2.8 Forsyningskjeden
2.8.4 Transport
A geração de uma resposta robusta de linfócitos T geralmente requer mais de uma dose de imunização, ou seja, uma dose inicial (prime) e uma ou mais doses de reforço (boost). Quando se utiliza um antígeno carreado pelo
mesmo vetor ou sistema de liberação, tanto no prime quanto no boost, chama- se a esse tipo de imunização de prime-boost homólogo. Essa estratégia funciona muito bem para a indução de respostas imunes humorais, no entanto pode não ser tão eficaz para a geração da imunidade celular, principalmente no caso dos vetores virais. Além de induzirem respostas celulares potentes contra o transgene, os vetores virais são também muito efetivos para induzir respostas imunes, tanto celulares quanto humorais, contra as suas próprias proteínas. Assim, se altos títulos de anticorpos contra o vetor viral forem gerados durante o priming, eles podem neutralizar o vírus e impedi-lo de invadir novas células durante o boost, prejudicando a apresentação dos antígenos. Alguns trabalhos já sugeriram que os linfócitos T de memória, gerados na dose inicial, podem reconhecer e eliminar rapidamente as células apresentadoras de antígenos durante as respostas às doses de reforço, impedindo que os linfócitos T naive sejam recrutados e expandam a resposta [212].
Para evitar este tipo de problema, um protocolo que vem sendo utilizado com bastante sucesso para as imunizações contra infecções causadas por patógenos intracelulares é o chamado prime-boost heterólogo, no qual as doses de prime e de boost são compostas do mesmo antígeno, sendo este carreado por sistemas de liberação ou por vetores diferentes (Fig. 4, retirada de [213]).
Os mecanismos que levam à geração de uma potente resposta de linfócitos T por meio da combinação de vetores ainda não foram completamente elucidados. O aumento da magnitude da resposta pode ser decorrente da transposição de uma regulação natural dos linfócitos T, pois a presença do mesmo epítopo em um contexto antigênico diverso poderia prevenir a rápida eliminação das células apresentadoras de antígenos, o que em outras situações limitaria a expansão da resposta [212]. Além disso, a imunização heteróloga parece subverter a hierarquia de imunodominância estabelecida entre os epítopos, tornando a resposta mais ampla [214]. Por fim, há evidências de que o prime-boost heterólogo melhora a funcionalidade dos linfócitos T, induzindo um número maior de células multifuncionais [214,215].
O sucesso de um protocolo de prime-boost heterólogo depende da ordem em que os vetores são administrados [216,217]. Alguns vetores são efetivos tanto no priming quanto no boosting, outros apresentam maior eficácia em primar células efetoras, enquanto um grupo diferente de vetores parece ser melhor no boosting dessas respostas (revisto em [188]). As razões para tais diferenças estão sendo estudadas, mas não existe ainda uma resposta definitiva. A utilidade de cada vetor parece depender de características
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intrínsecas, como o nível e a duração da expressão do antígeno, outras proteínas expressas pelo vetor, as células que são transfectadas/infectadas e expressam o transgene, e os PRRs que são ativados por cada vetor.
O prime-boost heterólogo foi primeiro utilizado na década de 1990, nas imunizações com os vírus influenza e vaccínia recombinantes expressando um epítopo de células CD8 da proteína CS, para proteger os camundongos da infecção experimental com o Plasmodium yoelii [216,218]. Desde então, diferentes combinações de sistemas de liberação (incluindo imunizações com DNA plasmidial, proteínas e vírus recombinantes) têm sido utilizadas para induzir respostas imunes dos linfócitos T contra patógenos como o HIV [219,220], o Plasmodium [221,222] e a Mycobacterium tuberculosis [223,224], entre outros.
Alguns estudos mostram que uma única imunização com o vírus vaccínia é capaz de induzir respostas de linfócitos T CD8, ainda que estas sejam mais baixas do que aquelas induzidas por outros vírus recombinantes [202,203]. O maior potencial da vacinação com o vírus vaccínia recombinante, no entanto, é o boost das respostas induzidas por outros sistemas de liberação de antígeno, protocolos que já foram testados em diversos modelos [217,225,226,227]. Os motivos pelos quais o vírus vaccínia parece ser tão bom em expandir as células previamente primadas, e pouco efetivo em iniciar respostas imunes, são ainda pouco conhecidos, mas podem incluir: a expressão antigênica em altos níveis, porém de maneira breve (por volta de uma semana) [206]; e a expressão de mais de 200 proteínas próprias, o que gera uma forte resposta de linfócitos T CD8 contra os inúmeros epítopos do vetor [202,228].
