Todas as determinações analíticas a seguir descritas foram realizadas nos laboratórios do Centro de Desenvolvimento de Ciências e Técnicas de Produção Vegetal (CDCTPV), da Universidade do Algarve.
II.1.1.1. Análise dos solos, resíduos e compostos comerciais orgânicos utilizados nos ensaios
Em todos os ensaios realizados efectuou-se a análise sumária dos solos, dos resíduos orgânicos e dos compostos comerciais utilizados. De cada solo, utilizado nos ensaios em vaso, colheu-se uma amostra que foi seca ao ar livre e crivada por uma malha de 2 mm. No ensaio de campo, foi colhida uma amostra composta, dos 0 – 30 cm de profundidade, procedendo-se também à secagem ao ar livre e crivagem em malha de 2 mm. Posteriormente, as amostras de solo foram sujeitas às seguintes análises descritas por Page et al. (1982) e Carter (1993): a textura por pipetagem (Sheldrick e Wang, 1993), a matéria orgânica pelo método de Walkley-Black (Nelson e Sommers, 1982), o azoto pelo método Kjeldahl (Bremner e Mulvaney, 1982); o fósforo (Olsen e Sommers, 1982) e o potássio assimiláveis (Bates e Richards, 1993; Simard, 1993), o pH (McLean, 1982) e a condutividade eléctrica (Rhoades, 1982) (por medições electrométricas em suspensões de solo-água de 1:2,5 e 1:5, respectivamente). Foram ainda determinados o pH, a condutividade eléctrica, o azoto total, o fósforo e o potássio assimiláveis após a realização dos diferentes ensaios. As determinações do Mn, Cu, Zn, Cd, Cr, Ni e Pb assimiláveis no solo foram efectuadas por espectrofotometria de absorção atómica (ENSAIOS 3 e 4) (Ritas e Melida, 1990; Ure, 1990) após extracção através do método de Lakanen e Erviö (1971).
Os resíduos (lamas urbanas, lamas celulósicas, bagaço de uva e cascas de citrinos) e os compostos orgânicos comerciais (Guano Sansão e Setsolos) utilizados nos ensaios foram caracterizados quimicamente antes da sua utilização. Foram determinados o pH e a condutividade eléctrica por medições electrométricas em suspensões de resíduo-água de 1:2,5 e 1:5, respectivamente. Foram também determinados o teor de matéria orgânica por calcinação a 550 ºC e a concentração de azoto total pelo método de Kjeldahl. A cinza resultante da calcinação dos resíduos orgânicos foi tratada com uma solução diluída de HCl 3M onde posteriormente foi determinada a concentração de fósforo por espectrofotometria, a concentração de potássio por fotometria de chama e as concentrações de Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Cu, Cd, Cr, Ni e Pb por espectrofotometria de absorção atómica (Ritas e Melida, 1990; Ure, 1990).
II.1.1.2. Parâmetros biométricos, produção, análise nutritiva dos frutos e extracção de azoto nos mesmos
Durante o decorrer do ENSAIO 1, foram registados, semanalmente, a altura das plantas (m) e o número de folhas; no ENSAIO 2 foi registada a altura das plantas (m).
Nos ENSAIOS 1 e 2 fez-se a contagem do número de frutos e registou-se o peso fresco dos mesmos. Os frutos foram lavados com um detergente não iónico (Teepol) seguido de duas passagens por água destilada. Estes foram cortados às rodelas com uma espessura aproximada de 1 cm e secos a 80 ºC, até peso constante, para determinação do respectivo peso seco. As amostras de frutos foram trituradas em moinho de ágata e armazenadas em sacos de plástico, para posterior determinação das concentrações dos macronutrientes principais. Em ambos os ensaios, o azoto total foi determinado pelo método de Kjeldahl e o fósforo e o potássio totais por espectrofotometria e fotometria de chama, respectivamente. No ENSAIO 2, foram determinados o Ca, Mg, Mn, Cu, Zn, Cd, Cr, Ni e Pb por espectrofotometria de absorção atómica (Ritas e Melida, 1990).
A extracção de azoto pelos frutos nos ENSAIOS 1 e 2 e pelo alho porro no ENSAIO 3 foi calculada multiplicando os respectivos resultados percentuais da concentração de azoto pelo respectivo peso seco. Os resultados foram expressos em mg de N extraídos por planta. A extracção percentual resultante da razão entre a quantidade de azoto extraído pelos frutos, ou pela planta no caso do alho porro, com a quantidade de azoto aplicado em cada modalidade, através dos diferentes resíduos, adubos e águas com concentração elevada de nitrato, foram expressos em % de N extraído por planta.
