4 INFORMASJON OM SYSTEMATISK RISIKO I
4.5 Verdsetting av risikotillegg gjennom børsinformasjon
Submeteu-se novamente a amostra de plasma precipitado por etanol 20% na presença de citrato de sódio pH 5,8 ao SDS-PAGE 5% e a banda correspondente a 250 kDa obtida foi enviada para o Centre of Excellence in Mass Spectrometry da Universidade de York na Inglaterra para análise no espectrômetro de massas Ultraflex
III - MALDI-TOF/TOF (Bruker).
4.1.2 Tratamento das amostras em colunas de afinidade de gelatina utilizando matriz de agarose
Segundo as instruções 71-7094-00AE da GE Healthcare, a fibronectina se liga especificamente à gelatina. Dessa forma confeccionou-se uma coluna de afinidade imobilizando gelatina à matriz ε-amino-caproic acid-agarose (Sigma Chemical
Company) com o intuito de se diminuir a concentração de fibronectina na amostra de
plasma precipitado com etanol na presença de citrato de sódio pH 5,8.
4.1.2.1 Imobilização da gelatina na matriz de ε-amino-caproic Acid- agarose (Sigma Chemical Company)
A matriz ε-amino-caproic Acid- agarose (Sigma Chemical Company) foi lavada com água destilada e seca com auxílio da bomba de vácuo. Pesou-se 4,5 g da resina seca e iniciou-se o processo de ativação com a finalidade de se imobilizar a gelatina. A ativação seguiu os seguintes passos: suspensão da resina em 13,5 mL de dioxano, adição de N-hidroxisuccinimida (NHS) e Diciclohexilcarbodimida (DCC) para a concentração final de 0.1M sob agitação da resina por 70 minutos, à temperatura ambiente. A resina ativada foi lavada com 8 volumes de dioxano, 3 volumes de metanol e 4 volumes de dioxano. À uma solução de NaHCO3 0,01 M, NaCl 0,9% pH 7,5
adiciounou-se a gelatina para concentração final de 10 mg de gelatina/mL para a qual transferiu-se a resina que fora lavada rapidamente com água deslilada imediatamente antes do acoplamento. A reação de acoplamento foi mantida uma hora a temperatura ambiente e 12 horas sob refrigeração. A etapa final consistiu no bloqueio dos grupos carboxílicos livres com solução de etanolamina 0,1 M, pH 9 por uma hora a temperatura
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ambiente. Após este procedimento procedeu-se nova lavagem com água destilada. Manteve-se o produto a 4ºC até o momento do uso.
4.1.2.2 Cromatografia de afinidade em coluna de gelatina
A coluna de Gelatina foi equilibrada com tampão Tris-HCl 0,5M pH 7,5. Aplicou-se a amostra proveniente da precipitação do plasma com etanol 20% em citrato de sódio pH 5,8 e deixou-a em contato com a matriz por 10 minutos. Em seguida, a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio, coletando-se 20 frações, de um mL cada, da amostra não retida na coluna. Eluiu-se a coluna com Uréia 8M para deslocar a fibronectina aderida à gelatina da matriz, coletou-se 10 frações de um mL cada. A absorvância das frações foi acompanhada em espectrofotômetro à 280nm. Equilibrou-se a coluna novamente com tampão de equilíbrio para que as frações não retidas fossem submetidas novamente ao tratamento. Repetiu-se a cromatografia até que se observasse supressão de absorvância a 280 nm nas frações da eluição com Uréia. As frações não retidas na última passagem da amostra pela coluna e as frações da primeira eluição foram dialisadas contra tampão acetato de amônio 0,01M pH 7,5 durante 24 horas com trocas de tampão a cada oito horas para remoção do Tris-HCl e da Uréia. As soluções dialisadas foram então liofilizadas e submetidas à eletroforese (SDS-PAGE 5%). Foi realizado o Western Blot para verificar o enriquecimento da amostra em FVW na fração não retida da coluna de gelatina.