Até hoje, os testes nos seres humanos empregando vaccínia ou modified vaccinia ankara (MVA, um vaccínia atenuado) ainda não obtiveram grande sucesso no caso da vacina contra a malária, pois o protocolo DNA/MVA foi capaz de induzir proteção em pessoas que nunca haviam entrado em contato com a doença [229], mas falhou em proteger os habitantes das áreas endêmicas [230]. Mesmo um protocolo de prime-boost envolvendo dois poxvírus, o fowlpox (FPV) e o MVA, falhou em reduzir a incidência da malária nas crianças residentes nas áreas endêmicas [231,232].
Os protocolos utilizando o MVA, expressando o antígeno 85A de Mycobacterium tuberculosis, como reforço para a vacinação com BCG têm se mostrado seguros e capazes de induzir uma boa imunogenicidade nos seres humanos, estimulando principalmente respostas de células T CD4 [233,234]. Ainda assim, são baixas as respostas de células T CD8 geradas por esse protocolo de imunização nos seres humanos [234,235].
No caso da vacina contra o HIV, Harari e colaboradores [236] recentemente descreveram a indução de respostas imunes em mais de 90% dos voluntários imunizados com um protocolo DNA/NYVAC (NYVAC é uma outra cepa do vírus vaccínia atenuado). Pelo menos outros 5 testes clínicos contra o HIV envolvendo poxvírus estão em andamento: um em fase III, com priming com o ALVAC (vírus canarypox) e boosting com a proteína env; outro com um protocolo DNA/FPV; e os outros três com protocolos DNA/MVA, os últimos estando na fase I ou II (revisto em [176]). Até que as informações sobre a eficácia desses testes clínicos sejam divulgadas, a utilidade dos poxvírus nas vacinações de seres humanos permanecerá ignorada.
O adenovírus humano sorotipo 5 é um dos mais estudados devido à sua grande potência para induzir respostas imunes celulares. Este vetor induziu respostas imunes de linfócitos T CD4 e T CD8 de grande magnitude (e muitas vezes protetoras) nas imunizações homólogas ou heterólogas de modelos animais contra diversas doenças infecciosas, como a gripe [237], a malária [217], a hepatite C [238], a dengue [239] e a doença de Chagas [121].
Foi a busca por uma vacina contra o HIV, no entanto, que mais impulsionou a utilização do hAd5. Diversos estudos mostraram a grande potência deste vetor na geração de respostas imunes contra as proteínas do HIV/SIV, principalmente de linfócitos T CD8, nos modelos com macacos rhesus [219,240] e babuínos [241]. Outros estudos não se limitaram a testar a resposta imune, mas também desafiaram os animais com o SHIV [242]. O modelo de infecção pelo SHIV, entretanto, parece não ser tão fiel em predizer os resultados obtidos nos seres humanos quanto o modelo que utiliza o SIV (revisto em [243]). Assim, vários grupos utilizaram o protocolo DNA/hAd5 (carregando diferentes combinações de genes do SIV) para conseguir demonstrar controle parcial da viremia e redução da perda dos linfócitos T CD4 após o desafio com o SIV [244,245,246]. Mais recentemente, Wilson e
colaboradores [247] também descreveram o controle da viremia e uma menor perda dos linfócitos T CD4 em macacos imunizados com esse protocolo, após um desafio com um SIV heterólogo.
Boa parte dos protocolos testados envolveram DNA/hAd5, mas este vetor viral também tem sido utilizado para reforçar as imunizações com proteínas recombinantes (em geral adicionadas de adjuvantes ligantes dos TLRs ou sistemas de liberação), sendo capaz de induzir fortes respostas de células T CD4 e T CD8 nos modelos animais [248,249,250].
