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O sistema convencional de cultura de PHKs em monocamada seleciona aquelas células capazes de proliferar. Nestas condições estas células apresentam capacidade limitada de diferenciação. Por outro lado, o sistema de raft permite a proliferação e a diferenciação celular de maneira semelhante à observada nos epitélios escamosos, permitindo inclusive a identificação das camadas características deste tipo de tecido (Chow e Broker, 1997).

A fim de avaliar as alterações morfológicas decorrentes do tratamento com TNF em rafts de PHKs normais e que expressam os oncogenes E6 ou E7, selvagens e mutantes, foi realizada coloração com hematoxilina-eosina (HE) para cada uma das amostras. Na figura 21 são apresentados exemplos das alterações observadas. Pode-se verificar que PHKs transduzidos com vetores retroviral pLXSN vazio não apresentam alterações decorrentes da infecção, quando

comparados com a célula normal. Ambos apresentam uma estrutura epitelial ordenada com um padrão característico de diferenciação nas camadas parabasais e suprabasais do epitélio.

Nos rafts transduzidos com o gene E6 observou-se um discreto aumento da espessura do epitélio, mais precisamente um aumento da espessura da camada espinhosa. Esse fenômeno é conhecido como acantose e é normalmente observado em epitélios infectados por HPV. Por

outro lado, as culturas que expressam o mutante 16E6 ∆9-13, incapazes de induzir a

degradação de p53, apresentaram uma organização tissular semelhante à observada em rafts derivados de PHKs normais (figura 21).

A expressão da oncoproteína E7, por sua vez, promoveu à desorganização arquitetural do epitélio, com presença variável de camada granular e córnea, e com células em proliferação em todas as camadas, ou seja, ocorreu a perda de polarização do tecido, não sendo mais possível a identificação das diferentes camadas do epitélio . Além disso, observou-se um alargamento da camada espinhosa e de transição. Mais ainda, foi observada a retenção de núcleos nas camadas mais superficiais. Os núcleos celulares eram maiores assim como a relação núcleo- citoplasma. Estas alterações são características das displasias cervicais observadas in vivo. No entanto, em rafts derivados de PHKs transduzidos com o vetor retroviral que expressa o mutante 16E26G da proteína E7, incapaz de transformar células de roedor e de induzir a degradação de pRb, observou-se uma organização tissular semelhante à observada naqueles derivados de PHKs normais.

Estas observações indicam que as alterações morfológicas causadas por E7, e mais atenuadamente por E6, são semelhantes às observadas nas displasias uterinas in vivo e dependem, pelo menos em parte, da degradação das proteínas pRb e p53.

Após o tratamento com TNF os rafts apresentaram uma morfologia mais achatada em todas as camadas do epitélio. No entanto, este achatamente não está correlacionado à diminuição no número de camadas celulares no tecido e sim à alteração morfológica das células que compoem cada estrato. Este achatamento foi mais evidente naqueles derivados de PHKs normais, transduzidos com o vetor pLXSN e com vetores que expressam os genes E6 selvagem e os mutantes de E6 e E7. No entanto, este efeito, porém mais atenuado, também foi observado nos rafts elaborados a partir de PHKs que expressam o gene E7. Estas alterações morfológicas induzidas pelo TNF foram consistentemente observadas (com variações entre experimentos) em todos os rafts analisados independentemente dos genes de HPV expressos (Enrique, 2002; Boccardo et al., 2004).

figura 21: Imagens de cortes transversais de rafts de PHK normal e transduzidos com E6wt e E7wt de HPV 16 ou com mutantes incapazer de ligar a p53 e pRb, respectivamente, após coloração com Hematoxilina e Eosina. Notar as alterações morfológicas induzidas pelo gene viral e aquelas resultantes do tratamento com TNF.

CONTROLE PHK pLXSN E6 wt E6 ∆9-13 E7 wt E7 E26G TNF

Em 1998, McCance e colaboradores mostraram que rafts desenvolvidos na presença de HPV16 reproduzem alterações morfológicas semelhante às observadas em lesões intraepiteliais cervicais (Mccance, 1998). Em nosso caso, o aparecimento das alterações morfológicas descritas pode ter sido favorecido pelos altos níveis de expressão dos oncogenes virais induzido pelo promotor retroviral.

O genoma do HPV contém dois segmentos principais, sendo cada um constituído por uma série de fases aberta de leitura (ORFs), que são transcritas em RNAs policistrônicos a partir de uma única fita do DNA e codificam para as proteínas virais. A expressão gênica é dividida em precoce (E - early) e tardia (L - late). O segmento E, que representa 45% do genoma, é constituído por oito ORFs e codifica proteínas relacionadas com a replicação e controle do genoma. O segmento L, que representa 40% do genoma, é responsável por codificar as proteínas estruturais do capsídeo do vírus. Entre os segmentos L e E existe um outro segmento que representa 15% do genoma e contém elementos regulatórios. Esta região, chamada de região reguladora upstream (URR –Upstream Regulatory Region) ou região controladora longa (LCR- Long Control Region) concentra seqüências reguladoras importantes na replicação e na transcrição viral (Howley, 2001). A LCR é o sítio de ligação de fatores de transcrição celulares e virais que ativam ou reprimem a atividade do promotor p97, regulando assim a transcrição de vários genes do HPV16, especialmente os oncogenes E6 e E7 (Mistry et al., 2007). A transcrição é finamente regulada pelo estado de diferenciação das células do epitélio infectado, através da atividade do promotor dos HPVs, sendo baixa na camada basal e alta nas camada suprabasais do mesmo (Chow et al., 1987; Dollard et al., 1992; Meyers et al., 1992; Barksdale e Baker, 1993; Klumpp e Laimins, 1999). De fato, é nas camadas suprabasais onde se observam os maiores níveis de expressão das oncoproteínas virais E6 e E7 (muito pouco expressas nas células da camada basal). Este tipo de regulação fina não ocorre quando se utiliza um vetor de expressão

que transcreve sob controle do promotor constitutivo presente na repetição terminal longa (LTR). A LTR é o centro de controle da expressão gênica retroviral. No caso do vetor retroviral pLXSN, a expressão dos genes nele clonados ocorre a partir do promotor da LTR. Por outro lado, a expressão do gene que confere resistência a neomicina, e permite a seleção das células infectadas, tem sua expressão controlada pelo promotor do SV40 (Miller e Rosman, 1989). No sistema de raft utilizado neste estudo, a LTR está fortemente ativa nas células de todas as camadas do epitélio, promovendo a expressão constitutiva das oncoproteínas E6 e E7 do HPV (Chow e Broker, 1997).

A LTR é o centro de controle da expressão gênica retroviral. No caso do vetor retroviral pLXSN, a expressão dos genes nele clonados ocorre a partir do promotor da LTR. Por outro lado, a expressão do gene que confere resistência a neomicina, e permite a seleção das células infectadas, tem sua expressão controlada pelo promotor do SV40 (Miller e Rosman, 1989). No sistema de raft utilizado neste estudo, a LTR está fortemente ativa nas células proliferativas da camada basal do epitélio, promovendo inclusive a expressão constitutiva das oncoproteínas E6 e E7 do HPV (Chow e Broker, 1997).