II.1.1.3. SPAD e concentração de azoto nas folhas de pepino (ENSAIO 1) e de tomate (ENSAIO 2)
Realizaram-se medições semanais (ENSAIOS 1 e 2) e quinzenais (ENSAIO 4) dos valores SPAD nas folhas mais velhas das plantas das respectivas culturas com o objectivo de estimar a concentração foliar de azoto total e identificar possíveis desequilíbrios nutricionais, uma vez que a carência deste elemento provoca como principal sintoma uma clorose generalizada dessas folhas. Estes valores foram medidos através de um aparelho portátil SPAD-502, da Minolta. As unidades, ou valores SPAD, resultam de um processo de medição da luz transmitida através da folha depois de submetida, sequencialmente, a dois tipos de radiação: uma na zona do vermelho (650 nm), correspondente a um pico de absorção das moléculas de clorofila e a outra na zona do infravermelho (940 nm), que actua como referência. A luz que é transmitida pelas folhas é convertida em sinais eléctricos que são convertidos, pelo processador do aparelho, em unidades, ou valores, SPAD.
Determinaram-se curvas de calibração para as espécies utilizadas e o valor do coeficiente de determinação (R2) foi calculado como medida da interrelação entre os valores SPAD e a concentração foliar de azoto total. Para tal, colheram-se amostras de folhas com diferentes graus de clorose com o objectivo de se estimar a concentração de N total através dos valores SPAD. Estas foram lavadas com detergente não iónico, seguidas de duas passagens por água destilada. Foram secas com papel absorvente e determinados os valores SPAD. Folhas com registos de SPAD aproximados foram agrupadas para secagem a 80 ºC, até peso constante. Posteriormente foram trituradas em moinho de ágata, seguida da determinação da concentração de azoto total, pelo método de Kjeldahl. Todos os valores de SPAD obtidos ao longo do ciclo vegetativo das culturas de pepino (ENSAIO 1), de tomate (ENSAIO 2) e de citrinos (ENSAIO 4) foram convertidos em % de azoto total, segundo a utilização das respectivas curvas de calibração.
II.1.1.4. Clorofila total
Realizaram-se medições dos valores SPAD nas folhas das culturas dos ENSAIOS 1, 2 e 4 tal como foi descrito em II.1.1.3., já que, segundo alguns autores (Abadía e Abadía, 1993; Balasubramanian et al.,
1999; Madakadze et al., 1999, Pestana, 2000), esta metodologia tem permitido estimar, não destrutivamente, a concentração de clorofila total de algumas espécies vegetais.
O procedimento de extracção e de leitura foi realizado conforme descrito por Abadía e Abadía (1993). Foram colhidas folhas com diferentes graus de clorose; dessas folhas retiraram-se discos foliares, de 0,36 cm2 de área e medidos, posteriormente, os valores SPAD. De seguida, efectuou-se a extracção dos pigmentos, em meio frio e escuro, com acetona a 100%. Determinaram-se as absorvâncias das amostras por espectrofotometria a dois comprimentos de onda: 661,6 nm, clorofila a; 644,8 nm, clorofila b. A conversão dos valores obtidos de absorvância (Abs), para cada comprimento de onda, para a clorofila total (mg.L-1) realizou-se de acordo com as equações propostas por Lichtenthaler (1987):
Clorofila a = 11,24 x Abs661,6 – 2,04 x Abs644,8 Clorofila b = 20,13 x Abs644,8 – 4,19 x Abs661,8
Clorofila total = Clorofila a + Clorofila b
O valor do coeficiente de determinação (R2) foi calculado como medida da interrelação entre os valores SPAD e a concentração foliar de clorofila total. Todos os valores de SPAD obtidos ao longo do ciclo vegetativo das culturas de pepino (ENSAIO 1), de tomate (ENSAIO 2) e de citrinos (ENSAIO 4) foram convertidos em µmoles de clorofila total por m2, segundo a utilização das respectivas curvas de calibração.
II.1.1.5. Análise foliar
No final dos ENSAIOS 2 e 3 foram colhidas folhas para a determinação das concentrações de N, P e K. Do ENSAIO 3, foi separado material vegetal para análises químicas e para análises microbiológicas (descritas em II.4.2.1.). O material vegetal colhido, para realização das determinações químicas, dos ENSAIO 2 e 3, foi lavado com detergente não iónico, seguido de duas passagens por água destilada e finalmente secos a 80 ºC, em estufa, até peso constante. As amostras foram trituradas num moinho de ágata e guardadas em sacos de plástico, para as determinações químicas subsequentes: nos ENSAIOS 2 e 3, o N (método de Kjeldahl), o P e o K [por espectrofotometria no visível (método do vanadomolibdato de amónio) e de chama, respectivamente]; no ENSAIO 3, o Ca, o Mg, o Mn, o Cu, o Zn, o Cd, o Cr, o Ni e o Pb foram determinados por espectrofotometria de absorção atómica (Ritas e Melida, 1990).
