3.13.33.1 ChIP-qPCR utilizando a resina GFP-Trap®
Para as análises de ChIP-qPCR as linhagens de A. fumigatus utilizadas contendo o fator de transcrição de interesse fusionado na porção C-terminal com a GFP foram crescidas em condições pré-estabelecidas de cada experimento. Ao final da incubação o micélio foi transferido para o tampão de cross-linking (seção 3.8.28.1) e incubado a 30 °C por 20 minutos a 100 rpm. Após os 20 minutos, foi adicionada glicina na concentração de 125 mM (seção 3.8.28.2) e a amostra foi incubada a 30 °C por 10 minutos a 100 rpm para parar a reação de cross-linking. O micélio foi coletado com o auxílio de uma bomba a vácuo, lavado com água deionizada e submetido ao congelamento instantâneo com nitrogênio líquido. Até o momento da lise física por ultrassom, o micélio foi armazenado em freezer a -80 °C.
Para romper a parede celular do fungo, os micélios congelados foram triturados em nitrogênio líquido com auxílio de almofariz e pistilo até a obtenção de um pó fino e uniforme. O micélio foi transferido para um tubo de centrífuga de fundo triangular de 50 mL (a quantidade de micélio adicionada foi o suficiente para ocupar o espaço do fundo triangular do tubo), posteriormente foi adicionado CLB (seção 3.8.28.3) em quantidade suficiente para que a suspensão micélio + CLB (seção 3.8.28.3) não ficasse muito fluída nem muito viscosa, cerca de 6 mL. A suspensão foi agitada vigorosamente por 30 segundos, e após foi incubada por 10 minutos à temperatura ambiente e 10 minutos no gelo. Após a incubação 2 mL desta suspensão foram transferidos para um tubo de centrífuga de 15 mL, e a amostra sofreu lise física por ultrassom com intensidade de 40 % com ciclos de 30 segundos ON e 30 segundos OFF, em banho de gelo. O tempo total de lise foi de 30 minutos, sendo que a cada 10 minutos a reação foi interrompida para a adição de gelo, de forma a manter sempre uma baixa temperatura da amostra durante a lise.
Após a lise física por ultrassom, as amostras foram centrifugadas a 10000 g por 5 minutos, a 4 °C, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. 60 µL do sobrenadante foram transferidos para um tubo de micro centrífuga para a realização do reverse cross-linking para avaliação da eficiência da lise.
Para o reverse cross-linking foi adicionado 60 µL da amostra lisada a 140 µL do tampão de eluição preparado no momento do uso e a amostra foi incubada no banho seco a 65 °C por 16 horas. No dia seguinte a amostra foi tratada com 2,5 µg de RNAse A (Qiagen) à temperatura ambiente por 60 minutos e o DNA foi purificado utilizando kit de purificação (GE Healthcare), conforme a recomendação do fabricante. As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose para avaliação da eficiência da lise. Os fragmentos de DNA deveriam estar entre 200 e 600 pares de base no máximo.
Para a imunoprecipitação foram utilizados 20 µL da resina GFP-Trap® por amostra. A resina foi homogeneizada sob agitação vigorosa e posteriormente transferida para um tubo de micro centrífuga. A resina foi equilibrada no CLB (seção 3.8.28.3) antes da incubação, para isto foram adicionados 400 µL de CLB (seção 3.8.28.3) a cada tubo de micro centrífuga contendo 20 µL da resina e ela foi centrifugada a 5000 g por 30 segundos. Este procedimento foi repetido por 3 vezes, a temperatura ambiente. 1 mL do DNA lisado foi adicionado à resina previamente equilibrada, e incubado a 4 °C sob leve rotação utilizando o HulaMixer® Sample Mixer. Após a incubação, a resina foi lavada novamente por 3 vezes com o tampão CLB (seção 3.8.28.3) conforme descrito anteriormente.
O DNA foi eluído da resina GFP-Trap® utilizando 50 µL do tampão de eluição (seção 3.8.28.5) preparado no momento do uso, e este foi incubado a 65 °C por 10 minutos. A seguir a amostra foi centrifugada a 5000 g por 30 segundos e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo de micro centrífuga. Uma segunda eluição foi realizada adicionando-se novamente 50 µL do tampão de eluição à resina GFP-Trap® ligada ao DNA, esta eluição foi realizada por 16 horas a 65 °C, e o sobrenadante após centrifugação a 5000 g por 30 segundos foi transferido para o tubo de micro centrífuga que continha a amostra da primeira eluição. As amostras foram incubadas a 65 °C por 16 horas conforme descrito acima, para o reverse cross-linking, e no dia seguinte
após o reverse cross-linking elas foram submetidas à digestão com RNAse A e o DNA foi posteriormente purificado utilizando o kit de purificação de DNA de acordo com as recomendações do fabricante. O volume final de eluição do DNA foi de 30 µL. Para cada reação de RT-qPCR foi utilizado 0,4 µL do DNA eluído.
3.13.33.2 ChIP-qPCR utilizando Dynabeads protein A® (Thermo Scientific, 10001D)
Para as análises de ChIP-qPCR as linhagens de A. fumigatus utilizadas contendo o fator de transcrição de interesse fusionado na porção C-terminal com o epítopo 3xFLAG foram crescidas em condições pré-estabelecidas de cada experimento. Ao final da incubação o micélio foi transferido para o tampão de cross-linking (seção 3.8.28.1) e incubado a 30 °C por 20 minutos a 100 rpm. Após os 20 minutos, foi adicionada glicina na concentração de 125 mM (seção 3.8.28.2) e a amostra foi incubada a 30 °C por 10 minutos a 100 rpm para parar a reação de cross-linking. O micélio foi coletado com o auxílio de uma bomba a vácuo, lavado com água deionizada e submetido ao congelamento instantâneo com nitrogênio líquido. Até o momento da sonicação, o micélio foi armazenado em freezer a -80 °C.
