Mesmo que não evidenciada a ligação de fibronectina a enolase por co- imunoprecipitação, a hipótese levantada no item 3.4.7, de que a enolase recombinante poderia estar bloqueando a fibronectina no tecido gastrointestinal acarretando no bloqueio da adesão observado no item 3.4.4, foi novamente testada. C. albicans possui diferentes receptores putativos para fibronectina (Chaffin, 1998). Se o bloqueio destes receptores expressos na superfície de C. albicans com fibronectina fosse capaz de inibir sua adesão ao tecido gastrointestinal, poderíamos sugerir o possível envolvimento de algum destes receptores no processo de inibição. Da mesma maneira, esperava-se que o bloqueio de C. albicans com plasminogênio inibisse a adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal, uma vez que sua ligação a enolase nativa foi previamente demonstrada por co-imunoprecipitação. Assim, C. albicans foi bloqueada por 2 h a 37ºC com 100, 200 e 500 pM de fibronectina ou plasminogênio. Posteriormente as células bloqueadas foram incubadas com discos de TGI murino e o número de células por disco foi estimado.
A incubação de células com 100, 200 e 500 pM de fibronectina foi capaz de inibir a adesão de C. albicans aos discos de TGI de maneira não significativa em torno de 3,23, 2,72 e 3.45% respectivamente (P >0.05) em relação a incubação das células com 500 pM de BSA (Bovine serum albumin) (controle negativo) (figura 14). A inibição obtida a partir da incubação de células com 100, 200 e 500 pM de plasminogênio embora não significativa (P> 0.05) foi bem maior do que a inibição obtida a partir da incubação das células com fibronectina. O percentual de inibição em relação ao bloqueio com BSA foi de 9,80 e 18,51 e 17,60% respectivamente (P >0.05), sendo que nestes ensaios a inibição parece ter saturado a partir da incubação das células com 200 pM de proteínas, uma vez que não houve aumento da inibição a partir da incubação das células com 500 pM de plasminogênio (figura 14).
Figura 14. Ensaio de Inibição da adesão ao tecido gastrointestinal a partir do bloqueio de
receptores de fibronectina e plasminogênio. A: Nº de células por disco (Estimadas com base no número de UFC) obtidas após incubação dos discos com C. albicans SC5314 previamente incubadas com as concentrações indicadas das proteínas humanas. BSA foi utilizada como controle negativo. Os resultados são expressos como médias de três experimentos independentes realizados em triplicata. As barras representam o erro padrão (SE) das médias. B: Percentual de inibição da adesão decorrente do bloqueio com fibronectina e plasminogênio em relação ao bloqueio com BSA (considerado como 100%).
3.4.9 Inferência filogenética
Com o objetivo inicial de comparar a enolase de C. albicans com a enolase de outros organismos, sequências de aminoácidos da enolase de alguns representantes de eubactérias, fungos e de mamíferos, aqui representados pela α enolase de Mus musculus e H. sapiens foram obtidas no Genbank. Um alinhamento múltiplo foi realizado com as 23 sequências de aminoácidos obtidas, resultando em um alinhamento de 468 posições. De maneira geral, as sequências de aminoácidos das enolases analisadas são bem conservadas (>62% de identidade e >76% de similaridade). Dentre as sequências analisadas, a enolase de C. dubliniensis possui o maior percentual de identidade e similaridade (sequência de aminoácidos) em relação à enolase de C. albicans (97,95% de identidade, 99% de similaridade), seguido pela enolase de C. tropicalis (90,68 de identidade e 95,68% de similaridade).
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4 ! $% ! # 4 ! $% ( ! # - 4 ! $ ! / ! 0 0 0 ! 2( ! ) #Figura 15. Árvore filogenética inferida pelo método Bayesiano a partir das sequências de aminoácidos das enolases. Asteriscos: gênero
*Saccharomyces, **Candida. Os números acima dos nós indicam a probabilidade posterior. Nomes das sequências em azul: bactérias, em
vermelho: fungos, em verde: milho - Zea Mays (utilizada como outgroup), em preto: mamíferos. Os números de acesso das sequências no
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Figura 16. Alinhamento múltiplo e comparação das estruturas secundárias da Enolase de C. albicans (CA) e das enolases-α de M. musculus (MM) e H. sapiens (HS). Os aminoácidos foram coloridos de acordo com o seu envolvimento na formação das estruturas secundárias: alfa-hélice,
folha beta, Espiral e giro, (cores conforme legenda acima). Os números acima do alinhamento indicam a posição dos aminoácidos no alinhamento; números em vermelho indicam as posições cujas estruturas secundárias são menos conservadas entre as três espécies. Aminoácidos sublinhados (Posições 259-265) e as lisinas em vermelho (K) na região C-terminal posição 445, (ausentes em C. albicans) indicam os motivos putativos de ligação ao plasminogênio conforme Gandhi, (2008). O alinhamento múltiplo foi realizado pelo programa Clustal W. A estrutura secundária foi predita pelo método de Garnier-Robson e implementada pelo programa Protean (DNAstar).
