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Del 5. Utstillingene etter 1924
28 Resumo
A citogenética comparativa permite através de suas técnicas de bandamento clássica e molecular entender sobre a evolução do genoma em diversos organismos. Assim, neste estudo foi feita uma descrição citogenética de cinco espécies do gênero Trigona (Trigona pallens, T.
williana, T. hypogea, T. truculenta e Trigona sp. grupo “fuscipennis”) numa abordagem
comparativa entre elas . Todas as espécies apresentaram o número cromossômico 2n=34 e um dos braços cromossômicos heterocromático na maior parte dos cromossomos. Trigona
pallens, T. williana, e T. truculenta apresentaram cromossomos acrocêntricos totalmente
eucromáticos, também encontrados em outras espécies do gênero. Essa morfologia foi ausente em Trigona sp1 grupo “fuscipennis” e T. hypogea. O sítios de rDNA 18S variaram entre as espécies sendo localizados em um a quatro pares cromossômicos. Porém, em todas as espécies essa região esteve presente no braço heterocromático. Tanto o número diploide quanto a distribuição da heterocromatina foi semelhante ao encontrado para outras espécies do gênero descritas citogeneticamente reforçando a homogeneidade dessas características no gênero. Por outro lado o posicionamento do gene rDNA variou entre as espécies constituindo um marcador promissor para o entendimento da evolução do cariótipo em Trigona e em outros Meliponini.
29 Introdução
As abelhas sem-ferrão do gênero Trigona que ocorrem na região Neotropical formam um grupo monofilético (Costa et al 2003, Rasmussem e Cameron 2009 ). No Brasil, o gênero possui uma ampla distribuição abrangendo quase todo o território nacional (Silveira et al 2002). As espécies do gênero são consideradas polinizadoras de culturas como manga e acerola, e de plantas nativas (Nogueira-Couto e Peraro 2000, Lattaro e Malerbo-Souza 2006, Giannini et al 2014), embora em culturas de Citrus, essas abelhas possam causar injúrias nas flores (Silva et al 1997).
Estudos citogenéticos têm sido usados como ferramenta para o entendimento da filogenia, mecanismos de especiação e diferenças entre populações em diversos grupos de Hymenoptera (Pompolo e Takahashi 1986, Duarte et al 2009, Menezes et al 2014). A citogenética comparativa pode auxiliar no entendimento das relações entre as espécies do gênero Trigona, complementando os estudos de filogenia do grupo baseando nas características cromossômicas das diferentes espécies.
São reconhecidas 32 espécies para o gênero (Camargo e Pedro 2013, Pedro 2014) e destas, apenas sete apresentam algum registro citogenético: Trigona recursa Smith, 1863,
Trigona aff. fuscipennis Friese, 1900; Trigona fulviventris Guérin, 1844; Trigona chanchamayoensis Schwarz, 1948; Trigona branneri Cockerell, 1912; Trigona spinipes e Trigona hyalinata (Rocha et al 2003; Costa et al 2004; Domingues et al 2005). As espécies do
gênero apresentam um número diploide igual a 34 cromossomos, exceto em T. fulviventris (2n=32) (Domingues et al 2005).
Nas últimas décadas, o mapeamento físico dos genes de DNA ribossomal (rDNA) tem sido bastante aplicado em estudos sobre a evolução do cariótipo em diversas ordens de insetos: Coleoptera (Cabral-de-Melo et al 2010; Cabral-de-Melo et al 2011a,b), Diptera ( Rafael et al 2003, 2006), Orthoptera (Cabreto et al 2008 , Grzywacz et al 2014), Hemiptera
30 (Nokkala et al 2007; Grozeva et al 2011), Lepidoptera (Nguyen et al 2010). Nas abelhas da tribo Meliponini foram realizados estudos de localização física do rDNAs apenas nas espécies de Friesella schrottkyi (Mampumbu 2002), Melipona compressipes (Rocha et al 2002),
Partamona helleri e Partamona seridoensis, (Brito et al 2005), Nannotrigona puctata, Paratamona sp. e Scaptotrigona bipuctata (Godoy 2014) sendo os outros gêneros pouco
estudados, incluindo o gênero Trigona.
As informações disponíveis sobre a citogenética das espécies de Trigona, têm se apoiado em descrições e técnicas de bandamento da citogenética clássica (Brito e Pompolo 1997, Rocha et al 2003, Costa et al 2004; Domingues et al 2005). As informações fornecidas por esses métodos não permitiram esclarecer ou entender com clareza as relações entre os grupos de espécies do gênero. Dessa forma, a abordagem da citogenética molecular, como o mapeamento físico de genes pela técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH), pode incrementar as informações citogenéticas até o momento disponíveis para as espécies do gênero.