4.2 Obtenção de anticorpos específicos para FVW normal e alterado
4.2.1 Predição dos peptídios a serem sintetizados pela análise da estrutura cristalográfica do FVW e das alterações citadas pelo banco de dados ISTH-SSC VWF online data base
As sequências peptídicas para síntese foram escolhidas levando-se em consideração o fato de que as sequências deveriam conter alterações características do FVW que ocorrem em subtipos qualitativos da DVW. As alterações R1306W, R1308C, V1316M e R1341Q foram incluídas na seleção uma vez que correspondem a 90% dos casos de DVW tipo 2B segundo Castaman et al (2003). Os peptídeos selecionados para síntese
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foram preditos levando-se em consideração o fato de que as sequências deveriam conter alterações características do FVW que ocorrem em subtipos qualitativos da DVW. As alterações foram recuperadas do banco de dados da Sociedade Internacional de Hemostasia e Trombose, disponível em http://www.isth.org/default/index.cfm. As sequências peptídicas para síntese foram preditas e selecionadas levando-se em consideração os seguintes critérios: (1) as sequências deveriam conter entre 8 e 20 aminoácidos, sendo necessária a presença de um resíduo aromático para avaliação do rendimento da síntese via espectrofotometria e purificação em HPLC. Na ausência de um resíduo aromático, esse foi adicionado à extremidade C-terminal da sequência peptídica; (2) a localização da sequência na estrutura do cristal da molécula do FVW, revelada pela Swiss-PdbViewer 3.7, deveria demonstrar sequências mais expostas ao solvente. As estruturas do cristal do domínio A1e domínio A2 do FVW utilizados estão disponíveis para download no site PDBj (Protein Data Bank Japão-
http://www.pdbj.org/index.html) http://service.pdbj.org/mine/summary/1auq (A1) e http://service.pdbj.org/mine/summary/3gxb (A2); (3) sequências peptídicas altamente hidrofóbicas não foram consideradas. Após a seleção das sequências peptídicas, as mesmas foram alinhadas com a sequência do FVW de camundongos utilizando o algoritmo ClustalW2 – Multiple sequence alignment disponível em http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/para se verificar diferenças entre as espécies e análise de êxito na produção de anticorpos.
4.2.2 Síntese de peptídeos, confirmação da estrutura por espectrometria de massas e purificação
4.2.2.1 Síntese de peptídeos
A síntese dos peptídeos propostos foi realizada em fase sólida estabelecido por Merrifield (1965), com algumas modificações. O procedimento adotado neste trabalho requer a utilização de aminoácidos derivatizados, através da proteção da porção amino com o grupo Fmoc. Se sua cadeia lateral também for reativa, ela estará protegida por um grupo que deva responder às exigências de ser adaptado à natureza da cadeia lateral e ser clivado na última etapa da síntese pelo Ácido trifloroacético (TFA).
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A síntese de peptídeos ocorreu em um suporte sólido insolúvel para o acoplamento dos aminoácidos. A resina suporte utilizada foi a Rink Amide Resin HL (Merck, Alemanha) a 0,78 mmol/g, partindo-se de um rendimento máximo de 40 µmoles de peptídeo por síntese.
4.2.2.2 Ativação da resina
Para a ativação da resina adotou-se o procedeu-se da seguinte forma: 40 µmoles de resina (52mg) foram colocados em um tubo de síntese com DMF (dimetilformamida) suficiente para cobrir a resina, permaneceu-se sob agitação constante por três horas à 37ºC. Para a liberação do grupamento Fmoc, a resina foi coberta com três mL de 4- metilpiperidina 20% em DMF mantida por 20 minutos, sob agitação constante a temperatura de 37ºC por três vezes. Em seguida, a resina foi lavada três vezes alternadamente com metanol e DMF com dois mL de cada solvente por lavagem. Todas as lavagens foram realizadas com auxílio de bomba de vácuo.