3.5 DISCUSSÃO
A enolase, uma abundante enzima citoplasmática, pode ser considerada uma proteína multifuncional, uma vez que desempenha outros papeis além de sua função primordial na via glicolítica (item 3.1.4). Uma variedade de estudos tem demonstrado a presença desta e de outras enzimas da via glicolítica, que carecem de sinais clássicos de transporte, na superfície de diferentes tipos celulares. A localização inesperada dessas enzimas permite sua designação como uma classe especial de proteínas de superfície cujas funções ainda permanecem desconhecidas (Pancholi e Chhatwal, 2003). A enolase de C. albicans também pode ser encontrada na superfície celular, mais especificamente na parede (Eroles, et al., 1997). No entanto, sua exata localização nesta estrutura ainda é discutida, sendo que sua presença em associação a glucanas nas porções mais internas da parede celular já foi relatada (Angiolella, 1996). Sua localização na parede celular nas fases de levedura e hifa de C. albicans também foi confirmada por nosso grupo, a partir de experimentos de microscopia confocal e citometria de fluxo (Padovan, 2008). Embora a função da enolase da superfície como um possível receptor de plasminogênio tenha sido demonstrada (Pancholi, 2001), pouco se conhece sobre os possíveis papeis que esta proteína desempenha na superfície celular de C. albicans e de outros organismos. Como comensal e patógeno, C. albicans evoluiu para persistir na superfície da mucosa do hospedeiro normal e invadi-lo em situações de imunodeficiência. Sua presença no hospedeiro é mediada por moléculas presentes em sua parede celular. Desta maneira é apropriado supor que uma das possíveis funções da enolase na superfície seria mediar à adesão de C. albicans a mucosa do hospedeiro. A interação entre este organismo e o hospedeiro pode ser avaliada por diferentes metodologias in vitro. Dentre os diferentes métodos disponíveis, optamos por empregar aquele que avalia a adesão de C. albicans a discos de tecido gastrointestinal (TGI) murino (intestino delgado) in vitro (Segal e Savage, 1986), por acreditar que estes mimetizam de maneira mais real a complexidade da mucosa colonizada por C. albicans e mantém algumas propriedades que são eliminadas quando da utilização de monoculturas de células. Além do mais, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos na adesão de C. albicans a mucosa gastrointestinal. Inicialmente, os ensaios de adesão foram realizados com duas linhagens diferentes de C. albicans, para avaliar se as mesmas
diferem quanto as suas capacidades de adesão a discos de TGI murino. A linhagem L757 é considerada possivelmente menos patogênica do que a linhagem SC5314 em decorrência de sua menor capacidade de formar hifas e produzir biofilme (Padovan et al, 2009). Entretanto essas duas linhagens parecem não diferir quanto as suas habilidades de adesão in vitro, uma vez que o número de células por disco de TGI obtidas após a incubação com essas linhagens não diferiu significativamente (Figura 3). Segal e Savage (1986) também não constataram diferenças na capacidade de adesão a discos de TGI entre as distintas linhagens 4918, 4918-10 (resistente a cerulenina – inibidor da síntese de lipídeos) e CBS562 de C. albicans. Da mesma forma, não foram observadas diferenças entre a capacidade de adesão de C. albicans a partir da utilização de intestino provenientes de camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e DBA (Segal e Savage, 1986). Desta maneira, decidimos utilizar a linhagem SC5314 que teve o seu genoma seqüenciado (Jones, et al., 2004) e camundongos isogênicos Balb/c em todos os ensaios de adesão posteriores.
A adesão de C. albicans aos discos de TGI não parece ser mediada pela hifa, uma vez que não foi constatada sua presença a partir da análise microscópica de diferentes alíquotas coletadas após a incubação das células (linhagens SC5314 e L757) com os discos (Dados não mostrados).