A análise comparativa dos resultados obtidos pelas técnicas de bandamentos clássicas e do mapeamento de genes ribossomais tem fornecido informações sobre a organização e evolução do genoma em diversos organismos auxiliando em estudos de filogenia e sistemática (Loreto et al 2008, Cabral-de-Melo et al 2010, Supiwong et al 2013, Grywacz et al 2014). Com esse intuito, este estudo descreveu e comparou através de técnicas de citogenética clássica e molecular cinco espécies de Trigona de ocorrências no Brasil.
Material e Métodos
Neste estudo foram utilizadas as seguintes espécies: T. pallens, T. williana, T.
31 51º56’25,74” W), Trigona sp. grupo “fuscipennis” proveniente de Florestal- Minas Gerais (21° 10' 40" S /47° 48' 36" W). Os indivíduos adultos foram montados, identificados pelo prof. Fernando Silveira da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e depositados na coleção do Museu Regional de Entomologia da Universidade Federal de Viçosa (Apiário Central/UFV) e na Coleção Zoológica da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os números de registro dos espécimes encontram-se na tabela 1.
Cromossomos metafásicos foram obtidos a partir do gânglio cerebral de 30 larvas pós-defecantes de cada espécie e processados de acordo com a técnica desenvolvida por Imai et al (1988). A coloração convencional foi realizada com Giemsa 5%. A heterocromatina foi identificada pela técnica de bandamento C desenvolvida por Sumner (1972) com as seguintes modificações (tratamentos com 0,2M HCl por 6 min e 5% Ba (OH)2 à 60 ºC por 14 min). Foram analisadas, em média, 15 metáfases por lâmina em microscópio OLYMPUS BX-60 acoplado a um sistema de captura e análise de imagens. Os cromossomos metafásicos foram pareados e classificados baseando na localização da heterocromatina, como sugerido por Imai (1991).
As sondas das regiões de rDNA 18S foram obtidas por amplificação via PCR, utilizando-se os pirmers F(5’-GTCATATGCTTGTCTCAAAGA -3’) e R(3’- TCTAATTTTTTCAAAGTAAACGC -5’), desenhados para a espécie de abelha Melipona
quinquefasciata (Pereira 2006). As sondas de rDNA 18S foram marcadas utilizando-se
digoxigenin-11-dUTP (Roche, Mannheim, Germany) durante a amplificação. Os procedimentos do FISH foram realizados de acordo com Pinkel et al (1986). Para a detecção do sinal, o material foi incubado com antidigoxigenina-rodamina (Roche, Mennheim Germany). Ao final as lâminas foram montadas com Antifading contendo DAPI (Fluoroshield com DAPI- SIGMA F6057). Foram analisadas, em média, 15 metáfases por lâmina em um fotomicroscópio de epifluorescência OLYMPUS BX-53.
32 Resultados e Discussão
O número cromossômico observado nas espécies Trigona hypogea, T. pallens, T.
truculenta, T. williana, e Trigona sp. grupo “fuscipennis” foi o mesmo, 2n=34 (Figs 1 e 2).
Assim como visto em vários gêneros da tribo Meliponini, o número cromossômico parece ser constante para as seis espécies de Trigona descritas citogeneticamente na literatura (Rocha et al 2002, Costa et al 2004, Fernandes et al 2013). A única exceção no gênero é T. fulviventris, 2n=32, em que a redução do número diploide seria resultado de uma fusão cromossômica (Domingues et al. 2005). A constância do número diploide tem sido observada para os gêneros Frieseomelitta, 2n=30 (Rocha et al 2003, Carvalho e Costa 2011), Scaptotrigona, 2n=34 (Rocha et al 2003, Duarte et al 2009), e Plebeia, 2n= 34 (Rocha et al 2003, Godoy et al 2013). Diferenças numéricas foram encontradas em Partamona (Costa et al 1992, Martins et al 2009), Melipona (Lopes et al 2008) e Tetragonisca (Barth et al 2011), no entanto, estas diferenças estavam relacionadas à presença de cromossomos supranumerários. No gênero
Melipona, além da presença de cromossomos Bs, uma variação no número diplóide foi
encontrada para a espécie Melipona seminigra merrillae (Francini et al 2011).