4.2.2.3 Ativação e adição dos aminoácidos a serem acoplados
Os aminoácidos e reagentes auxiliares foram adicionados em concentrações quatro vezes superiores (160 µmoles) à quantidade de resina com objetivo de se favorecer o acoplamento. Os aminoácidos foram ligados pelo seu grupamento carboxila ao grupamento amino da resina, formando uma ligação peptídica. O primeiro aminoácido foi adicionado ao tubo de síntese em um volume de dois mL de DMF, acrescido de 25µL de DIPC (diisopropilcabodiimida) e 23 mg de oxyma pure [ethyl 2-
cyano-2-(hydroxyimino)acetate]. Após uma hora de agitação à 37ºC, foi feita nova
adição de DIPC e oxyma pure nas mesmas quantidades anteriores deixando reagir por mais uma hora à 37°C. A resina conjugada com aminoácido foi submetida a uma acetilação preventiva para minimizar a formação de múltiplos produtos. Assim, 50 µL de uma solução 1:1 de DIPC e anidrido acético foram adicionados em um mL de DMF ao tubo de síntese, permanecendo sob agitação à 37ºC por 30 minutos. Ao final da etapa de acetilação, a resina foi lavada três vezes alternadamente com metanol e DMF. O grupamento amino desse primeiro aminoácido acoplado foi então desprotegido: adicionou-se à resina três mL de uma solução de 4-metilpiperidina 20% em DMF e manteve-se sob agitação contínua à 37°C por 10 minutos, repetindo três vezes essa
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etapa. Os demais aminoácidos foram processados conforme descrito para o acoplamento do primeiro aminoácido.
4.2.2.4 Clivagem do peptídeo
Após o término dos ciclos de acoplamento, o último grupamento Fmoc foi retirado com 4-metilpiperidina 20% em DMF, como descrito previamente, e a resina lavada por quatro vezes, durante cinco minutos cada, com DCM (diclorometano). As cadeias laterais foram desprotegidas e o peptídeo dissociado da resina pelo uso de cinco mL de solução de clivagem contendo 95% de TFA. Para os peptídeos que continham cisteína, a solução de clivagem possuía 2,5% de β-mercaptoetanol, a fim de se evitar a formação de pontes dissulfeto. O tubo de reação permaneceu sob agitação por quatro horas. A solução contendo os peptídeos foi coletada, transferida para tubos de ensaio e os produtos de síntese foram precipitados com oito a 10 volumes de éter etílico gelado durante a noite à 4ºC. Posteriormente, os tubos de ensaio foram lavados com éter etílico e centrifugados por três vezes a 1.500 x g por cinco minutos. Na última etapa, o sobrenadante foi desprezado e o peptídeo ressuspenso em três mL de água milli-Q. Os peptídeos que não eram totalmente solúveis em água foram solubilizados em solução 50% acetonitrila e 0,1% de TFA. Após a obtenção dos peptídeos, eles foram liofilizados, analisados em sistema HPLC e caracterizados em espectrômetro de massas LCMS-IT-TOF operando via electrospray.
4.2.3 Purificação dos peptídeos por cromatografia de fase reversa em sistema HPLC
Os peptídeos sintetizados em fase sólida foram submetidos à cromatografia de fase reversa para a análise de sua pureza. As cromatografias foram realizadas em coluna C18 (250 mm x 4,6mm) (Shim-pack CLD-ODS (M)-Shimadzu®), em sistema HPLC da
Shimadzu®. Amostras de 20 μL de peptídeos resultantes da última etapa do
procedimento de síntese foram submetidas a um gradiente de ACN (acetonitrila) de 20 a 60% e TFA 0,1% durante 35 minutos com um fluxo de um mL/minuto. A concentração de ACN atingiu 25% em 20 minutos, 60% em 25 minutos e retornou a 20% em 30
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minutos, mantendo-se nesssa concentração por 5 min. A eluição foi monitorada a 280nm ou a 260nm dependendo da sequência. Para os peptídeos mais hidrofóbicos, novas condições foram desenvolvidas até que a purificação se tornasse satisfatória. Estas outras condições cromatográficas abrangeram gradientes de ACN/TFA 0,1% variáveis entre 50, 80 e 100%, durante até 40 minutos com um fluxo de um mL/minuto. Após a purificação, os peptídeos foram caracterizados e identificados por espectrometria de massas.
