A levedura Pichia pastoris têm se mostrado um eficiente sistema de expressão, por apresentar algumas vantagens, quando comparado ao sistema de expressão em E.coli. Algumas dessas vantagens são atribuídas a sua capacidade de promover um melhor enovelamento e processamento da proteína heteróloga, além de glicosilações realizadas nas proteínas secretadas. Também, a possibilidade de integração do genoma dos vetores de expressão ao genoma da levedura Pichia pastoris, aumentam a estabilidade das linhagens utilizadas.
A levedura P. pastoris utiliza o metanol como fonte de carbono. Neste sistema há a presença de um promotor denominado (AOX), responsável pela regulação da expressão, a qual é induzida na presença de metanol. Dois genes codificam a enzima álcool oxidase em Pichia pastoris, AOX1 e AOX2, sendo que a maior parte de atividade de álcool oxidase na célula é controlada por AOX1.
A linhagem utilizada foi KM71H, essa linhagem apresenta fenótipo Muts , tendo uma baixa atividade de enzima álcool oxidase, por apresentar um locus AOX1 mutado. Mesmo com baixa capacidade de metabolizar metanol, essa linhagem têm a capacidade de induzir uma alta expressão do promotor AOX1. O vetor de expressão utilizado pPICZαC, permite a clonagem do gene de interesse em fase com uma sequência nucleotídica que codifica o sinal de secreção (Fator α), o qual fica na região N-terminal da proteína expressa, o que por sua vez permite que a proteína recombinante seja secretada para o meio extracelular. Além de uma região na extremidade C-terminal que codifica seis histidinas, o que permite posterior purificação em coluna de resina de níquel, por cromatografia de afinidade e um epítopo c-myc para detecção da proteína recombinante por Western blot.
Para a transformação da linhagem KM71H, o plasmídeo pPICZαC_DiaciCATHB, foi linearizado com a enzima PmeI (New England Biolabs), após análise dos sítios de clivagem da sequência da proteína através do programa NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/), para facilitar a recombinação homóloga com o genoma da levedura. Para a linearização foram utilizados 3 µg de plasmídeo, 1 µL de enzima PmeI (2U/ µL), 5 µL de tampão NeBuffer-4 (1X) (20 mM Tris-acetato, 50 mM acetato de potássio, 10 mM acetato de magnésio, 1 mM DTT, pH 7.9), 0.5 µL de BSA (100 µg/mL) e H20, em um volume de reação final de 50 µL. A reação foi mantida à 37°C overnight. Após, a inativação da enzima foi realizada por uma incubação à 65 °C durante 20 minutos. Em seguida, a reação contendo o plasmídeo linearizado, foi submetida a uma precipitação em solução contendo 1/10 do volume final de acetato de sódio 3M, pH 5.2, 2.5 volumes de etanol 100%, a reação de precipitação foi incubada por 15 minutos no -80°C, em seguida foi feita uma centrifugação à 16.000 x g por 10 minutos, 4°C. O sobrenadante foi removido e o precipitado lavado com 1000 µL de etanol 70% gelado e centrifugado nas mesmas condições descritas anteriormente. Após evaporação do etanol, o material foi ressuspendido em 10 µL de água miliQ.