A inibição da adesão de C. albicans a superfícies do hospedeiro é uma das atividades mais bem documentadas mediadas por anticorpos, e diferentes graus de inibição a partir da utilização de diferentes anticorpos contra diferentes antígenos da parede celular de C. albicans já foram descritos (Bavoil, et al., 2008; Bendel, 1993; Cotter, et al., 1998). Assim, a capacidade da enolase em mediar à adesão a discos de TGI foi avaliada. O bloqueio da enolase da superfície de C. albicans na fase de levedura com anti-His6enolase purificado por imunoafinidade foi capaz de inibir
consideravelmente sua adesão a discos de TGI murino, sendo que a inibição da adesão foi saturada a partir da utilização de 20 µg de anti-His6enolase (figura 4), o
que corrobora o fato de que múltiplas adesinas da superfície celular de C. albicans medeiam à adesão ao hospedeiro. A hipótese de que a enolase presente na superfície celular poderia estar envolvida na adesão a células do hospedeiro também foi levantada por outros grupos. O bloqueio da enolase da parede celular de P. brasiliensis com anticorpos específicos foi capaz de inibir significativamente sua
adesão a células epiteliais pulmonares (Donofrio, 2009), ainda, anticorpos contra a enolase da superfície de Streptococcus Suis foram capazes de inibir sua adesão a células endoteliais (Esgleas, 2008). Já foi previamente reportado que alguns anticorpos podem exercer atividades anti-C. albicans in vitro (morte direta do fungo após contato com o anticorpo) (Moragues, et al., 2003; Polonelli, 1997). Para garantir que a inibição da adesão observada era decorrente do bloqueio da enolase e não da morte do fungo ocasionada pelo possível reconhecimento inespecífico de algum epitopo pelo anti-soro policlonal, células foram incubadas com o anticorpo anti- His6enolase. Não foram observadas diferenças no número de células obtidas neste
ensaio em relação ao número de células obtidas após a incubação das células com PBS ou anticorpos irrelevantes (figura 5). Estes dados mostram que a enolase da superfície de C. albicans medeia a adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal de camundongos in vitro.
A participação de adesinas putativas na adesão de microorganismos ao hospedeiro também pode ser avaliada a partir do bloqueio dos ligantes do hospedeiro com adesinas purificadas ou com lisados celulares (Calderone e Gow, 2002). A incubação de discos de TGI murino com quitina (açúcar componente da parede celular) comercial ou obtida de extratos de C. albicans, por Segal e Savage (1986) foi capaz de inibir significativamente a adesão de C. albicans ao tecido. (Segal e Savage, 1986). Desta maneira, passamos a nos questionar se o bloqueio de possíveis ligantes da enolase no tecido intestinal também seria capaz de inibir a adesão de C. albicans. Para este fim uma grande quantidade de His6-enolase foi
expressa em E. coli e purificada. Surpreendentemente, a incubação dos discos de TGI murino com a proteína recombinante foi capaz de inibir a adesão de C. albicans de maneira dose dependente, em aproximadamente 70% (figura 6). Experimentos realizados a partir da incubação de C. albicans com diferentes proteínas recombinantes expressas em E. coli e purificadas sob as mesmas condições indicam que os resultados obtidos não são decorrentes da morte do fungo ocasionada por possíveis contaminantes presentes na proteína His6-enolase (figura 7). Estes dados
indicam que receptores presentes no tecido gastrointestinal, importantes para a adesão de C. albicans, foram bloqueados pela enolase recombinante, inibindo sua adesão, confirmando os dados obtidos com a inibição da enolase de superfície a partir do bloqueio com anticorpos (figura 4). Assim, é possível sugerir que a enolase
de C. albicans, secretada para a superfície por mecanismos ainda desconhecidos, esteja envolvida na adesão, possivelmente contribuindo para a persistência de C. albicans no tecido gastrointestinal. A capacidade da enolase de C. albicans em mediar à adesão a superfície do hospedeiro poderia também explicar alguns resultados obtidos por nosso grupo. Previamente, a enolase foi identificada, por espectrometria de massa, como sendo uma das proteínas majoritárias da matriz do biofilme de C. albicans (Padovan, 2008). Porém, o papel que esta proteína estaria desempenhando na matriz do biofilme ainda permanece desconhecido. Uma vez que a etapa de adesão a superfície é importante para a formação do biofilme (Kumamoto e Vinces, 2005), podemos supor que a enolase esteja presente no biofilme como um dos componentes capazes de promover sua adesão ao substrato. Contudo, novos experimentos para avaliar a capacidade de adesão da enolase a outras superfícies são necessários para testar esta hipótese.
