Lectinas podem apresentar diferentes atividades biológicas significativas. Um exemplo disso é sua utilização como ferramentas antineoplásicas. Nesse contexto, tais proteínas conseguem interagir com alvos celulares específicos e desencadear a apoptose de células cancerígenas.
Animais multicelulares frequentemente necessitam se livrar de células que estão em excesso ou mesmo que são potencialmente danosas para o organismo. Para tal fim, um sistema de reações moleculares está disponível, podendo este ser chamado de apoptose ou morte celular programada (VAUX; KORSMEYER, 1999). Trata-se de um processo de morte celular autodestrutivo, geneticamente regulado e muito importante em várias neoplasias (LIU et al., 2008).
Os mecanismos bioquímicos da apoptose envolvem uma série de reações em cascata que são orquestradas por proteínas homólogas umas as outras e que fazem parte de uma grande família chamada de caspases − proteases cisteínicas e aspárticas (ALNEMRI et al., 1996). Aproximadamente uma dúzia de caspases tem sido encontradas nos seres humanos e acredita-se que pelo menos dois terços destas estejam relacionados com a apoptose (THORNBERRY et al., 1998; EARNSHAW et al., 1999).
Todas as caspases descobertas possuem um sítio ativo cisteínico e clivam substratos quando ocorrem ligações do tipo Asp–Xxx (a clivagem ocorre após resíduos de ácido aspártico). Os quatro resíduos de aminoácidos localizados de forma N-terminal ao sítio de clivagem das caspases determinam a especificidade destas por diferentes substratos (THORNBERRY et al., 1997).
Assim como ocorre na maioria das proteases, as caspases são sintetizadas como zimogênios enzimaticamente inertes, sendo estes compostos por três domínios: um pro- domínio N-terminal e outros dois domínios chamados de p20 e p10, os quais são também encontrados na enzima madura. A enzima madura, por sua vez, é um heterotetrâmero contendo dois heterodímeros p20/p10 e dois sítios ativos (EARNSHAW et al., 1999).
A maioria das caspases é ativada através da clivagem proteolítica do zimogênio, que pode ocorrer entre os domínios p20 e p10 ou entre o pro-domínio e o domínio p20. Três modelos diferentes são propostos para a ativação das caspases. O primeiro propõe que a
ativação ocorra através da exposição de uma procaspase a uma caspase previamente ativada (upstream) (Figura 3.1a, p.39). Esta estratégia de ativação, através de uma “cascata de caspases”, é utilizada extensivamente pelas células para a ativação das caspases 3, 6 e 7, as quais possuem pro-domínios bastante curtos e são as caspases mais abundantes nas células; conhecidas como caspases efetoras, pois os substratos que estão diretamente envolvidos com a apoptose são clivados por elas (THORNBERRY et al., 1997).
Apesar deste modelo ser bastante útil, ele não explica como ocorre a ativação da primeira caspase, ou seja, a iniciadora de todo o processo. A caspase 8 é a iniciadora da via apoptótica conhecida como “via extrínseca”, a qual recebe o sinal provindo dos domínios FAS-FASL (domínios de morte). A ativação da caspase 8 inicia-se logo após a interação entre FAS e FASL, através da formação de complexos sinalizadores ligados a membrana. Tais complexos recrutam, através de proteínas adaptadoras, várias moléculas de procaspase 8, resultando numa alta concentração do zimogênio. O segundo modelo ou modelo da “proximidade induzida” (Figura 3.1b, p.39) propõe que em condições de elevada concentração do zimogênio, apesar da baixa atividade proteásica intrínseca da procaspase 8, ocorra a ativação das pro-enzimas através da clivagem mútua resultante da atividade proteásica intrínseca das procaspases (SALVESEN; DIXIT, 1999).