Uma séria preocupação com a efetividade das imunizações com o hAd5 é que esta possa ser comprometida pela imunidade prévia ao vetor. De fato, foi demonstrado que tal fenômeno ocorre em alguns modelos [251,252]. Como a prevalência da sorologia positiva para o hAd5 é alta, tanto nos Estados Unidos e Europa quanto na África, (respectivamente 35-40%, 60% e 90%) [253,254], vêm sendo desenvolvidas estratégias para contornar o problema. Alguns grupos sugeriram que a imunização com DNA como prime reduz consideravelmente o efeito da imunidade pré-existente [219,255]. A imunização com DNA induz uma expressão antigênica em baixos níveis, porém prolongada [206], sem que outro antígeno seja expresso concomitantemente. Estes fatores resultam na indução de uma resposta imune discreta, mas que parece ser suficiente para expandir as células CD8 específicas, garantindo a imunodominância de epítopos codificados pelo transgene durante o boost com adenovírus.
Por outro lado, alguns grupos desenvolveram adenovírus 5 recombinantes quiméricos, contendo a proteína hexon ou partes dela, provenientes de outros sorotipos menos prevalentes [256], já que grande parte dos anticorpos neutralizantes é direcionada para essa proteína [257]. Além disto, vêm se estudando sorotipos de adenovírus humanos menos prevalentes, como o Ad35 [252,258], o Ad41 [259], o Ad26 [214,215] e o Ad48 [215]. Outra alternativa é o uso de adenovírus de outras espécies de primatas [180,260,261]. Apesar de tais sistemas serem promissores, reagentes e técnicas precisam ser desenvolvidos e disponibilizados para que possam ser utilizados em grande escala.
A imunização genética com DNA plasmidial, contendo o gene que codifica a proteína 2 da superfície de amastigotas (ASP-2), é capaz de proteger parte dos camundongos altamente suscetíveis A/Sn contra uma infecção letal pelo T. cruzi. Com base neste resultado, o objetivo principal desta tese foi o de melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi, por meio de protocolos de imunização e reforço homólogo ou heterólogo utilizando DNA plasmidial, proteínas recombinantes ou adenovírus recombinante da ASP-2 de T. cruzi.
Após melhorar a eficácia da vacinação, também foi nosso objetivo estudar a importância da participação de alguns tipos celulares (linfócitos T CD4 ou CD8) e da expressão de determinadas moléculas (perforina e IFN-γ) na imunidade protetora. Por último, tivemos como objetivo caracterizar funcional e fenotipicamente os linfócitos T específicos, responsáveis pela imunoproteção após a vacinação experimental.
INFECTION ANDIMMUNITY, Sept. 2005, p. 6017–6025 Vol. 73, No. 9
0019-9567/05/$08.00⫹0 doi:10.1128/IAI.73.9.6017–6025.2005
Copyright © 2005, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
CD8
⫹-T-Cell-Dependent Control of Trypanosoma cruzi Infection in a
Highly Susceptible Mouse Strain after Immunization with
Recombinant Proteins Based on Amastigote Surface
Protein 2
Adriano F. S. Arau´jo,1,2 Bruna C. G. de Alencar,1,2Jose´ Ronnie C. Vasconcelos,1,2 Meire I. Hiyane,1,2 Cla´udio R. F. Marinho,3 Marcus L. O. Penido,4 Silvia B. Boscardin,2 Daniel F. Hoft,5
Ricardo T. Gazzinelli,4 and Mauricio M. Rodrigues1,2*
Centro Interdisciplinar de Terapia Geˆnica (CINTERGEN)1and Departmento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia,2 Universidade Federal de Sa˜o Paulo-Escola Paulista de Medicina, Departamento de Imunologia, ICB, Av. Prof. Lineu
Prestes, 1730, Universidade de Sa˜o Paulo,3Sa˜o Paulo, SP 05508-900, and Departamento de Bioquı´mica e Imunologia, Instituto de Cieˆncias Biolo´gicas, Universidade Federal de Minas Gerais e Centro de Pesquisas
Rene´ Rachou, FIOCRUZ, Avenida Augusto de Lima 1715, Barro Preto, 30190-002, Belo Horizonte, Minas Gerais,4Brazil, and Division of Infectious Diseases & Immunology, Departments
of Internal Medicine & Molecular Microbiology, Saint Louis University Health Sciences Center, 3635 Vista Avenue, FDT-8N,
St. Louis, Missouri 631105
Received 4 April 2005/Returned for modification 6 May 2005/Accepted 11 May 2005
We previously described that DNA vaccination with the gene encoding amastigote surface protein 2 (ASP-2) protects approximately 65% of highly susceptible A/Sn mice against the lethal Trypanosoma cruzi infection. Here, we explored the possibility that bacterial recombinant proteins of ASP-2 could be used to improve the efficacy of vaccinations. Initially, we compared the protective efficacy of vaccination regimens using either a plasmid DNA, a recombinant protein, or both sequentially (DNA priming and protein boosting). Survival after the challenge was not statistically different among the three mouse groups and ranged from 53.5 to 75%. The fact that immunization with a recombinant protein alone induced protective immunity revealed the possibility that this strategy could be pursued for vaccination. We investigated this possibility by using six different recombinant proteins representing distinct portions of ASP-2. The vaccination of mice with glutathione
S-transferase fusion proteins representing amino acids 261 to 500 or 261 to 380 of ASP-2 in the presence of the adjuvants alum and CpG oligodeoxynucleotide 1826 provided remarkable immunity, consistently protecting 100% of the A/Sn mice. Immunity was completely reversed by the in vivo depletion of CD8ⴙT cells, but not CD4ⴙT cells, and was associated with the presence of CD8ⴙT cells specific for an epitope located between amino acids 320 and 327 of ASP-2. We concluded that a relatively simple formulation consisting of a recombinant protein with a selected portion of ASP-2, alum, and CpG oligodeoxynucleotide 1826 might be used to cross-prime strong CD8ⴙ-T-cell-dependent protective immunity against T. cruzi infection.