Como previamente relatado (item 3.1.4 da introdução), a enolase de diferentes células e microorganismos é capaz de se ligar ao plasminogênio, desempenhando um possível papel de receptor. Postula-se que o plasminogênio presente na superfície de células eucarióticas e de microorganismos seja ativado em plasmina. A ativação do plasminogênio em células eucarióticas pode estar envolvida no recrutamento de monócitos para sítios de inflamação e na invasão de tecidos por células cancerosas. Além disso, a concentração da enolase da superfície de monócitos é aumentada quando as células são estimuladas com LPS (recrutamento para o sítio de inflamação), provavelmente para favorecer sua ligação ao plasminogênio e conseqüente direcionamento para o local da inflamação (Wygrecka, 2009). Não sabemos se a concentração da enolase nas superfícies de C. albicans ou outros microorganismos é aumentada em decorrência de modificações ambientais, principalmente no contato com células e moléculas do hospedeiro. Em microorganismos a ativação do plasminogênio pode favorecer a invasão dos tecidos do hospedeiro (Liu e Shih, 2007; Plow e Das, 2009; Plow, et al., 1995). Sabe-se que C. albicans é capaz de se ligar ao plasminogênio, sendo que esta habilidade foi aqui confirmada a partir de experimentos de western blot (figura 9). Inicialmente, Crowe et al (2003) não foram capazes de identificar a enolase de C. albicans em experimentos de proteômica e ensaios de ligação ao plasminogênio por western blot. (Crowe, 2003). Porém a enolase recombinante (His6-enolase) de C. albicans
expressa em E. coli por Jong et al (2003), foi capaz de se ligar ao plasminogênio de maneira lisina dependente (característica de receptores de plasminogênio) em experimentos utilizando colunas de afinidade. Resultados obtidos por este mesmo grupo indicam que a ligação de plasminogênio a enolase da superfície de C. albicans esteja envolvida na invasão de células endoteliais cerebrais (Jong, 2003). Os dados aqui obtidos a partir da co-imunoprecipitação da enolase de um lisado celular de C. albicans previamente incubado com plasminogênio humano corroboram os dados de Jong et al (2003) (figura 10) e sugerem que a enolase da superfície de C. albicans seja realmente um possível receptor de plasminogênio. Não fomos capazes de confirmar a co-imunoprecipitação do plasminogênio com a proteína recombinante (His6-enolase) por problemas de ligações inespecíficas de
plasminogênio as beads (Dados não mostrados). No entanto, existe a possibilidade de que a enolase recombinante expressa em E. coli por nosso grupo possua atividade enzimática, uma vez que a atividade enzimática da enolase recombinante expressa em E. coli foi demonstrada pelo grupo de Jong et al (2003). A enolase de Streptococcus pyogenes mantém sua atividade enzimática quando é secretada para a superfície da célula (Pancholi e Fischeti, 1998), porém não sabemos se o mesmo ocorre com a enolase secretada para a parede de C. albicans. Assim, estudos posteriores deverão ser feitos para responder a estas perguntas. O fato de também não termos obtido sucesso em ensaios de ligação por western blot com plasminogênio e enolase (Dados não mostrados) pode explicar a ausência da identificação da enolase nos experimentos realizados por Crowe et al (2003).
O plasminogênio é encontrado em abundância no plasma e em fluidos extracelulares (Malke, 1994), e, portanto não esperaríamos que o mesmo estivesse mediando à adesão a partir da ligação com a enolase da superfície. Assim, resolvemos aproveitar a capacidade de interação entre enolase e plasminogênio para melhor estabelecer a participação da enolase na inibição da adesão de C. albicans a discos de TGI murino observada em nossos experimentos (figuras 4 e 6). A incubação de C. albicans com diferentes concentrações de plasminogênio humano inibiu a adesão de C. albicans a discos de TGI em torno de ~18 %, sendo que a inibição foi saturada a partir da incubação com 200 pM de plasminogênio (figura 12). Como não existem estudos que quantificam a afinidade de ligação entre a enolase de C. albicans e o plasminogênio, não podemos afirmar que o percentual de inibição
observado, mesmo que estatisticamente não significativo (P> 0.05) foi baixo. Estes resultados podem ainda ter sido decorrentes das condições experimentais aqui estabelecidas (tempo e temperatura de incubação e condições de crescimento de C. albicans dentre outros). Portanto estes dados reforçam a idéia de que a enolase esteja realmente mediando à adesão aos discos de tecido GI in vitro. Como C. albicans possui diferentes receptores putativos para plasminogênio, não podemos também descartar a idéia de que a inibição observada nestes ensaios não seja decorrente do bloqueio de outros receptores pelo plasminogênio.
