15.1.1. Síntese de cDNA (RT)
A síntese de cDNA foi realizada a partir de 1 g de cada um dos RNAs totais extraídos e previamente tratados com DNase. Nesta etapa, utilizou-se oligo d(T) e a enzima ImProm-II Reverse Transcriptase (Promega), conforme instruções do fabricante.
A fim de confirmar a eficiência da RT e verificar possíveis contaminações do cDNA sintetizado com DNA genômico, todas as amostras foram submetidos à reação de PCR (Polymerase Chain
Reaction). Nesta, utilizou-se um par de iniciadores, que amplifica um gene humano constitutivo
(BIRC-2), desenhado em éxons diferentes. Assim, a banda correspondente ao cDNA apresenta 323 pb, enquanto que aquela correspondente ao DNA genômico apresenta 523 pb.
Condição da Reação de PCR:
Para a PCR descrita acima, utilizaram-se reações com volume final igual a 25 l, estando os
reagentes presentes nas seguintes concentrações: Tampão 1X (CENBIOT), 1.5 mM MgCl2
(CENBIOT), 0.1 mM dNTP, 0.32 M Primer BIRC-2 foward, 0.32 M Primer BIRC-2 reverse, 0.25 l Taq Polimerase (CENBIOT), 50 ng cDNA e água Mili-Q em quantidade suficiente para atingir o volume final de 25 l.
A ciclagem utilizada está descrita a seguir: 10 minutos à 95ºC
(95ºC por 30 segundos, 60ºC por 30 segundos, 72ºC por 1 minuto) – 35 ciclos 10 minutos a 72ºC
15.1.2. Análise de expressão gênica por PCR em Tempo Real
Inicialmente, as amostras de cDNA provenientes da transcrição reversa foram utilizadas em experimento de PCR em Tempo Real. As diferenças de expressão observadas nas análises por
Microarrays de cDNA foram confirmadas por esta técnica.
Os pares de iniciadores foram desenhados com o auxílio do programa Primer Express 3.0, seguindo os seguintes parâmetros:
- o amplicon deve ter 1 ou mais introns, a fim de evitar amplificação de DNA genômico contaminante;
- o par de iniciadores deve ser específico, a fim de evitar amplificação de pseudogenes ou de genes relacionados;
- os amplicons devem ter entre 50 e 150 pares de bases;
- a temperatura de melting (Tm) deve estar entre 58 e 60ºC;
- as últimas 5 bases da extremidade 3’ não podem conter mais de duas bases C e/ou G;
Precedente às validações, foi necessário otimizar as condições para garantir eficiências comparáveis de amplificação. A concentração ideal dos pares de oligonucleotídeos iniciadores foi determinada realizando reações idênticas de amplificação, porém com quantidades crescentes desses, de 100nM-800 nM, através da identificação da situação na qual não ocorre a formação de dímeros e onde a amplificação é mais robusta. Outro fator importante atestado foi se as eficiências de amplificação dos transcritos alvos e do transcrito referência, em função da concentração de RNA utilizado, são aproximadamente iguais.
Padronização das Reações de PCR em Tempo Real e Cálculo da Eficiência de Amplificação
A fim de se mensurar a eficiência de amplificação de cada um dos pares de iniciadores, foram feitas reações utilizando diluições seriadas de cDNA (100 nM; 10 nM; 1 nM; 0.1 nM e 0.01 nM), em duplicatas. Para o cálculo da eficiência utilizou-se a fórmula: eficiência = 10-1/slope, na qual o
slope representa o grau de inclinação da regressão linear obtida a partir da curva padrão dos Cycle Threshold (Cts) destes 5 pontos. Estes valores de eficiência foram utilizados no cálculo da
diferença de expressão entre os diferentes grupos de amostras utilizados. As reações foram realizadas no aparelho ABI Prism® 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems), em placas transparentes de 96 poços (Applied Biosystems), cobertas com adesivo transparente (Applied Biosystems). O volume final de cada reação foi de 20 µl, sendo 10 µl de SYBR® Green
PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5 µl de cDNA e 5 µl de iniciadores.
Após esta padronização foram feitas reações para cada um dos genes a serem avaliados. Estas foram feitas em triplicata, sendo apenas um controle negativo sem template. A concentração de
cDNA utilizada foi de 10 ng e a dos iniciadores igual a 400 nM, em todos os casos. Tanto as concentrações dos iniciadores, quanto a de cDNA a serem utilizados foram padronizadas considerando a utilização da menor concentração possível, que corresponde ao menor CT de amplificação. A ciclagem usada foi de 2 minutos a 50ºC (ativação da enzima AmpErase), 10 minutos a 95ºC (ativação da AmpliTaq Gold DNA Polymerase), seguidos de 40 ciclos de desnaturação a 95ºC por 15 segundos e 1 minuto a 60ºC (anelamento e extensão – etapa na qual ocorre a coleta da fluorescência emitida). Foi adicionada, ao final da reação, uma etapa extra de 15 segundos a 95ºC, 30 segundos a 60ºC e 15 segundos a 95ºC, para a análise da curva de dissociação das amostras. Essa análise serviu para confirmar a especificidade da amplificação (a especificidade também foi analisada através de géis de poliacrilamida 8% corados com prata).
Cálculo da Diferença de Expressão Gênica
A quantificação foi baseada na observação da abundância dos produtos no ciclo de PCR onde as reações estão em fase exponencial de amplificação. O acúmulo dos produtos de PCR nessa fase foi detectado em tempo real, através da ligação do SYBR® Green, que é uma molécula cuja emissão de fluorescência aumenta várias vezes quando ligada ao DNA dupla-fita. Através da definição arbitrária da região exponencial de amplificação, foram determinados os CTs de cada transcrito. O valor relativo da expressão foi dado pela diferença (ΔCT) entre o CT do gene alvo e o CT do gene de referência, GAPDH (um gene de expressão constitutiva, que normalmente não apresenta variação de expressão entre as amostras estudadas). Os resultados finais foram expressos como FOLD, aplicando a fórmula 2–ΔCT (Pfaffl, 2001). A significância estatística das diferenças de expressão observadas (p-values) foi determinada usando Student’s t-test, assumindo uma distribuição bicaudal e um modelo de variância heterocedástico.
Ratio=(E gene alvo) ∆Ct Ref-∆Ct amostra
(E gene normalizador) ∆Ct Ref-∆Ct amostra
Ratio = Diferença de expressão entre a amostra e a referência (fold) E = Valor da Eficiência de amplificação
Gene alvo = cada um dos genes a serem normalizados Gene normalizador = α-Tubulina
Referência = cDNA proveniente de amostra transfectada com o vetor pLXSN vazio ΔCT = CT Ref - CT amostra
CT = Média dos CT