In spite of the significant reduction in transmission over the past 20 years in countries such as Argentina, Brazil, Chile, and Uruguay, Chagas’ disease (American trypanosomiasis) is still a major problem for many Latin American countries. The dis- ease afflicts more than 15 million individuals, with an annual death toll of approximately 45,000 (reviewed in reference 18). The efficacy of conventional chemotherapy with nifurtimox or benznidazole is low and varies widely according to the infec- tion status (acute or chronic) and the region of endemicity. Because of the low efficacy of treatment, the chronic phase of this infection usually persists for life. Approximately one-third of infected persons progress slowly to the symptomatic forms of the disease, characterized by cardiomyopathy and/or megagastrointestinal syndromes. Asymptomatic, chronically infected persons transmit the disease through blood transfu-
sions and tissue transplantation. The lack of efficient drug treatment increases the importance of the development of new strategies to prevent or reduce the disease.
A number of studies have been published over the past 10 years demonstrating that recombinant proteins or plasmid DNA can elicit protective immunity against experimental
Trypanosoma cruziinfection (2, 3, 4, 5, 7, 8, 12, 16, 20, 21, 23, 24, 28, 31, 32, 33, 34; reviewed in references 17 and 22). Vaccinated mice develop a strong cellular immune response mediated by CD4⫹Th1 and CD8⫹Tc1, thus surviving other-
wise lethal acute infection. In addition to surviving acute in- fection, chronic phase pathologies of vaccinated mice were significantly reduced (4, 8, 28). Although in most studies, pro- phylactic vaccinations were performed, a recent report showed that therapeutic vaccination can also be effective in mice chronically infected with certain T. cruzi strains (4). We con- sider studies on vaccination against experimental Chagas’ dis-
* Corresponding author. Mailing address: CINTERGEN, UNIFESP—
by on October 27, 2009
iai.asm.org
Most experiments related to vaccination against T. cruzi infection have used BALB/c or C57BL/6 mice. Although these mice die when challenged with the infective trypomastigotes of certain parasite strains, they are not as susceptible to infection with T. cruzi as A/Sn mice. In order to study the mechanisms of protective immunity required for vaccination, we have been using A/Sn mice. This mouse strain is highly susceptible to infection with different strains of T. cruzi, and 100% of the animals die after a challenge with relatively small doses of the parasite. Due to its high susceptibility, we believe that this mouse strain provides an interesting model to study the immu- nological mechanisms required to induce a high degree of protective immunity against infection.
Using highly susceptible A/Sn mice, we have recently de- scribed that vaccination with a plasmid expressing amastigote surface protein 2 (ASP-2) generates specific CD4⫹
Th1 and CD8⫹Tc1 immune responses. Most importantly, immuniza-
tion with the asp-2 gene alone promotes the survival of ap- proximately 65% of the A/Sn mice against a lethal Trypano-
soma cruzi infection (28). Protective immunity could be improved if the animals were vaccinated simultaneously with the genes of ASP-2 and trans-sialidase (28).