II.1.1.6. Análise química das águas com concentração elevada de nitrato utilizadas na rega das modalidades CN1 e CN2 (ENSAIOS 1 e 2), da água de rega e dos lixiviados (ENSAIOS 1, 2, 3 e 4)
Nas águas utilizadas na rega das modalidades CN1 e CN2 (ENSAIOS 1 e 2) e na água de rega utilizada nas restantes modalidades, foram determinados o pH e a condutividade eléctrica por electrometria. A concentração de nitrato foi avaliada por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (Zurhake e Wander, 1985), a concentração do ião fosfato por espectrofotometria no visível e a concentração de potássio por fotometria de chama. As concentrações de azoto amoniacal, do ião sulfato e do ião bicarbonato foram determinadas por colorimetria através de um kit de análises rápidas.
No final dos ENSAIOS 1, 2 e 3 o processo de lixiviação foi forçado em todos os vasos. O solo foi sujeito a um período de secagem ao ar livre, após o qual, foi aplicada água destilada, registando-se a quantidade necessária para a obtenção de uma amostra do lixiviado com volume suficiente para a realização das análises químicas. Essa amostra foi colhida num prato de recepção colocado por baixo do vaso. As amostras colhidas foram posteriormente filtradas com papel de filtro Whatman n.º 42 e guardadas em frasco de plástico com capacidade de 100 ml. Estes foram armazenados à temperatura de 4 ºC até à determinação dos seguintes parâmetros: o pH e a condutividade eléctrica (ambos por electrometria), a concentração de nitrato [por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) - ENSAIOS
1 e 2 - e por electrometria com eléctrodos selectivos - ENSAIOS 3 e 4], a concentração do ião fosfato (espectrofotometria no visível) e a concentração de potássio (espectrofotometria de chama). Nos ENSAIOS 2, 3 e 4 foram determinadas as concentrações de Cu, Zn, Cd, Cr, Ni e Pb por espectrofotometria de absorção atómica.
II.1.1.7. Análise estatística dos resultados
Os resultados da análise química do solo no final do ensaio (ENSAIOS 1, 2, 3 e 4), do crescimento vegetativo, respectivamente da altura das plantas (ENSAIOS 1 e 2) e dos acréscimos da altura das árvores e do diâmetro dos troncos (ENSAIO 4), dos parâmetros biométricos (ENSAIOS 1, 2 e 4), da análise química das folhas (ENSAIOS 2, 3 e 4) e frutos (ENSAIOS 1, 2 e 4), da quantidade de azoto extraído por planta e da eficiência de utilização daquele elemento (ENSAIOS 1, 2 e 3), das concentrações foliares de clorofila (ENSAIOS 1, 2 e 4) e de azoto totais (ENSAIOS 1 e 2) estimadas com a medição dos valores SPAD, da produção (ENSAIOS 1, 2, 3 e 4) e da análise química dos lixiviados (ENSAIOS 1, 2, 3 e 4), do peso e da percentagem de sumo por laranja (m/m), do º Brix e da acidez do sumo, do índice de maturação e dos valores da concentração de Cd, Cr, Ni e Pb também no sumo (ENSAIO 4) foram submetidos a uma análise de variância (ANOVA), sendo as diferenças consideradas significativas sempre que p<0,05. A ANOVA foi precedida de uma verificação da vigência das principais premissas de aplicabilidade do método (Zar, 1999), nomeadamente no respeitante à normalidade de distribuição e de homogeneidade das variâncias das populações. Quando foram observadas violações destas premissas, foi feita a transformação dos dados originais para uma escala adequada e susceptível de repor as condições de aplicabilidade referidas. Para efeitos de apresentação dos resultados, as médias das variáveis transformadas foram apresentadas na forma original. A análise comparativa das médias das modalidades foi efectuada através do New Multiple-
Range Test (Duncan, 1955).
Os resultados das análises microbiológicas foram analisados estatisticamente pela ANOVA. O valor do coeficiente de determinação (R2) foi calculado como medida da interrelação entre: - os valores SPAD e a concentração foliar de clorofila total (ENSAIOS 1, 2 e 4);
- os valores SPAD e a concentração foliar de N (ENSAIOS 1, 2 e 4), Mg, Fe, Mn, Cu e Zn (ENSAIO 4); - a condutividade eléctrica e a concentração de nitrato (ENSAIOS 1, 2, 3 e 4) e de potássio (ENSAIOS 2 e 4) na solução do solo.
O tratamento estatístico descrito foi feito utilizando o programa de análise estatística SPSS 11.0 (SPSS Inc., 1989-2002, Chicago, Illinois, U.S.A.).
II.2. ENSAIO 1 - Estudo da aplicação de resíduos orgânicos, adubos e água com