O terceiro modelo é o mais complexo descrito até agora na literatura. A ativação da caspase 9, provinda da “via intrínseca” da apoptose, ocorre após interação com um cofator chamado de APAF-1 (Figura 3.1c, p.39). Este cofator juntamente com o citocromo c são requeridos para a ativação da caspase 9. Por muito tempo o APAF-1 foi visto apenas como um cofator transitório, que servia apenas para a inicialização do processo de ativação. Atualmente sabe-se que APAF-1/caspase 9 representa a forma ativa da enzima, e que está envolvido em complexos mecanismos de regulação (CAIN et al., 1999; BEERE et al., 2000).
Em síntese, caspases efetoras são geralmente ativadas proteoliticamente através da clivagem por uma caspase previamente ativada, enquanto caspases iniciadoras são ativadas através da participação de mecanismos extremamente regulados (HENGARTNER, 2000).
Figura 3.1 − Ilustração dos distintos modelos de ativação das caspases. A clivagem proteolítica por uma caspase previamente ativada está exemplificada em (a). Tal mecanismo pode também ser utilizado por proteases não- caspases, como ocorre na ativação da granzima B. No modelo mostrado em (b), a ativação da procaspase 8 se dá a partir do recrutamento e formação de complexos proteicos idênticos, através da ativação cruzada. Na formação da holoenzima vista em (c) o citocromo c e a oligomerização ATP-dependente de APAF, permitem o recrutamento da procaspase 9, formando o apoptosoma. A ativação da procaspase 9 se dá através de alterações conformacionais não relacionadas à proteólise.
Fonte: Retirada de HENGARTNER, 2000.
Como citado anteriormente, a apoptose pode ser iniciada a partir de duas vias já bastante estudadas, a via extrínseca e a intrínseca. Trata-se de uma tentativa “didática” de classificar a apoptose a partir do local (ou compartimento) de onde partiu o sinal para que a célula inicie seu programa de morte.
Na via extrínseca, um complexo proteico conhecido como receptor da morte é ativado por estímulos provindos do exterior da célula, principalmente pelo acoplamento de CD95 a CD95L ou pela ação do TNF sobre seu respectivo receptor. Imediatamente após o estímulo, ocorre o agrupamento de tais receptores e a formação de um complexo proteico, o qual sinalizará para o início dos mecanismos que direcionarão a célula à morte. Este complexo recruta, por via da molécula adaptadora FADD (Fas-associated death domain),
múltiplas moléculas de procaspase 8. A ativação da caspase 8 pode ser bloqueada pelo recrutamento da caspase homóloga degenerada c-FLIP (Figura 3.2) (IRMLER et al., 1997).
Figura 3.2 − Ilustração das vias envolvidas na ativação da apoptose. A apoptose pode ser iniciada a partir de estímulos provenientes de duas vias diferente. O lado esquerdo da figura demonstra a sinalização pela via extrínseca. Nota-se que múltiplas moléculas de procaspase 8 são recrutadas pelo FADD e ativadas através do modelo da proximidade induzida (descrito no texto). A proteína C-FLIP pode impedir a ativação da procaspase 8. No lado direito da ilustração está demonstrada a via intrínseca de ativação, que ocorre, principalmente, após dano irreversível ao DNA. A combinação entre baixa expressão de genes anti-apoptóticos (BCL-2 e BCL-xL) e alta expressão de genes pró-apoptóticos (Bax e Bad), induz a liberação do citocromo c, o qual servirá de cofator, juntamente com Apaf-1 para a ativação da procaspase 9 através da formação da holoenzima chamada de apoptosoma. Ambas as vias convergem para ativar a procaspase 3. As proteínas IAPs podem impedir a ativação da procaspase 3, entretanto, estão são impedidas pela ação da proteína Smac/DIABLO.