Para romper a parede celular do fungo, os micélios congelados foram triturados em nitrogênio líquido com auxílio de almofariz e pistilo até a obtenção de um pó fino e uniforme. O micélio foi transferido para um tubo de centrífuga de fundo triangular de 50 mL (a quantidade de micélio adicionada foi o suficiente para ocupar o espaço do fundo triangular do tubo), posteriormente foi adicionado CLB (seção 3.8.28.3) em quantidade suficiente para que a suspensão micélio + CLB (seção 3.8.28.3) não ficasse muito fluída nem muito viscosa, cerca de 6 mL. A suspensão foi agitada vigorosamente por 30 segundos, e após foi incubada por 10 minutos à temperatura ambiente e 10 minutos no gelo. Após a incubação 2 mL desta suspensão foram transferidos para um tubo de centrífuga de 15 mL, e a amostra sofreu lise física por ultrassom com intensidade de 40 % com ciclos de 30 segundos ON e 30 segundos OFF, em banho de gelo. O tempo total de lise foi de 30 minutos, sendo que a cada 10 minutos a reação foi interrompida para a adição de gelo, de forma a manter sempre uma baixa temperatura da amostra durante a lise.
Após a lise física por ultrassom, as amostras foram centrifugadas a 10000 g por 5 minutos, a 4 °C, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. 60 µL do sobrenadante foram transferidos para um tubo de micro centrífuga para a realização do reverse cross-linking para avaliação da eficiência da lise.
Para o reverse cross-linking foi adicionado 60 µL da amostra lisada a 140 µL do tampão de eluição (seção 3.8.28.5) preparado no momento do uso e a amostra foi incubada no banho seco a 65 °C por 16 horas. No dia seguinte a amostra foi tratada com 2,5 µg de RNAse A (Qiagen) à temperatura ambiente por 60 minutos e o DNA foi purificado utilizando kit de purificação (GE Healthcare), conforme a recomendação do fabricante. As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose para avaliação da eficiência da lise. Os fragmentos de DNA deveriam estar entre 200 e 600 pares de base no máximo. Para a imunoprecipitação foram utilizados 20 µL da resina Dynabeads protein A® por amostra. A resina foi homogeneizada sob agitação vigorosa e posteriormente transferida para um tubo de micro centrífuga. A resina foi equilibrada por 5 minutos a 4 °C no CLB (seção 3.8.28.3) antes da incubação, para isto foram adicionados 500 µL de CLB (seção 3.8.28.3) a cada tubo de micro centrífuga contendo 20 µL da resina, estas foram posteriormente incubadas a 4 °C sob leve rotação utilizando o HulaMixer® Sample Mixer, a resina foi acoplada a DynaMag™ magnet rack, e o sobrenadante foi removido com o auxílio de uma micropipeta. Este procedimento foi repetido por duas vezes. Em seguida 3 µL do anticorpo anti FLAG (Sigma Aldrich, F1804) diluído em 100 µL da solução de bloqueio (seção 3.8.28.4), esta solução foi adicionada à Dynabeads protein A® e estes foram posteriormente incubados por 16 horas a 4 °C sob leve rotação utilizando o HulaMixer® Sample Mixer. Após a incubação a resina foi lavada por 5 minutos a 4 °C no CLB (seção 3.8.28.3), para isto foram adicionados 500 µL de CLB (seção 3.8.28.3) a cada tubo de micro centrífuga contendo 20 µL da resina ligado ao anticorpo anti FLAG e, estes foram posteriormente incubados a 4 °C sob leve rotação utilizando o HulaMixer® Sample Mixer, a resina foi acoplada a DynaMag™ magnet rack, e o sobrenadante foi removido com o auxílio de uma micropipeta. Este procedimento foi repetido por 3 vezes. Imediatamente, após a lavagem 1 mL do lisado foi adicionado à resina, e incubado a 4 °C por 16 horas sob leve
rotação utilizando o HulaMixer® Sample Mixer. Após a incubação, a resina foi lavada novamente por 3 vezes com o tampão CLB (seção 3.8.28.3) conforme descrito anteriormente.
O DNA foi eluído da resina Dynabeads protein A® utilizando 50 µL do tampão de eluição (seção 3.8.28.5) preparado no momento do uso, e este foi incubado a 65 °C por 10 minutos. A seguir a amostra foi acoplada a DynaMag™ magnet rack, e o sobrenadante foi removido com o auxílio de uma micropipeta. Uma segunda eluição foi realizada adicionando-se novamente 50 µL do tampão de eluição à resina ligada ao DNA, esta eluição foi realizada por 16 horas a 65 °C, após a eluição a amostra foi acoplada a DynaMag™ magnet rack, e o sobrenadante foi removido com o auxílio de uma micropipeta. As amostras foram incubadas a 65 °C por 16 horas conforme descrito acima, para o reverse cross-linking, e no dia seguinte após o reverse cross-linking elas foram submetidas à digestão com RNAse e o DNA foi posteriormente purificado utilizando o kit purificação de DNA de acordo com as recomendações do fabricante. O volume final de eluição do DNA foi de 30 µL. Para cada reação de RT-qPCR foi utilizado 0,4 µL do DNA eluído.