Com base no padrão de distribuição da heterocromatina, os cromossomos das cinco espécies foram majoritariamente pseudoacrocêntricos, ou seja, um dos braços cromossômicos é totalmente heterocromático (Fig. 1). Na tabela 1 está indicada a fórmula cariotípica das espécies deste estudo. Os tipos cromossômicos e as frequências encontradas nas espécies foram 81% pseudoacrocêntricos (Am), 8% pseudoacrocêntricos com heterocromatina na região centromérica, (Amc), seguido de 6% de cromossomos acrocêntricos (A) e 5% de acrocêntricos totalmente eucromáticos (Ae). Em T. pallens e T. williana foi observada coloração mais forte em alguns pares Am (Fig 1 f-g). A principal hipótese sobre evolução cariotípica do grupo sugere eventos de fissão cêntrica, seguidas de crescimento “in tanden” da heterocromatina como forma de estabilizar as regiões teloméricas resultantes dessas fissões
33 (Imai et al 1988), o que justificaria a predominância de cromossomos dos tipos Am e Amc no cariótipo de vários gêneros das abelhas da tribo Meliponini (Rocha et al 2003, Godoy et al 2013).
As espécies T. pallens e T. williana apresentaram um par Ae (Fig. 1f, g) enquanto T.
truculenta, dois pares (Fig. 1 j). Cariótipos com a morfologia Ae foram registrados para outras espécies do gênero: T. chanchamayoensis, T. fulviventris, T. recursa, T. branneri, T. hyalinata e T. spinipes (Brito e Pompolo 1997, Costa et al 2004, Domingues et al 2005, Ferreira et al 2015), o que sugere uma homologia desse cromossomo entre as espécies do gênero Trigona (Costa et al 2004). Trigona hypogea e Trigona sp1 grupo “fuscipennis” não apresentaram cromossomos Ae (Fig.1 h,i). Dentre as Trigonas estudadas essas duas espécies apresentam hábitos alimentares diferenciados das demais. A espécie T. hypogea juntamente com T.
crassipes e T. necrophila estocam proteína animal que é utilizada na alimentação das larvas,
ao contrário das outras espécies do gênero que coletam pólen (Camargo e Roubik 1991, Mateus e Noll 2004). As espécies do grupo “fuscipennis” coletam secreções açucaradas excretadas por insetos da ordem Hemiptera (Carvalho 2004). Outras abelhas da tribo Meliponini e outras espécies de Trigona também apresentam essa interação mutualística, mas de forma facultativa enquanto nas espécies do grupo “fuscipennis” essa interação é obrigatória (Carvalho 2004, Rasmussen e Camargo 2008, Oda et al 2009). Tanto os hábitos alimentares quanto as diferenças dos dados citogenéticos em T. hypogea e Trigona sp. grupo “fuscipennis” corroboram com a proposta filogenética que colocam esses grupos em clados diferentes das demais espécies do gênero (Rasmussen e Camargo 2008, Rasmussen e Camerom 2010) sugerindo modos diferentes de eliminação de heterocromatina.
O cariótipo da espécie Trigona. sp grupo “fuscipennis” foi semelhante, ao encontrado para outra espécie do grupo descrita para o estado de Minas Gerais. As duas espécies assemelham-se, tanto em número quanto morfologia cromossômica, embora haja uma
34 distância de cerca de 600 km entre os locais de coleta. Os dados citogenéticos deste trabalho sugerem se tratar da mesma espécie encontrada por Rocha et al (2003). O grupo “fuscipennis” constitui um conjunto de espécies ainda não descritas, sendo consideradas como T.
fuscipennis apenas os espécimes com distribuição do México ao oeste do Equador (Camargo e
Pedro 2013). No entanto, existem espécies de ocorrência em outros países da América do Sul que fazem parte desse grupo (Camargo e Pedro 2013). Deste modo uma revisão taxonômica do grupo torna-se necessária para entender as relações neste complexo de espécies.
As informações sobre mapeamento físico da região rDNA 18S nas espécies de
Trigona deste estudo e em outras abelhas da tribo Meliponini disponíveis na literatura estão
resumidos na Tabela 2. Tanto em Trigona quanto nos outros Meliponini encontramos variações no número e na localização das marcações de rDNA 18S (Tabela 2). T. pallens e T.
williana (Fig. 2 a, b) apresentaram apenas um par de cromossomos marcado na região
intersticial do braço curto do par cromossômico. T. hypogea e Trigona sp grupo “fuscipennis” tiveram dois pares marcados sendo um par na região intersticial e outro par na região subterminal (Fig. 2c,d) e, em T. truculenta quatro pares foram marcados, sendo dois na região intersticial e dois na região subterminal (Fig 2e).