4.2.4 Caracterização dos peptídeos por espectrometria de massas LCMS-IT-TOF
electrospray
Analisou-se os peptídeos purificados através do espectrômetro de massas LCMS-IT-TOF (Liquid Chromatography Ion Trap Time Of Flight), que opera por ionização do tipo electrospray (Shimadzu®). Calibrou-se o equipamento com trifluoroacetato de sódio. A voltagem capilar foi de 4500 V no modo positivo de ionização, com tempo de acumulação de 10 ms. Aplicou-se as amostras através de injeções diretas (alíquotas de cinco μL). A ferramenta ExPASy – Compute PI/Mw tool (disponível em http://web.expasy.org/compute_pi/) foi utilizada para a predição das
massas moleculares dos peptídeos.
4.2.5 Imunização de camundongos com peptídeos conjugados com KLH, análise e purificação dos antissoros em colunas de peptídeos
4.2.5.1 Conjugação de peptídeos com KLH e imunização de camundongos
A produção de soro policlonal para detecção do FVW normal e alterado foi induzida utilizando-se como antígeno os peptídeos sintetizados conforme a metodologia descrita no item 4.2.2.1. Estes peptídeos correspondem a uma sequência presente no FVW de indivíduos normais e afetados pela DVW, foram conjugados ao carregador protéico KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) (Sigma Aldrich, EUA) através da ligação com glutaraldeído. Para cada 1 mg de peptídeo, adicionou-se 1 mg de KLH em 200 μL de tampão borato pH 10; 0,1 M e 100 μL de glutaraldeído 0,3%. A reação ocorreu sob agitação contínua por 2 horas. Após este período, o glutaraldeído reativo foi inativado
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durante 30 minutos pela adição de 25 μL de solução de glicina 1M. A solução resultante foi dialisada contra água destilada e posteriormente liofilizada.
O regime de imunização consistiu em administração intraperitonial de três doses em camundongos Swiss machos com idade aproximada de 10 semanas. Cada camundongo recebeu uma dose quinzenal de 50 μg do conjugado KLH-peptídeo, na forma de emulsão com o adjuvante hidróxido de alumínio a 10%. A coleta do sangue foi realizada após 45 dias de imunização.
4.2.6 Colunas de afinidade individuais para purificação dos antissoros
4.2.6.1 Imobilização dos peptídeos sintéticos à sepharose 4B
Utilizou-se Sepharose 4B como matriz para imobilização dos peptídeos sintetizados de forma individual para purificação dos antissoros obtidos a partir da imunização dos camundongos como descrito anteriormente.
Para cada coluna utilizou-se Sepharose 4B suficiente para volume final de 0,2 mL cada. A sepharose 4B foi ativada em solução de epicloridrina 5% sob agitação a 40°C por 2 horas, como descrito por Matsumoto, Mizuno & Seno (1979).
Após lavagem com água destilada, 1,5 volumes de hidróxido de amônio P.A foram adicionados para aminação da resina epóxi-ativada incubando-se durante 90 minutos sob agitação, a 40°C. Suspendeu-se a resina aminada em 1,5 volumes de NaCl 0,1 M sendo posteriormente adicionados 0,08 g de anidrido succínico por g de resina para que ocorresse a succinilação da mesma. Manteve-se o pH igual a 6 através da adição gradual de NaOH 20%, e a mistura reacional mantida à temperatura ambiente durante 5 horas. Realizou-se uma nova lavagem e incubação por 30 min com NaOH 0,1 M e a resina foi novamente suspensa em NaCl 0,1 M. O suporte succinilado foi então lavado com 3 volumes de dioxano para tornar a resina anidra e novamente suspenso em dioxano para posterior adição NHS e DCC na concentração de 0,1M cada para ativação. Esta suspensão foi mantida por 70 minutos sob agitação leve à temperatura ambiente sendo então lavada com 8 volumes de dioxano seguidos de 4 volumes de metanol e 3 volumes de dioxano.