O preparo de células KM71H eletrocompetentes foi realizado segundo protocolo de Cregg (2007). No protocolo uma colônia de KM71H foi inoculada em 5 mL de meio YEPD (1% extrato de levedura, 2% peptona - Invitrogen, 2% dextrose – J.T. Baker), a cultuta foi mantida à 30°C, 250 rpm, durante 8 horas. Quarenta e três µL dessa cultura foi inoculada em 50 mL de meio YEPD, e a cultura foi mantida à 30°C, 250 rpm, até atingir uma D.O de 1.4. A análise de absorbância da cultura foi realizada à 600nm, e para isso, a cultura foi diluída 10 vezes em água antes da leitura. Após atingir a D.O. a cultura contendo as células de KM71H foi centrifugada, à 1.500g por 10 minutos, 4°C e o sobrenadante descartado. Em seguida, as células foram ressuspendidas sutilmente em 10 mL de meio YEPD juntamente com 2 mL de tampão Hepes 1M, pH 7.0. Em seguida foi adicionado 250 µL de DTT 1M (ditiotreitol - ICN Bimedicals Inc., USA), a amostra foi homogeinizada e incubada à 30°C em estufa por 15 minutos. Em seguida, foi adicionada água gelada, em um volume final de 50 mL. As células foram centrifugadas à 1.500g por 10 minutos, 4°C, e o sobrenadante descartado. As células foram então lavadas com 25 mL de água gelada estéril, e centrifugadas nas mesmas condições descritas anteriormente, em seguida, as mesmas foram novamente lavadas com 2 mL de sorbitol (1M) gelado. E, após centrifugação, as células foram ressuspendidas em 100 µL de sorbitol 1M gelado. As células foram distribuídas em alíquotas de 40 µL.
Para a transformação do plasmídeo pPICZαC_DiaciCATHB em células de Pichia pastoris KM71H foi utilizado 3000 ng do DNA linearizado em 40 µL de células KM71H eletrocompetentes, em seguida a mistura foi transferida para uma cubeta de eletroporação de 0.2 cm (Bio-Rad) e incubado em gelo por 5 minutos. A transformação foi realizada por eletroporação no aparelho GenePulser II (BioRad) nas seguintes condições: 1500 V, 25 µF, 200 Ω. Rapidamente, após o choque foi adicionado a cubeta 1 mL de sorbitol 1M, mantido à 30°C, por 2 horas, com agitação de 170 rpm. Para a seleção de transformantes foram plaqueados 50, 100 e 200 µL da transformação em placas contendo meio YEPDs (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de dextrose, 1M sorbitol, 2% de ágar), contendo 100 µg/mL e 200 µg/mL de zeocina. Para confirmação da inserção do gene de interesse contendo o gene de DiaciCATHB no genoma de P. pastoris, foi realizado uma PCR de colônia. Para a realização da PCR de colônias das células de Pichia pastoris KM71H transformadas um total de 15 colônias foram repicadas com palito estéril e
colocadas em tubos de 1.5 mL contendo 20 µL de SDS 0.2%, os quais foram fervidos por 5 minutos á 90°C, e em seguida centrifugados 12.000g por 30 segundos. Sendo que, 1 µL desse sobrenadante foi utilizado como molde para a PCR em um volume final de 25 µL. Para a reação foi utilizado tampão NH4SO4 (-
MgCl) 1x, 1,5 mM de MgCl, 0,4 Mm de dNTPs, 1 % triton x -100, 10 pmoles de cada primer (Fator α e primer 3’ específico do gene de interesse), 1,25 U de Taq DNA polimerase e H2O. Entre os clones analisados por PCR de colônia, alguns foram
selecionados por apresentarem o produto de amplificação correspondente ao fragmento de interesse.
3.4.1. Ensaios de expressão recombinante da catepsina B de D. citri em pequena escala em P. pastoris
Os clones positivos selecionados por PCR de colônia foram utilizados para análise da expressão da catepsina B recombinante em Pichia pastoris. Os ensaios de expressão foram realizados em placa de 24 poços, em cada poço foi adicionado 3 mL de meio BMGY (1% extrato de levedura, 2% peptona, 100 mM de tampão fosfato pH 6.0, 1.34% de YNB, 4 x 10-5 de biotina, 1% glicerol). Em cada poço foi inoculada uma colônia transformante. A placa contendo a cultura foi mantida à 30°C durante 48 horas, com agitação de 250 rpm. Após esse período a placa contendo as cultura foi centrifugada por 10 minutos, à 1.700 x g, o meio de crescimento BMGY foi descartado e as células ressuspendidas em 2 mL de meio BMMY ( contendo 0,75% de metanol 100% em substituição ao glicerol), as células foram mantidas à 30°C, sob agitação de 250 rpm. A cada 24 horas, foi adicionado metanol na concentração final de 0.75%, para indução expressão da proteína de interesse, como descrito por Aoki et al. (2003). A placa de screening foi mantida durante o intervalo de tempo de 24-144 horas e a análise da expressão da proteína recombinante foi visualizada em SDS-PAGE 15% (LAEMMLI, 1970). Após as análises das bandas no gel, foi possível constatar que somente um, entre todos os clones testados, expressava uma banda na altura de aproximadamente 50 kDa. O clone positivo foi escolhido para realização de ensaios de expressão em larga escala.