O gene rDNA 18S mapeado nos Meliponini Friesella schrottkyi, Melipona
compressipes, Nannotrigona punctata, Sacaptotrigona bipunctata (Maffei et al 2001,
Mampumbu e Pompolo 2000, Rocha et al 2002, Brito et al 2005, Godoy 2014) mostra distribuição na região terminal do braço longo em um par de cromossomos. Nas espécies do gênero Partamona, o número de pares marcados varia de um a quatro, sendo que em todos os casos os loci rDNA estão localizados na região terminal do braço cromossômico longo. As espécies de Trigona, no entanto, apesar de apresentarem o mesmo número diploide mostram variação no número e na localização dos genes de rDNA tanto entre as espécies do gênero quanto em comparação com outros Meliponini. A localização do gene rDNA 18S próximo a
35 regiões de heterocromatina foi registrada para outras ordens de insetos sendo sugerido que a ação elementos transponíveis, a recombinação ectópica nessas regiões de heterocromatina poderiam explicar o espalhamento dos loci rDNA sem alteração do número cromossômico (Nguyen et al 2010, Cabral-de-Melo 2011, Grzywacz et al 2014).
Este estudo além de ampliar as informações citogenéticas do gênero Trigona, reforça a homogeneidade das espécies em relação ao conjunto diploide e a distribuição da heterocromatina. A variação interespecífica encontrada no mapeamento do gene ribossomal e a associação desse gene às regiões de heterocromatina ressaltam a importância dos rDNA como marcadores citogenéticos no entendimento da evolução do cariótipo no gênero Trigona e em outros Meliponini.
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40 Tabela 1. Morfologia cromossômica e número de registro na cinco espécies do gênero Trigona. Tipo de cromossomos segundo Imai (1991): A: acrocêntrico , Ae: acrocentrico totalmente eucromáticos, Am: pseudoacrocêntricos, Amc: pseudoacrocêntrico com cromatina pericentromérica.
Espécies Morfologia Cromossômicas Número de registro
2n Ae A Am Amc
T. pallens 34 2 - 32 - UFMG-IHY-1403740
T.williana 34 2 2 30 - UFMG-IHY-1403739
T. hypogea 34 - 2 24 8 UFMG-IHY-1403738
T. truculenta 34 4 - 24 6 UFMG-IHY-1403736
41 Tabela 2. Mapeamento do rDNA 18S nas espécies de abelhas Meliponini. São mostrados o número de pares portando o gene e localização do rDNA 18S.
Espécies Número de pares cromossômico
contendo rDNA Localização no cromossomo do rDNA Referências
Friesella schrottkyi 1 intersticial/ porção subtelomerica do braço heterocromático Mampumbu 2002
Melipona compressipes 1 porção terminal do braço longo Rocha et al 2002
Nannotrigona punctata 1 porção terminal do braço heterocromático Godoy 2014
Partamona helleri 3 a 4 posição terminal do braço longo Brito et al 2005
Partamona seridoensis 4 posição terminal do braço longo Brito et al 2005
Partamona sp. 1 posição terminal do braço heterocromático Godoy 2014
Plebeia sp. 1 par metacêntrico Maffeit et al 2001
Sacaptotrigona bipunctata 1 posição terminal do braço heterocromático Godoy 2014
Trigona truculenta 4 intersticial/ porção subterminal do braço heterocromático neste estudo
Trigona hypogea 2 intersticial/ porção subterminal do braço heterocromático neste estudo
Trigona pallens 1 posição intersticial do braço heterocromático neste estudo
Trigona sp. "fucipennis" grupo 2 intersticial/ porção subterminal do braço heterocromático neste estudo
Trigona spinipes 4 intersticial/ porção subterminal do braço heterocromático Ferreira et al 2015
42 Figura 1. Cariótipo das cinco espécies de Trigona segundo coloração convencional (a-e) e submentidos ao bandamento C (f-j). Trigona pallens (a-f), T. williana (b-g), T. hypogea (c-h),
Trigona sp grupo “fuscipennis” (d-i) e T. truculenta (e-j). Morfologia dos cromossomos
segundo Imai (1991): acrocêntrico totalmente eucromático (Ae), acrocêntrico (A), pseudoacrocentrico (Am) e pseudoacrocêntrico com heterocromatina pericentromérica (Amc). O arteriscos (*) indicam regiões mais fortemente coradas pela banda C nas espécies T. pallens e T. williana em alguns pares Am. As setas indicam a região centromérica dos cromossomos Amc.
44 Figura 2. Mapeamento do DNA ribossomal 18S nas cinco espécies de Trigona: (a) T. pallens (b) T. williana (c) T. hypogea (d), Trigona sp grupo “fuscipennis”, (e) T. truculenta. Barras: 5µm.
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