Após a ativação, realizou-se uma lavagem rápida com um volume de água destilada sendo a resina rapidamente transferida para um béquer com 3 volumes de
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solução NaHCO3 0,01 M, NaCl 0,9%, pH 7,5 contendo ácido ε-amino capróico na
proporção de 2,6 g de ácido para 100 mL de solução. Manteve-se a suspensão por uma hora à temperatura ambiente para inserção do braço extensor. Repetiu-se então a etapa de ativação com NHS e DCC como descrito anteriormente.
A uma solução de NaHCO3 0,01 M, NaCl 0,9% pH 7,5 adicionou-se o peptídeo
na concentração de 10 mg/mL para a qual transferiu-se a resina ativada na última etapa. Após uma hora à temperatura ambiente e 12 horas sob refrigeração, o excesso de grupos reativos foi bloqueado com etanolamina 0,1 M, pH 9 por uma hora à temperatura ambiente. Após este procedimento procedeu-se nova lavagem com água destilada. Manteve-se a coluna de afinidade de peptídeo à 4ºC até o momento do uso.
4.2.7 Purificação do antissoro
Para purificação dos antissoros, utilizaram-se as colunas previamente confeccionadas contendo os peptídeos imobilizados. Os antissoros provenientes de camundongos imunizados com peptídeos alterados do FVW foram aplicados em colunas de afinidade contendo peptídeos normais com o objetivo de se excluir da amostra os anticorpos contra o FVW normal, como mostra o fluxograma apresentado na figura 5.
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Figura 5. Fluxograma do método de tratamento do soro dos camundogos imunizados para exclusão de
anticorpos anti-PPT normal
Equilibrou-se as colunas de afinidades com tampão fosfato salino - PBS ( NaCl 0,15M; NaH2PO4 0,2M e Na2HPO4 0,2M) pH 7,4. Os soros dos camundongos
imunizados com peptídeos alterados foram aplicados às colunas imobilizadas com peptídeos normais. Cerca de 100 µL das frações não retidas foram armazenadas para análise e o restante foi destinado a posterior recromatografia. Procedeu-se a eluição da fração retida na coluna com 5 mL de solução glicina 0,1M, pH 2,6 em tubo contendo 5mL de solução Tris-HCL 0,4M, pH 8,0. A coluna foi reequilibrada com PBS e a fração não retida foi submetida a mais cinco ciclos de cromatografia, totalizando 6 ciclos, nas mesmas condições citadas para se depletar todo anticorpo anti-PPT normal presente na fração não retida. Dessa forma, a amostra foi submetida à purificação em coluna contendo o peptídeo alterado imobilizado, como mostrado no esquema abaixo. Seguiu- se o mesmo procedimento de purificação em colunas com peptídeos normais, mostrada anteriormente.
Fração não retida após 6 cilcos de cromatografia, isento de anti-PPT normal Soro de camundongos imunizados com PPT‘s alterados Colunas de afinidade contendo PPT normais
Fração não retida Fração retida
(6 frações no total, após 6 ciclos de
cromatografia)
Teste por Western
Blot
Recromatografia da fração não retida para excluir todo anticorpo
anti-PPT normal, presente na amostra.
Etapa seguinte de purificação
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Figura 6. Fluxograma do método de purificação dos anticorpos anti-PPT alterados em colunas de PPT’s alterados após o tratamento de exclusão dos anticorpos anti-PPT normal.
