da parede celular dos germinantes. Os valores são expressos como média ± desvio padrão de 100 diferentes germinantes. * p ≤ 0,05 (One Way ANOVA).
Existem diferenças estruturais marcantes na composição da parede celular de conídios e da fase filamentosa (hifa) do A. fumigatus. A parede celular conidial é pigmentada e apresenta uma superfície altamente hidrofóbica. Esta característica é conferida pela presença de melanina e de agregados de proteínas denominadas hidrofobinas [33, 170]. As hidrofobinas de classe I, com baixo peso molecular (10 a 20 kDa) estão organizadas na superfície dos conídios de A. fumigatus formando uma estrutura denominada rodlet [171]. Esta estrutura é característica dos conídios dormentes e se perdem à medida que o conídio germina e se diferencia em hifas. Estas podem estar envolvidas em várias funções, como adesão inicial às células do hospedeiro, proteção contra agentes químicos, enzimáticos e células fagocíticas no nicho ecológico e, além disso, facilitam a dispersão dos conídios por correntes de ar [172]. Para verificar a arquitetura da parede externa dos conídios e possíveis alterações na distribuição dos rodlets, conídios da linhagem selvagem, mutante ΔrlmA e complementante ΔrlmA::rlmA+ foram
analisados por microscopia eletrônica de varredura (SEM). Os resultados mostraram uma redução na distribuição de rodlets no mutante ΔrlmA em relação a linhagem selvagem e complementante ΔrlmA::rlmA+ (figura 15A). De
fato, a extração de hidrofobinas presentes na superfície dos conídios com ácido fluorídrico (HF) seguida de SDS-PAGE 15 % permitiu validar a observação de que menos hidrofobinas são acumuladas no mutante rlmA (figura 15B).
Figura 15: Análise da superfície dos conídios de A. fumigatus e quantificação da hidrofobina na linhagem selvagem e mutante ΔrlmA. (A) Os conídios foram crescidos em meio completo sólido YG por 48 horas, em seguida coletados através de uma fita de carbono, fixados no porta amostra metálico e recobertos por sputtering com ouro, para posterior análise no microscópio eletrônico de varredura (Inspect S 50, FEI). Os aumentos observados são de 15.000 × e 40.000 × respectivamente. (B) Gel de SDS-PAGE 15 % corado com prata contendo extratos de conídios tratados com ácido hidrofluorídrico da linhagem selvagem e do mutante
ΔrlmA. O número de conídios submetido à extração de hidrofobinas foi validado através da
contagem de UFC em meio YG sólido como normalizador do experimento. RodA corresponde à RodA nativa e RodAp* a RodA parcialmente degradada.
Em conjunto, esses resultados sugerem que a linhagem mutante ΔrlmA possui uma organização da parede celular modificada que afeta várias respostas aos estímulos ambientais.