A via intrínseca é utilizada quando ocorrem danos internos irreversíveis, principalmente no que se refere aos que são sofridos pelo DNA. Tais danos são refletidos e convergidos para a mitocôndria, frequentemente através da ativação de genes pró-apoptóticos da família BCL-2. A família BCL-2 é subdividida em 3 grupos diferentes, sendo os membros do grupo 1 (BCL-2 e BCL-xL)anti-apoptóticos. Ao contrário do que ocorre com BCL-2, o
qual passa grande parte de sua vida aderido às membranas intracelulares, os membros dos outros grupos conseguem transitar facilmente ente o citosol e as organelas. As formas citosólicas representam “pools” de proteínas inativas, entretanto preparadas para ativação a qualquer momento. Proteínas pro- e anti-apoptóticas se encontrarão na superfície da mitocôndria, onde irão competir para a regulação da saída do citocromo c. Caso o sinal proveniente da mitocôndria seja uma “ordem” pro-apoptótica, algumas moléculas serão liberadas da mitocôndria, dentre as quais o citocromo c. Logo em seguida, o citocromo c se associará com Apaf-1 e com procaspase 9 para formar o apoptossoma. Após ativação da procaspase 9, a via convergirá para o nível de ativação da caspase 3 (Figura 3.2, p. 40) (ADAMS; CORY, 1998; GROSS et al., 1999; PUTHALAKATH et al., 1999; ANTONSSON; MARTINOU, 2000).
Considerando que as moléculas ou até mesmo as vias apoptóticas necessárias para a supressão da tumorigênese sejam devidamente identificadas, a modulação da apoptose pode emergir como um bom alvo para a terapia do câncer (LIU et al., 2010).
Algumas pesquisas sugerem que os mecanismo apoptótico de células tratadas com lectinas vegetais ocorra tanto através da via mitocondrial quanto pela via do domínio da morte (Figura 3.3, p. 42) (HEIKE et al., 1999; MICHAEL, 2000; SUEN et al., 2000; KIM et al., 2001; LYU et al., 2002; HOSTANSKA et al., 2003; KIMA et al., 2003; POLITO et al., 2009; LIU et al., 2009a,b,c,d,e).
Levando-se em conta a alta complexidade estrutural, bem como a grande diversidade de moléculas de carboidratos que compõem a superfície da célula, faz sentido acreditar que a apoptose ocorra após interação direta e/ou indireta de lectinas com componentes glicosilados que fazem parte de algum dos níveis de iniciação ou maturação da apoptose, sejam eles de origem superficial ou intracitoplasmática.
Figura 3.3 − Ilustração da base molecular da apoptose induzida por lectinas. A apoptose mediada por lectinas vegetais é principalmente mediada pelas via mitocondrial e/ou de domínio da morte.
Fonte: retirada de LIU et al., 2010.
3.1.2 Autofagia
Desde muito tempo as lectinas tem sido estudadas com relação ao seu potencial antineoplásico (MODY et al., 1995; GORELIK et al., 2001; MEJIÁ et al., 2003; SCHUMACHER et al., 2003; VALENTINER et al., 2003; CHOI et al., 2004; MEJIÁ et al., 2005). Consequentemente, tais estudos mostram que uma grande diversidade de atividade biológicas foram atribuídos à presença de lectinas. Dentre tais atividades, certamente ganham destaque a apoptose (anteriormente citada) e os processos de autofagia.