Based on the optimistic results obtained with the asp-2 gene, we attempted to further improve protective immunity in this mouse model of infection. To this end, the initial goal of the present study was to compare the protective efficacy of vacci- nation regimens using either plasmid DNA, recombinant pro- tein, or both sequentially (DNA priming and protein boosting). Our initial assumption was based on a number of reports showing that a DNA priming/protein boosting strategy could improve the protective efficacy in different vaccination models (14, 19, 26, 27).
During the course of these experiments, we observed that protective immunity was similar following immunization with either a plasmid DNA or a recombinant protein adsorbed to alum or when both types were combined (DNA priming/pro- tein boosting). The fact that immunization with a recombinant protein alone was partially protective was unexpected; how- ever, it revealed the possibility that this strategy could be pur- sued for experimental vaccination. Toward that goal, we used several recombinant proteins representing distinct portions of ASP-2. These proteins confirmed the protective potential of recombinant antigens when used in a relatively simple adjuvant formulation. Also, they identified a region containing highly protective epitopes capable of providing protective immunity to 100% of the vaccinated A/Sn mice.
MATERIALS AND METHODS
Mice and parasites.Female 5- to 8-week-old A/Sn mice were purchased from the University of Sa˜o Paulo. Parasites of the Y strain of T. cruzi were used in this study (25). Bloodstream trypomastigotes were obtained from mice infected 7 days earlier. The concentration of parasites was estimated and adjusted to 1,250 trypomastigotes per ml. Each mouse was inoculated intraperitoneally (i.p.) with 0.2 ml (250 trypomastigotes). Parasite development was monitored by counting the number of bloodstream trypomastigotes in 5 l of fresh blood collected from the tail vein (13).
Plasmid and recombinant proteins based on the sequence of the asp-2 gene.
The plasmid encoding the asp-2 gene, ASP-2 DNA, was created and purified as previously described by Boscardin et al. (2). This plasmid contains the nucleo- tides encoding the mouse immunoglobulin chain signal peptide in frame with
9) were obtained by PCR amplification using Platinum Taq High Fidelity DNA polymerase (Invitrogen). Oligonucleotides containing the EcoRI and BamHI restriction sites, purchased from Invitrogen, were used for amplification. The amplified fragments were treated with the restriction enzymes EcoRI and BamHI and ligated into the pGEX-3X vector (Amershan) treated with these same enzymes. The recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli DH5␣. The recombinant proteins were expressed and purified as described earlier (2). The purity of recombinant protein was determined by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). SDS molecular weight markers (Sigma) were used as protein standards.
Immunization.A/Sn mice were immunized according to protocols described earlier (3, 29). Each mouse received 3 doses of 100 g of plasmid DNA injected intramuscularly at 0, 3, and 5 weeks. Immunization with recombinant His-65kDa consisted of 3 i.p. doses of 25 g of protein adsorbed to alum (Alhydrogel 85 Superfos; Biosector, Vedbaek, Denmark) given at 0, 3, and 5 weeks. Efficient coupling of recombinant His-65kDa to alum was obtained by mixing 2.5 l 2% (wt/vol) Al2O3per g of recombinant protein for 2 h. Our DNA priming/protein
boosting regimen consisted of two doses of 100 g of plasmid DNA injected at 0 and 3 weeks. A third dose was provided 2 weeks later and consisted of an i.p. injection of 25 g of recombinant His-65kDa adsorbed to alum.
Immunization with the recombinant proteins His-65kDa, His-25kDa, glutathi- one S-transferase (GST)-P1-P3, GST-P4-P7, GST-P4-P5, and GST-P6-P7 was performed as described in the legend to Fig. 2. CpG oligodeoxynucleotide (ODN) 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT) was synthesized with a nucle- ase-resistant phosphorothioate backbone (Coley Pharmaceutics, Wellesley, MA).
One week after the last immunizing dose with plasmids and/or recombinant proteins, the blood was collected from the tail and the sera were analyzed for the presence of antibodies to His-65kDa. One week later, mice were challenged with bloodstream trypomastigotes. Results are representative of two or more inde- pendent experiments.
Immunological assays.Anti-His-65kDa antibodies were detected by enzyme- linked immunosorbent assay as described earlier (2). Titers are reported as the reciprocals of the highest serum dilution producing an average optical density at 492 nm greater than 0.1. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT assay) was performed essentially as described earlier (2).
Hemoculture and histopathological analysis.Aliquots of 0.1 ml of blood were collected and cultured at 28°C for 1 month in 5 ml of axenic liver infusion tryptose medium. Parasite growth was monitored microscopically every week.