Assim, passamos a focar na detecção de possíveis ligante(s) da enolase de C. albicans presentes no disco de TGI murino. A matriz extracelular (MEC) é uma estrutura macromolecular estável encontrada na membrana basal e interstício de células epiteliais e endoteliais (Westerlund e Korhonen, 1993). Mais especificamente, a fibronectina é encontrada no interstício e na membrana basal de células epiteliais (Liakka e Autioharmainen, 1992; Stenman, 1978). Alguns estudos também demonstram a expressão de fibronectina na superfície de células epiteliais (Kalo, et al., 1988; Skerl, et al., 1984). Muitas das proteínas que constituem a MEC podem potencialmente servir como receptores de superfície para microorganismos. As enolases do fungo P. brasiliensis (Donofrio, 2009) e das bactérias S. suis (Esgleas, 2008) e Lactobacillus plantarum (Castaldo, 2009) são capazes de se ligar a fibronectina in vitro. Embora não existam relatos na literatura que demonstrem a capacidade de associação de C. albicans ao intestino a partir de interações com constituintes da MEC, levantamos a hipótese de que a enolase de C. albicans poderia ter se associado à fibronectina presente na MEC do tecido, expressa por alguma célula epitelial (Kalo, et al., 1988; Skerl, et al., 1984) ou ainda expostas a partir da preparação dos discos, e desta maneira inibido a adesão ao TGI. Sabe-se que C. albicans é capaz de se ligar a vários domínios da molécula de fibronectina (Skerl, et al., 1984), incluindo o domínio RGD (arginina-glicina-ácido aspártico) que pode ser reconhecido por vários receptores da superfície celular da família das integrinas (Fujita, 1995). O número exato de receptores de fibronectina em C. albicans ainda é discutido, no entanto algumas estimativas apontam que a ligação de fibronectina a C. albicans seja saturada a partir de 8.000 sítios por célula (Klotz e Smith, 1991), outros estudos apontam para aproximadamente 5.000 sítios de ligação de alta afinidade e aproximadamente 30.000 sítios de baixa afinidade por célula
(Negre, 1994). A partir de ensaios de western blot, confirmamos a ligação da linhagem SC5314 a fibronectina humana (figura 9). Para avaliar a capacidade de associação da enolase de C. albicans a fibronectina humana in vitro, o anticorpo anti-His6enolase foi utilizado para co-imunoprecipitar a fibronectina previamente
incubada com um lisado celular de C. albicans. Em contraste aos resultados obtidos com o plasminogênio humano (figura 10), a fibronectina não foi co-imunoprecipitada com a enolase (figura 11). A fibronectina também não foi capaz de se ligar a enolase (nem vice e versa) em experimentos de ligação por western blot (Dados não mostrados). Estes resultados podem ter sido decorrentes da incapacidade de ligação da enolase a fibronectina in vitro nas condições experimentais estabelecidas (tempo e temperatura de incubação, buffer de lise, anticorpos dentre outros) e não indicam que a enolase não esteja se associando com a fibronectina presente no intestino. Desta maneira, se a fibronectina estivesse de alguma forma envolvida na inibição da adesão a discos de TGI, esperaríamos que o bloqueio de seus receptores na superfície de C. albicans tivesse algum efeito na inibição da adesão. Contudo, após a incubação de C. albicans com diferentes concentrações de fibronectina humana, foi constatado um percentual de inibição não significativo em torno de 3% em todas as concentrações de fibronectina utilizadas (figura 12). Estes resultados podem ser explicados de três maneiras: 1- A quantidade de fibronectina utilizada não foi suficiente para bloquear os receptores de C. albicans. 2- A fibronectina pode ter se ligado com pouca afinidade a C. albicans sob as condições experimentais aqui estabelecidas. 3- Receptores de ligação a fibronectina podem não estar envolvidos na inibição da adesão, sendo que a pequena inibição observada, embora não significativa, pode ter sido decorrente da ligação inespecífica da fibronectina a algum receptor necessário para a adesão ao intestino. Uma vez que não foi constatado aumento da adesão a partir da utilização de concentrações mais altas da proteína (500 pM), acreditamos que de fato a fibronectina não esteja envolvida na inibição da adesão de C. albicans ao intestino. Estes dados são corroborados pela não ligação da enolase a fibronectina in vitro (figura 11). Pode ser que a capacidade de ligação a fibronectina seja característica específica da enolase de alguns organismos e não da enolase de C. albicans, entretanto, novos estudos são necessários para confirmar estas possibilidades. O crescimento de C. albicans em meio contendo hemoglobina é capaz de ativar a capacidade de ligação a fibronectina por C. albicans (Yan, et al.,
1998). Todos os nossos ensaios de adesão foram realizados sob condições de crescimento padrão, mesmo assim, a realização de experimentos sob tais condições poderia trazer novas informações a cerca destas questões.