A autofagia pode ser caracterizada como um processo celular que ocorre em resposta ao estresse que a célula sofre. Durante muito tempo a autofagia tem sido investigada. Entretanto, nos últimos anos vem ganhando grande destaque no cenário das pesquisas envolvendo o efeito biológico de lectinas vegetais. Quando as células passam por um estresse, seja através de limitações nutricionais, calor, estresse oxidativo ou mesmo por organelas em excesso, a autofagia é ativada como um mecanismo de degradação. O objetivo da autofagia está claramente delimitado: a eliminação de componentes potencialmente danosos, que pode ocorrer em conjunto com a reciclagem de nutrientes (LEVINE; KLIONSKY, 2004). Os
processos autofágicos podem ser divididos em três tipos principais: macroautofagia, microautofagia e autofagia mediada por chaperonas (TSUCHIHARA et al., 2009). Além de ter um papel importante na taxa de crescimento dos componentes celulares, bem como na reposta à privação nutricional, a autofagia é igualmente importante no suicídio de células tumorais (RUBINSZTEIN et al., 2007). Além disso, recentes estudos tem demonstrado que é possível que haja uma espécie de co-regulação entre autofagia e apoptose, e que a autofagia possa participar da morte celular que ocorre nos mamíferos (LEVINE, 2007; KESSEL; REINERS et al., 2007). Alguns pesquisadores acreditam, inclusive, que os mecanismos apoptóticos e autofágicos estejam interconectados e regulados simultaneamente pelo mesmo mecanismo regulador (HANNIGAN; GORSKI, 2009). Na pesquisa dos efeitos biológicos de lectinas, a autofagia vem ganhando espaço, pois tem sido evidenciado que a morte celular induzida por lectinas possa ser realizada também a partir da execução de mecanismos autofágicos (LEI; CHANG, 2009; LIU et al., 2009b). Tal processo está esquematicamente ilustrado na figura 3.4.
Figura 3.4 − Ilustração dos mecanismos moleculares envolvidos na autofagia induzida por lectinas vegetais. Nas células tumorais (hepatócitos) a autofagia induzida por lectina ocorre pelas via mitocondrial mediada por BNIP3 e/ou por ROS−p38−p53. ROS = espécies reativas de oxigênio.
3.2 Objetivos
3.2.1 Geral
Avaliar o potencial de lectinas vegetais estruturalmente relacionadas, isoladas de sementes de leguminosas, sobre a apoptose de células da linhagem A549 (carcinoma de pulmão humano).
3.2.2 Específicos
• Verificar a interação das lectinas ConA, ConBr, ConBol, Cgran e CGL, conjugadas ao isotiocianato de fluoresceína, com as células A549;
• Avaliar se tais lectinas são internalizadas ou se exercem seu potencial a partir da interação direta com a membrana plasmática;
• Determinar o potencial pro ou antiapoptótico das lectinas ConA, ConBr, ConBol, Cgran e CGL sobre as células neoplásicas A549;
• Analisar a expressão gênica de proteínas intimamente relacionadas com o processo apoptótico em células A549;
• Contribuir para o entendimento da via envolvida na apoptose de células A549 desencadeada pelas lectinas outrora descritas.
3.3 Materiais e métodos
3.3.1 Lectinas
As lectinas utilizadas neste estudo foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada, coordenador do Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (Biomol-lab) do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará. Tratam-se de lectinas isoladas a partir de sementes de leguminosas. A tabela 2.1 apresenta os nomes das espécies das quais as proteínas foram isoladas, seus respectivos acrônimos, além da referências bibliográficas que contém a metodologia utilizada nas etapas de purificação.
Tabela 3.1 − Lista de espécies, acrônimos, especificidade por carboidratos e referências de purificação das lectinas utilizadas no presente estudo
Lectina de Sigla Especificidade Referências
Canavalia ensiformis ConA Glicose/Manose SUMMER; HOWELL, 1936
Canavalia brasiliensis ConBr Glicose/Manose MOREIRA; CAVADA, 1984
Canavalia boliviana CBol Glicose/Manose MOURA et al., 2009
Canavalia gladiata CGL Glicose/Manose KOJIMA et al., 1991
Canavalia grandiflora Cgran Glicose/Manose CECCATTO et al., 2002
Fonte: Ver campo “Referências”.
3.3.2 Células
A linhagem celular utilizada no presente trabalho foi a A549 (carcinoma de células epiteliais de pulmão humano). Tal linhagem foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Tiago Collares do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas. A linhagem A549 foi adquirida junto ao Banco de Células do Rio de Janeiro (Universidade Federal do Rio de Janeiro).