A fração retida proveniente do primeiro ciclo de cromatografia nas colunas de afinidade contendo peptídeo normal imobilizado foi submetida à filtraçao em filtro
Amicon Ultra-4 3000 Da em 2 ciclos de centrifugação por 45 minutos a 4000 rpm à 4o
C. O volume final retido no filtro foi de 100 µL. Em seguida, adicionou-se 5 mL de acetato de amônio 0,01M e submeteu-se a nova centrifugação nas mesmas condições repetindo esse passo. O volume de 100 µL final presente no filtro foi liofilizado e, posteriormente, suspenso em 200 µL de água mili-Q. Adotou-se o mesmo procedimento para a fração retida proveniente do primeiro ciclo de cromatografia nas colunas de afinidade contendo peptídeo alterado imobilizado.
Fração não retida nas colunas de PPT’s normais após 6 cilcos de cromatografia Colunas de afinidade contendo PPT’s alterados imobilizados
Fração não retida Fração retida
(6 frações no total, após os 6 ciclos de cromatografia)
Teste por Western
Blot
Recromatografia para recuperação máxima de antorpos
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4.2.7.1 Acoplamento de peptídeos sintético alterados à albumina
Com a finalidade de produzir uma amostra modelo para testes de Western blot empregando anticorpos anti-FVW alterados, conjugou-se albumina purificada aos peptídeos sintéticos alterados. Para cada 1 mg de peptídeo presente em 500 µL de solução de DMF foram adicionados 17 µL de solução de diisopropilcabodimida 1:25 em dimetilformamida e 3 mg de NHS solubilizado em 20 µL de DMF. Manteve-se essa solução incubada por cinco minutos a temperatura ambiente, em repouso. Adicionou-se 50 µL de solução de acetato de sódio 0,4 M em dimetilformamida e incubou por dois minutos a temperatura ambiente para consumir o excesso de DIPC. Em seguida, adicionou-se um 1 mL de solução contendo 1 mg de BSA (bovine serum
albumin) em bicarbonato de sódio 0,05M pH 7,5. Incubou-se por uma hora a
temperatura ambiente em repouso e, em seguida, dialisou-se contra tampão acetato de amônio 0,1M por 24 horas. A solução dialisada foi liofilizada e ressuspensa em 100 µL de solução salina.
4.2.7.2 Western Blot para comprovação da presença de anticorpospurificados
Realizou-se a técnica de Western Blot (Towbin et al. 1979) para verificar a presença de anticorpo nas frações retidas nas colunas de purificação, para testar se a fração retida nessas colunas é capaz de reconhecer a amostra de peptídeo conjugada à albumina, verificar se a fração retida na coluna contendo peptídeos normais imobilizados é capaz de reconhecer FVW plasmático de um indivíduo normal e verificar se todo anti-PPT normal foi excluído da fração não retida proveniente da purificação em colunas contendo peptídeos normais imobilizados.
4.2.7.2.1 Detecção da presença de anticorpo nas frações retidas nas colunas de purificação
As frações retidas em colunas de peptídeos alterados foram concentradas e submetidas a eletroforeses em gel de poliacrilamida 12% e os respectivos géis transferidos para membranas de PVDF (Polyvinylidene Fluoride) (Invitrogen) a 200 mA em tampão Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM, etanol 20% e SDS 0,02%
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sob refrigeração por duas horas. Em seguida, as membranas foram bloqueadas durante a noite em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5, Tween-20 0,3% e leite em pó desnatado 5%, sendo posteriormente lavadas por três vezes com Tris-HCl 10 mM pH 7,5. Após essas lavagens, as membranas foram incubadas em tampão imunoblotting (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, Tween-20 0,013% e leite em pó desnatado 5%) sob agitação por 30 minutos. Anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado à fosfatase alcalina (Sigma Aldrich, EUA) na diluição 1:2000, foi adicionado ao tampão
immunoblotting, reagindo por 2 horas à temperatura ambiente. As membranas foram
lavadas com Tris-HCl 10 mM pH 7,5 e reveladas com solução de NBT/BCIP (Nitro
Blue Tetrazolium/5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil-Fosfato - Sigma Aldrich, EUA), de acordo