3.4.2. Expressão recombinante da catepsina B de D.citri em larga escala
A colônia contendo células de levedura expressando a cisteíno peptidase de D.citri denominado DiaciCATHB foi utilizada para preparação de um pré-inóculo. Assim, uma colônia foi inoculada em 10 mL de meio BMGY em tubo de 50 mL durante 24 horas sob agitação de 250 rpm, à 30°C. Um volume de 10 mL desse pré- inóculo foi transferido para um frasco Erlenmeyer aletado de 2 L contendo 500 mL de meio BMGY (pH 6.0) e mantido à 30°C por 16 horas sob agitação de 250 rpm. Após esse período a cultura foi centrifugada a 1.500 x g por 5 minutos e ressuspendida em 100 mL de meio BMMY em frasco Erlenmeyer de 1L. O ensaio de indução da expressão da proteína recombinante foi realizado à 30°C, 250 rpm.
A cada 24 horas foi adicionado metanol à cultura na concentração final de 0.75%. Após 24 horas de indução, o material foi centrifugado a 6.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante filtrado em membrana de PVDF 0.45 µm (millipore). A proteína recombinante DiaciCATHB em fusão com seis histidinas na região C- terminal, provenientes do vetor de expressão pPICZαC foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de resina de níquel.
3.4.3. Purificação da proteína recombinante DiaciCATHB por cromatografia de afinidade
A proteína recombinante DiaciCATHB em fusão com seis histidinas na região C-terminal, provenientes do vetor de expressão pPICZαC foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de resina de níquel.
Para tanto, os 100 mL de cultura contendo a proteína recombinante (sobrenadante) foram passados por uma coluna contendo 4 mL de resina de níquel Ni-NTA superflow (Qiagen) previamente equilibrada com 5 volumes (20 mL) de tampão de lise pH 8.0 (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, NaCl 100 mM e NaH2PO4 50mM), em
seguida a coluna foi lavada com 3 volumes de tampão de lise (12 mL), e a proteína eluída em 2 volumes de tampão de lise contendo concentrações crescentes de imidazol (10, 25, 50, 75, 100 e 250 mM). O imidazol têm forte afinidade pelo níquel, competindo, portanto com a cauda de histidinas presente na região C-terminal da proteína recombinante, o que consequentemente permite que a proteína de fusão se solte do metal e seja eluída. Toda a etapa de purificação foi realizada na geladeira à 4°C. A proteína recombinante purificada foi analisada em SDS-PAGE
12% corado por Comassie blue (LAEMMLI, 1970). As frações contendo a proteína recombinante foram dialisadas em membranas (Spectrum Laboratories) de 3.500 MW contra 2 litros de tampão de lise pH 8,0 e mantidas à 4 °C com trocas do tampão a cada 60 minutos, totalizando 2 horas de diálise e portanto, duas trocas do tampão. Em seguida, a proteína foi concentrada em equipamento SPD1010 SpeedVac® System (ThermoSavant), durante 3 horas e posteriormente por mais 1 hora e 30 minutos em concentrador Vivaspin™ 3.000 MWCO (GE Healthcare). A concentração da proteína DiaciCATHB foi determinada pelo método de quantificação Bradford (BioRad) (BRADFORD, 1976), em espectrofotômetro Hitachi U-5100.
3.5. Produção de anticorpo policlonal contra DiaciCATHB recombinante e